天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響*

時(shí)曉遲，柳　威，王　娟，趙英強(qiáng)

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，天津　300150）

·實(shí)驗(yàn)研究·

天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響*

時(shí)曉遲，柳威，王娟，趙英強(qiáng)

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，天津300150）

［目的］探討天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的降壓機(jī)制及對(duì)心肌組織B細(xì)胞淋巴瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)的影響。［方法］20只14周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）隨機(jī)分為空白組6只、中藥組7只、西藥組7只。中藥組灌服天麻鉤藤飲20 mL/（kg·d），相當(dāng)生藥20g/（kg·d）。西藥組灌服雷米普利1 mg/（kg·d）?？瞻捉M灌服同體積的純凈水。連續(xù)灌胃4周。分別于給藥0、1、2、3、4周測(cè)量血壓和心率。給藥4周后，腹主動(dòng)脈取血處死，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定血清血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）含量，用Western blot方法檢測(cè)心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)。［結(jié)果］1）從給藥3周后開(kāi)始，與空白組比較，天麻鉤藤飲能明顯降低收縮壓（P＜0.05，P＜0.01）。天麻鉤藤飲降壓效果雖沒(méi)有西藥明顯，但整體上能控制收縮壓的升高，并有逐漸降低的趨勢(shì)。2）天麻鉤藤飲和西藥雷米普利對(duì)心率的變化均沒(méi)有明顯影響。3）與空白組比較，天麻鉤藤飲和西藥均能明顯降低血清的AngⅡ和ALD含量（P＜0.01）。4）與空白組比較，天麻鉤藤飲和西藥均能明顯降低心肌組織的Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)（P＜0.01）。［結(jié)論］天麻鉤藤飲能有效控制SHR大鼠收縮壓的升高。天麻鉤藤飲的降壓機(jī)制可能與降低AngⅡ和ALD含量有關(guān)，并且還可能通過(guò)減少Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)來(lái)抑制心肌細(xì)胞的凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)功能。

天麻鉤藤飲；降壓；AngⅡ；ALD；Bax；Caspase-3

高血壓已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。根據(jù)最新發(fā)布的《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2015）》顯示，2012年中國(guó)18歲及以上居民高血壓患病率為25.2%，男性高于女性，城市高于農(nóng)村，估計(jì)目前中國(guó)成人高血壓患者約為2.6億。與2002年相比，高血壓患病率明顯上升，農(nóng)村地區(qū)增長(zhǎng)尤為顯著。目前國(guó)內(nèi)高血壓存在高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、低知曉率、低治療率、低控制率的特征。高血壓帶來(lái)的嚴(yán)重后果就是心肌細(xì)胞肥大直至凋亡，最終導(dǎo)致心血管疾病終末期心衰的發(fā)生。因此，預(yù)防和控制高血壓具有重要的意義。臨床實(shí)踐證實(shí)，天麻鉤藤飲治療高血壓具有很好的療效。而天麻鉤藤飲對(duì)高血壓所致的心肌細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用還不明確。本研究就天麻鉤藤飲對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟B細(xì)胞淋巴瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）及半胱氨酸天冬氨酶特異性蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行考察。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001］。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫（22±2）℃，自然晝夜，自由取食及飲水。

1.1.2藥物天麻鉤藤飲由天麻10 g，鉤藤15 g（后下）、石決明20 g（先煎），山梔子6 g，黃芩6 g，川牛膝12 g，杜仲12 g，益母草12 g，桑寄生12 g，夜交藤12 g，茯苓12 g等組成。上述所有中藥均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供。天麻鉤藤飲水提濃縮，相當(dāng)于每毫升含生藥1 g。雷米普利片購(gòu)自賽諾菲安萬(wàn)特（北京）制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20060766，產(chǎn)品批號(hào)3JC001，規(guī)格5mg/片，7片/盒。

1.1.3主要儀器及試劑無(wú)創(chuàng)鼠尾壓測(cè)量?jī)x（BP98AWU，日本軟?。Ｑ芫o張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。Bax、Caspase-3、β-actin抗體均購(gòu)自Abcam公司，二抗購(gòu)自中杉金橋公司。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273941/H2902）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（9JCZDJC20600）。

作者簡(jiǎn)介：時(shí)曉遲（1969-），女，碩士，副主任醫(yī)師，從事心血管疾病臨床及基礎(chǔ)研究。

通訊作者：趙英強(qiáng)，E-mail：zhaoyingqiang1000@126.com。

表1　各組大鼠收縮壓變化（±s）Tab.1　Comparison of average systolic blood pressure in rats in each group（±s）mmHg

表1　各組大鼠收縮壓變化（±s）Tab.1　Comparison of average systolic blood pressure in rats in each group（±s）mmHg

