人離體乳腺癌腫瘤新生血管的同步輻射成像實(shí)驗(yàn)研究

李瑞敏，張 汐，王升平，彭衛(wèi)軍，吳 炅

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射診斷科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

人離體乳腺癌腫瘤新生血管的同步輻射成像實(shí)驗(yàn)研究

李瑞敏1，張 汐1，王升平1，彭衛(wèi)軍1，吳 炅2

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射診斷科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

目的：探討同步輻射類(lèi)同軸相襯成像在人乳腺癌離體標(biāo)本中的應(yīng)用。方法：12例乳腺癌標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定后，在上海同步輻射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）X線(xiàn)成像與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用光束線(xiàn)站（BL13W）上進(jìn)行同步輻射類(lèi)同軸相位襯度二維及三維成像，最后行病理學(xué)及免疫組化檢查，將所得影像學(xué)資料與病理學(xué)資料進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果：物像距為100 cm、能量為13 keV時(shí)，圖像具有較高的空間分辨率和襯度分辨率。類(lèi)同軸相位襯度二維及三維成像均可在無(wú)對(duì)比劑條件下清晰顯示腫瘤新生血管，最小腫瘤血管直徑約9 μm。結(jié)論：同步輻射類(lèi)同軸相位襯度成像可檢測(cè)人乳腺癌標(biāo)本中的腫瘤新生血管，清晰觀察腫瘤血管的形態(tài)特征和空間分布，為研究腫瘤新生血管的形成機(jī)制及各種干預(yù)或治療措施對(duì)腫瘤血管的影響提供了檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方法，具有很高的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

乳腺癌；血管生成；同步輻射類(lèi)同軸相位襯度成像

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而腫瘤新生血管的生成、生長(zhǎng)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的必要條件［1］。早期檢測(cè)并全程監(jiān)測(cè)腫瘤新生血管的變化對(duì)乳腺癌的檢出與治療有重要意義。但目前傳統(tǒng)影像學(xué)技術(shù)在顯示腫瘤新生血管方面還存在一定的局限性，尚不能顯示直徑＜200 μm的細(xì)小血管［2］，而腫瘤新生血管的直徑約為10 μm，因此迄需一種新型成像技術(shù)，用以觀察和分析腫瘤新生血管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布特征。

同步輻射相襯成像是基于入射光在不同密度組織中的相位變化差異，其對(duì)軟組織的分辨率較傳統(tǒng)X線(xiàn)吸收成像提高1 000倍，可清晰顯示軟組織之間（如血管、韌帶等）的細(xì)微差異。同步輻射相襯成像主要包括類(lèi)同軸相襯成像、衍射增強(qiáng)成像、干涉法成像和光柵相位成像4種。其中，類(lèi)同軸相襯成像具有成像原理簡(jiǎn)單、軟組織分辨率高、圖像與傳統(tǒng)圖像相似、易于理解和判讀等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在利用同步輻射類(lèi)同軸相襯技術(shù)對(duì)人乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行成像，觀察乳腺癌腫瘤新生血管的形態(tài)和分布。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本選取

選取2011年9月—2014年9月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科切除的標(biāo)本12份，均經(jīng)患者知情同意并滿(mǎn)足臨床病理診斷后取得，單個(gè)標(biāo)本大小約10 mm×5 mm×3 mm，標(biāo)本切取后即刻放入4%甲醛溶液進(jìn)行固定并準(zhǔn)備成像。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 同步輻射成像

標(biāo)本在第3代上海同步輻射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF） X線(xiàn)成像與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用光束線(xiàn)站 （BL13W）上進(jìn)行。其光子能量范圍為8～72.5 keV，同步輻射光線(xiàn)照射單色晶體，被單色化后。與樣品作用，在各組織面發(fā)生菲涅耳衍射，出射光線(xiàn)攜帶的樣品相位信息被探測(cè)器接收后，通過(guò)調(diào)節(jié)探測(cè)器與樣品臺(tái)的距離及射線(xiàn)能量獲得清晰的相位襯度圖像。本研究選用高分辨率CCD探測(cè)器，像素9 μm×9 μm。物像距分別選取5 cm、20 cm、60 cm、100 cm、120 cm，單色光能量分別設(shè)置為8 keV、10 keV、13 keV、16 keV、19 keV，對(duì)比不同參數(shù)情況下獲得的圖像清晰度和分辨率，最后選擇最佳成像參數(shù)。曝光時(shí)間根據(jù)樣品厚度和密度而自動(dòng)調(diào)節(jié)。CT掃描時(shí)，樣本在轉(zhuǎn)臺(tái)上以0.25°/s的速度旋轉(zhuǎn)180°，總投影數(shù)為1 200幀。

1.3 圖像重建與圖像后處理

攝片結(jié)束后對(duì)圖像進(jìn)行減影處理，先將投影圖像減去相同成像條件的背景圖像，然后用IDL7.0 ［ITT Visual Information Solutions （ITT VIS）］編寫(xiě)的平行束濾波反投影重建算法重建獲得24位斷層圖像，最后用軟件Amira 4.1 （Mercury Computer Systems， USA）進(jìn)行三維重建。

1.4 影像學(xué)評(píng)價(jià)

血管直徑的測(cè)量使用NIH Image J Program （version 1.37）。在圖像的每一象限各選擇兩條較細(xì)的血管，由兩名醫(yī)師分別測(cè)量，每一組最細(xì)的血管被用來(lái)與另一組最細(xì)的血管進(jìn)行比較。兩名測(cè)量者共認(rèn)的最細(xì)血管的平均值作為最細(xì)血管。

1.5 病理學(xué)分析

成像結(jié)束后，所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅（Haematoxylin-Eosin，HE）染色及免疫組化染色［CD34及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）］。

2 結(jié) 果

2.1 一般結(jié)果

12例標(biāo)本中，11例可見(jiàn)腫瘤新生血管；1例僅見(jiàn)軟組織密度影，未見(jiàn)腫瘤新生血管。

2.2 成像參數(shù)的確立

物像距：由于機(jī)器部件構(gòu)造的因素，最小物像距為5 cm，相當(dāng)于傳統(tǒng)X線(xiàn)吸收成像，軟組織及腫瘤中的鈣化顯示均較模糊。隨著物像距增加，圖像分辨率也逐漸增加，物像距為100 cm時(shí)所獲得的圖像顯示腫瘤與正常組織邊界、腫瘤內(nèi)部的不均質(zhì)結(jié)構(gòu)及微鈣化等細(xì)節(jié)非常清楚。但當(dāng)物像距≥120 cm時(shí)，圖像質(zhì)量開(kāi)始下降。成像能量：能量為8 keV時(shí)圖像較暗，隨著能量增加，圖像本底明亮度增加，但襯度降低。對(duì)5種不同能量進(jìn)行對(duì)比分析，認(rèn)為能量為13 keV時(shí)圖像亮度及襯度較為理想。曝光時(shí)間：根據(jù)樣品厚度和密度不同，曝光時(shí)間也不同，系統(tǒng)在成像過(guò)程中根據(jù)探測(cè)器記錄到的像素灰度值自動(dòng)調(diào)整曝光時(shí)間，本研究中為5～25 ms。

2.3 腫瘤新生血管的檢出

在物像距為100 cm、能量為13 keV的成像條件下，二維相襯成像可清晰顯示乳腺癌標(biāo)本內(nèi)的腫瘤新生血管（圖1～2）。腫瘤新生血管呈藤蔓狀分布于腫瘤的周邊區(qū)，管徑粗細(xì)不一，走行雜亂無(wú)章，最細(xì)的腫瘤新生血管直徑約9 μm。類(lèi)同軸相位襯度CT成像可三維立體顯示腫瘤內(nèi)部雜亂無(wú)章的腫瘤新生血管（圖3），可見(jiàn)腫瘤新生血管主要分布于腫瘤周邊區(qū)域，而腫瘤中心區(qū)血管較少。

圖 1 乳腺癌標(biāo)本內(nèi)的腫瘤新生血管同步輻射類(lèi)同軸相襯成像及VEGF免疫組化檢查

圖 2 乳腺癌標(biāo)本內(nèi)的腫瘤新生血管同步輻射類(lèi)同軸相襯成像

圖 3 類(lèi)同軸相位襯度CT成像

2.4 病理學(xué)分析

HE染色可見(jiàn)正常組織與癌組織分界清楚，部分癌巢中可見(jiàn)囊變壞死，腫瘤間質(zhì)中彌漫多發(fā)裂隙狀的腫瘤新生血管。CD34及VEGF染色可見(jiàn)多發(fā)深染顆粒散在分布（圖1），形態(tài)和排列具有明顯不均一性，形態(tài)失常，多為條索狀，部分聚集成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔粗細(xì)不一。

3 討 論

12份標(biāo)本中，11份可見(jiàn)腫瘤新生血管；1份未見(jiàn)腫瘤新生血管，分析該標(biāo)本發(fā)現(xiàn)大部分為正常組織，僅邊緣有少量腫瘤組織存在，可能原因是該病例腫塊較小，取材時(shí)偏離腫塊中心，導(dǎo)致取材主要為癌旁組織，癌巢呈點(diǎn)灶狀散布于正常組織間，尚未見(jiàn)成熟的腫瘤新生血管形成。