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與西藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)　0周　1周　2周　3周　4周空白組　6　185.12±11.48　187.79±15.14　185.45±9.17　191.95±15.25　197.58±9.30中藥組　7　178.17±11.54　183.28±16.12　178.60±5.83#　174.17±9.77*##　174.07±7.55**##西藥組　7　178.53±6.35　175.32±18.81　155.67±15.52**　152.32±15.55**　156.28±9.67**

表2　各組大鼠心率變化（±s）Tab.2　Comparison of average heart rate in rats in each group（±s）　次/分

表2　各組大鼠心率變化（±s）Tab.2　Comparison of average heart rate in rats in each group（±s）　次/分

組別　動(dòng)物數(shù)　0周　1周　2周　3周　4周空白組　6　453.12±44.83　372.83±76.23　373.66±40.12　435.75±22.34　421.02±36.52中藥組　7　442.17±39.32　401.92±32.50　393.64±45.90　426.28±32.88　423.21±46.56西藥組　7　452.67±31.17　419.82±49.45　421.35±44.01　420.46±18.36　439.25±22.52

1.2方法

1.2.1分組與給藥20只12周齡SHR適應(yīng)性飼喂2周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組6只、中藥組7只、西藥組7只。中藥組灌服天麻鉤藤飲20 mL/（kg·d），相當(dāng)生藥20 g/（kg·d）。西藥組灌服雷米普利1 mg/（kg·d）?？瞻捉M灌服同體積的純凈水。連續(xù)灌胃4周。

1.2.2血壓、心率測(cè)量采用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)測(cè)量法。在干燥、通風(fēng)、安靜的環(huán)境中將大鼠置于37℃恒溫袋內(nèi)預(yù)熱10 min，使大鼠尾動(dòng)脈充分?jǐn)U張，將傳感器套在鼠尾根部，待大鼠短暫躁動(dòng)停止后，連續(xù)測(cè)定3次取平均值。分別于給藥0、1、2、3、4周測(cè)量血壓和心率。

1.2.3血清AngⅡ、ALD含量測(cè)定取大鼠腹主動(dòng)脈血，加入離心管中，37℃水浴鍋充分凝血，4℃、3 000 r/min離心5 min，取血清，參照ALD和AngⅡ測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定。

1.2.4Bax、Caspase-3蛋白檢測(cè)大鼠腹主動(dòng)脈取血處死后，剪取心臟組織，沖洗凈，取心尖部位心肌組織約30 mg，超聲破碎勻漿，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入十二烷基硫酸鈉（SDS），沸水中變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，孵育一抗，4℃過(guò)夜，充分洗凈，孵育二抗，室溫2 h，洗凈后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，膠片顯影、定影，將膠片進(jìn)行掃描，用Image-J軟件計(jì)算目標(biāo)帶的灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠收縮壓的變化情況0周時(shí)，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明分組合理，基線平穩(wěn)，具有可比性。2周后，與空白組比較，西藥組收縮壓明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白組比較，中藥組雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從給藥3周后開(kāi)始，與空白組比較，中藥組收縮壓明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組比較，西藥組均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。從給藥2周后開(kāi)始，西藥組收縮壓降低更明顯，與中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠心率的變化情況給藥前后，各組大鼠的心率變化不明顯，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3血清AngⅡ和ALD含量變化情況給藥4周后，檢測(cè)血清AngⅡ和ALD含量。與空白組比較，給藥組血清的AngⅡ和ALD含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中西藥組血清的AngⅡ降低更顯著，與中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3　AngⅡ和ALD含量的比較（±s）Tab.3　Comparison of AngⅡand ALD contents（±s）

表3　AngⅡ和ALD含量的比較（±s）Tab.3　Comparison of AngⅡand ALD contents（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與西藥組比較，##P＜0.01。

組別　動(dòng)物數(shù)　AngⅡ（ng/L）　ALD（pg/mL）空白組　6　2156.17±39.95　218.12±14.89中藥組　7　1678.57±50.44**##　143.24±12.56**西藥組　7　1534.25±40.78**　140.79±10.22**

2.4心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)變化情況給藥4周后，檢測(cè)心肌組織Bax、Caspase-3蛋白含量。與空白組比較，給藥組心肌組織的Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中西藥組心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)減少更顯著，與中藥組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1　心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)變化Fig.1　Comparison of Bax，Caspase-3 protein expression in myocardial tissue