類(lèi)同軸相位襯度成像的成像條件確定非常重要。物像距是影響圖像質(zhì)量的一個(gè)非常重要的參數(shù)［3］。根據(jù)小孔成像的原理，光源與樣品的距離固定時(shí)，物像距越大，空間分辨率越低；另一方面，物像距越大，圖像的襯度越高。本研究中物像距為5 cm或20 cm時(shí)，圖像模糊，細(xì)節(jié)顯示不夠清楚，襯度分辨率不高。而物像距為60 cm、100 cm及120 cm時(shí)，圖像質(zhì)量明顯提高，樣品中的腫瘤組織、正常組織及兩者邊界顯示非常清楚，三者圖像襯度分辨率無(wú)明顯差異。但當(dāng)物像距≥120 cm時(shí)，有效空間分辨率受到一定限制，＜10 μm的血管無(wú)法顯示。因此，本研究選擇了既能保證適當(dāng)高襯度分辨率，又不損失空間分辨率的100 cm作為物像距。圖像襯度與能量成反比，能量越低圖像襯度越高［4］。但能量太低時(shí)，對(duì)于部分較厚的標(biāo)本，光線(xiàn)穿透不夠，易造成圖像本底較為黑暗，不利于病灶細(xì)微結(jié)構(gòu)的顯示。能量為13 keV時(shí)圖像襯度最理想。

腫瘤新生血管生成對(duì)實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用［5-6］，實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)新生血管的形成。但目前傳統(tǒng)影像學(xué)技術(shù)只能分辨直徑＞200 μm的血管，且在應(yīng)用對(duì)比劑的條件下才能使血管顯影［7］。本研究利用類(lèi)同軸相位襯度成像技術(shù)，在不應(yīng)用對(duì)比劑的情況下成功獲得微米級(jí)的乳腺腫瘤新生血管，能清晰顯示最小直徑約9 μm的腫瘤血管。本研究檢出的最細(xì)血管直徑明顯小于其他研究所能顯示的最小直徑，可能與X線(xiàn)相位漂移的特性有關(guān)［8-9］。X線(xiàn)相位漂移與物體比重有一定的相關(guān)性，血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白含有大量鐵原子，其比重與周?chē)M織不同，可導(dǎo)致相位襯度發(fā)生很大的改變。而本研究選取的是臨床上新鮮的乳腺癌標(biāo)本，手術(shù)取出后立即放入甲醛溶液中固定，保證了腫瘤血管內(nèi)的血液能及時(shí)固定下來(lái)而不會(huì)被其他物質(zhì)影響，從而真實(shí)反映腫瘤新生血管的狀態(tài)。

本研究的優(yōu)勢(shì)為在無(wú)對(duì)比劑情況下即可實(shí)現(xiàn)腫瘤新生血管的成像，避免使用碘造影劑帶來(lái)的各種毒副作用，為以后臨床不用對(duì)比劑即可進(jìn)行血管成像提供了一定的思路。同時(shí)，類(lèi)同軸相位襯度成像主要依賴(lài)X線(xiàn)的折射作用［10］，與X線(xiàn)的吸收無(wú)關(guān)，可明顯減少人體吸收的輻射劑量。最后，同步輻射類(lèi)同軸相位襯度成像對(duì)腫瘤新生血管的顯示，可用來(lái)觀察早期腫瘤微血管生成及抗腫瘤新生血管治療的療效，具有很高的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值?？傊?，同步輻射成像在乳腺疾病診斷和治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。

致謝：上海光源BL13W線(xiàn)站的肖體喬、謝紅蘭、付亞楠等老師在本實(shí)驗(yàn)中的幫助和指導(dǎo)，在此一并感謝。

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Visualization of angiogenesis by synchrotron radiation in human breast cancer

LI Ruimin1， ZHANG Xi1， WANG Shengping1， PENG Weijun1， WU Jiong2
（1.Department of Radiology， Fudan University Shanghai Cancer Center；Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China； 2.Department of Breast Surgery， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China）

Correspondence to： PENG Weijun E-mail： cjr.pengweijun@vip.163.com

Objective： To evaluate the application of synchrotron radiation （SR） in-line X-ray phase-contrast imaging in human breast cancer. Methods： Twelve excised human breast specimens were studied. Monochromatic SR X-ray in-line phasecontrast images were obtained at the beamline BL13W of Shanghai Synchrotron Radiation Facility （SSRF） in China with the energy of 13 keV and the distances of 100 cm. Meanwhile， the three-dimensional images were processed. Finally， the pathology results were confirmed. Results： The images obtained with SR had higher contrast and better resolution. The angiogenesis of the breast cancer was obtained for the first time with no contrast agents， and the minimal tumor blood vessel was about 9 μm in diameter. Conclusion：SR in-line X-ray phase-contrast imaging can detect the angiogenesis of human breast cancer， and clearly display the morphological characteristics and spatial distribution of tumor blood vessels. It provides a method to study the mechanism of tumor angiogenesis and the effects of various interventions or treatments on tumor angiogenesis. It would be a great potential diagnostic tool in clinical application in the future.

Breast cancer； Angiogenesis； Synchrotron radiation in-line X ray phase-contrast imaging

R445.4

A

1008-617X（2016）02-0156-04

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（No：2010CB834305）；國(guó)家自然科學(xué)基金（No：11235007，No：81371550，No：81272446，No：81172073）

彭衛(wèi)軍 E-mail：cjr.pengweijun@vip.163.com

2016-05-10

2016-06-11）