3　討論

高血壓已經(jīng)成為危害人類健康的主要疾病，心臟是高血壓的靶器官之一。高血壓導(dǎo)致心臟后負(fù)荷過(guò)重，長(zhǎng)期的后負(fù)荷過(guò)重會(huì)引起心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，終至失代償，心臟排血量下降，發(fā)生心力衰竭。研究表明，心肌細(xì)胞凋亡在高血壓心肌肥厚和心力衰竭發(fā)病中發(fā)揮重要作用［1］。在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bax、Caspase蛋白發(fā)揮重要作用［2-4］。Caspase家族在激活的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，是多種凋亡途徑的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的最后路徑。由于Caspase能夠自我活化，所以一旦激活就會(huì)觸發(fā)凋亡過(guò)程，呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。其中Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，能被上游的始動(dòng)子激活，然后作用于底物使細(xì)胞發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5-6］。Bax是促進(jìn)由Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要蛋白，它屬于Bcl-2家族。Bax可與Bcl-XL相互作用，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加快細(xì)胞凋亡［7-8］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）內(nèi)部存在一種蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是調(diào)節(jié)血壓的一個(gè)重要系統(tǒng)。AngⅡ有強(qiáng)烈的收縮血管作用，而且可通過(guò)刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶，促使ALD分泌，潴留水鈉，刺激交感神經(jīng)活性，使血壓升高。目前主要的降壓藥物研究也多圍繞此系統(tǒng)開(kāi)展［9-10］。一些研究表明，AngⅡ、ALD除了參與血壓調(diào)節(jié)外，也參與了心肌細(xì)胞的凋亡［11］。

天麻鉤藤飲出自近代胡光慈所著《雜病證治新義》，由天麻、鉤藤、生決明、山梔、黃芩、牛膝、桑寄生、杜仲、夜交藤、茯神組成。臨床實(shí)踐及基礎(chǔ)研究證實(shí)天麻鉤藤飲具有明顯的降壓效果［12-15］，并且還能有效改善高血壓患者的生活質(zhì)量［16-19］。

本研究證實(shí)，從給藥3周后開(kāi)始，與空白組比較，天麻鉤藤飲能明顯降低收縮壓，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。天麻鉤藤飲降壓效果雖沒(méi)有西藥明顯，但整體上能控制收縮壓的升高，并有逐漸降低的趨勢(shì)。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，天麻鉤藤飲有可能會(huì)進(jìn)一步降低收縮壓。本研究發(fā)現(xiàn)天麻鉤藤飲和西藥雷米普利對(duì)心率的變化均沒(méi)有明顯影響。本研究進(jìn)一步對(duì)降壓機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)天麻鉤藤飲和西藥均能明顯降低血清的AngⅡ和ALD含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由于高血壓能引起心肌細(xì)胞肥厚直至凋亡，因此本研究就心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白Bax、Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，天麻鉤藤飲和西藥均能明顯降低心肌組織的Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

綜上所述，天麻鉤藤飲能有效控制SHR收縮壓的升高，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，降壓效果可能會(huì)更明顯。天麻鉤藤飲降壓機(jī)制可能與降低AngⅡ和ALD含量有關(guān)，并且還可能通過(guò)減少Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)來(lái)抑制心肌細(xì)胞的凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)功能。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Effect of the Tianma Gouteng Yin regulating the protein expression of Bax and Caspase-3 of myocardial tissue in spontaneously hypertensive rats

SHI Xiao-chi，LIU Wei，WANG Juan，ZHAO Ying-qiang
（Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China）

［Objective］To investigate the mechanism of Tianma Gouteng Yin（TMGTY）reducing blood pressure and the protein expression of Bax and Caspase-3 in myocardial tissue in spontaneously hypertensive rats.［Methods］Twenty 14-week-old SHR rats were randomly assigned to control group（n=6），TCM group（n=7）and Western medicine group（n=7）.The rats in TCM group were given TMGTY with the dose of 20 g/（kg·d）；those in the western medicine group were given ramipril［1 mg/（kg·d）］；those in control group were given the same volume of pure water.Blood pressure and heart rate were measured weekly.After 4 weeks，abdominal aortic blood and sacrifice animals.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to analyze the content of AngⅡand ALD in serum.Western blot was used to analyze quantitatively Bax and Caspase-3.［Results］1）Starting from the third week after the administration，compared with the control group，TMGTY significantly reduced systolic blood pressure（P＜0.05，P＜0.01）.Although not significant antihypertensive effect，TMGTY controlled the overall increase in systolic blood pressure，and systolic blood pressure gradually decreased.2）TMGTY and ramipril had no significant effect on heart rate.3）Compared with the control group，TMGTY and ramipril significantly reduced the content of AngⅡand ALD in serum（P＜0.01）.4）Compared with the control group，TMGTY and ramipril significantly reduced the protein expression of Bax and Caspase-3 in myocardial tissue（P＜0.01）.［Conclusion］TMGTY could effectively control the increase in systolic blood pressure in SHR.The antihypertensive mechanism of TMGTY may be reducing ALD and AngⅡ.Further，by reducing the protein expression of Bax and Caspase-3，TMGTY possibly inhibited the apoptosis of cardiomyocytes，and achieved protection to cardiomyocytes. Key words：Tianma Gouteng Yin；reducing blood pressure；AngⅡ；ALD；Bax；Caspase-3

R541.3

A

1672-1519（2016）06-0354-04

2016-02-28）