顱內(nèi)動脈瘤并心肌損傷與交感活性亢進關系的實驗研究

方志成，周昌娥，張浩明

(湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

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顱內(nèi)動脈瘤并心肌損傷與交感活性亢進關系的實驗研究

方志成，周昌娥，張浩明

(湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的探討顱內(nèi)動脈瘤并心肌損傷與交感活性亢進關系，以期明確其發(fā)病機制，尋找有效防治方法。方法選取80只日本大耳白兔，采用改良胰彈性蛋白酶誘導動脈瘤方法制作動脈瘤模型，根據(jù)心肌酶譜、心電圖變化等篩選心肌損傷動物并以此分為心肌損傷組和非心肌損傷組，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定2組術前及術后1，2，3周血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度。術后3周處死動物，染料法熒光定量測定兔心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達情況。結果心肌損傷組術后血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于術前(P均<0.05)，術后2周達峰值，第3周開始下降，而非心肌損傷組圍術期血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度無明顯變化(P均>0.05)；同期組間比較，心肌損傷組血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于非心肌損傷組(P均<0.05)。染料法熒光定量顯示心肌損傷組心肌局部組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達量明顯低于非心肌損傷組(P<0.05)。結論動脈瘤并發(fā)心肌損傷可能與機體交感活性興奮甚至亢進、兒茶酚胺大量釋放，引起心肌毒性損傷有關。

[關鍵詞]顱內(nèi)動脈瘤；心肌損傷；交感活性；兒茶酚胺

臨床顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血患者易發(fā)生心血管并發(fā)癥，其以心律失常、心肌受損、心功能不全等為主要特點，導致病情復雜化[1-2]。目前其發(fā)生機制尚不明確，缺乏有效防治手段，導致住院時間延長、醫(yī)療費用增加，明顯增加患者病死率，并易引發(fā)醫(yī)療糾紛[3-4]。本研究應用改良胰彈性蛋白酶誘導動脈瘤方法制作顱內(nèi)動脈瘤動物模型，并根據(jù)心電圖、心肌損傷標志物檢查等篩選合并心肌損傷動物，探討交感神經(jīng)興奮、亢進與心肌損傷發(fā)生的關系，旨在明確顱內(nèi)動脈瘤并發(fā)心肌損傷的病理生理機制，為進一步尋找防治策略奠定理論基礎。

1實驗資料

1.1實驗動物健康日本大耳白兔80只，3～6月齡，體質量2～2.5 kg，雌雄不限，湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，動物合格證號：NO.42000900000184。實驗前所有動物自由飲水、進食。

1.2方法

1.2.1顱內(nèi)動脈瘤模型制作經(jīng)兔耳緣靜脈給予10%烏拉坦靜脈麻醉，沿頸部正中切口，分離筋膜，暴露氣管，在氣管右側游離出右頸總動脈(RCCA)，繼續(xù)向近心端方向游離直至右頸總動脈與右鎖骨下動脈(RSCA)分叉處，在距RCCA與RSCA分叉處上方2.5 cm處，結扎RCCA，然后動脈瘤夾夾閉RCCA與RSCA分叉，在距RCCA與RSCA分叉上方1.5 cm處，用26 G靜脈留置針(內(nèi)徑0.6 mm，長度1.5 cm，流量15 mL/min)穿刺RCCA并注入75 IU豬胰彈性蛋白酶，最后松開RCCA遠心端結扎，并移除動脈瘤夾[5]，注意觀察穿刺口滲血情況。術中因失血性休克死亡7只，成功制作動物模型73只。術后8 h開始進水、食物，每日給予青霉素20萬IU肌注預防感染，觀察動物術后神志、肢體活動情況，并做記錄。

1.2.2研究分組對所有實驗動物測定血漿肌鈣蛋白I、腦型利鈉肽濃度，行心臟超聲、心電圖等相關檢查，根據(jù)檢測結果將造模成功白兔分為心肌損傷組42只和非心肌損傷組31只。心肌損傷確定依據(jù)：心肌損傷標志物升高、心電圖各導聯(lián)有ST段下移、抬高等，或心臟超聲發(fā)現(xiàn)心功能異常、室壁運動異常等現(xiàn)象均認為合并心肌損傷。

1.2.3血漿兒茶酚胺濃度檢測術前及術后1周、2周、3周經(jīng)兔耳緣靜脈取靜脈血4 mL,室溫血液自然凝固10～20 min，2 000～3 000 r/min離心20 min左右，收集上清，用ELSIA法測定不同時間血漿腎上腺素、去甲腎上腺素濃度。

1.2.4心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA檢測術后3周處死實驗動物后，取小塊心肌組織，RNAsimple Total RNA Kit提取細胞總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量，ND-1000(NanoDrop Technologies，USA)提取濃度和純度。BioBRK RT Kit迅速合成cDNA：20 μL總體系含1 μg RNA，2.5 μmol/L的Oligo(dT)18，1× RT緩沖液，1 mmol/L每種dNTP，100 IU的ReverTra Ace，5unit 的Super-RI，0.5 μL 的RT-Enhancer， 無RNase 水加至終體積。逆轉錄程序：42 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min 滅活逆轉錄酶。合成的cDNA用滅菌蒸餾水稀釋5倍，-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。SYBR GreenⅠ染料法實時熒光定量PCR法檢測β2腎上腺素能受體mRNA表達：以GAPDH基因為內(nèi)參，設計GAPDH和β2腎上腺素能受體基因熒光定量引物，為避免DNA污染，上下游引物設計位點均應跨越基因的相鄰外顯子。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性8s，60℃退火及延伸32s，共進行40個循環(huán)，結果采用2-△△CT法進行分析。RT-PCR反應體系10 μL:SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ(2×)5 μL， ROX reference Dye Ⅰ(50×)0.2 μL， GAPDH or β3-AR Forward Primer(10 μM)0.4 μL，GAPDH or β3-AR Reverse Primer(10 μM)0.4 μL， cDNA 500 ng， ddH2O加至總體積到10 μL。置于ABI實時熒光定量PCR儀上進行反應，評估心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達情況。

2結果

2.1造模動物情況心肌損傷組動物傷口恢復時間略慢于非心肌損傷組，進食也稍差。但2組動物均可自由活動，傷口愈合良好，術后意識清楚，無肢體活動障礙。

2.2血漿兒茶酚胺濃度變化心肌損傷組術后血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于術前(P均<0.05)，術后2周達峰值，第3周開始下降，而非心肌損傷組圍術期血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度無明顯變化(P均>0.05)；同期組間比較，心肌損傷組血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于非心肌損傷組(P均<0.05)。見表1。

2.3局部心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達情況非心肌損傷組與心肌損傷組β2腎上腺素能受體mRNA表達量分別為1.03±0.06和 0.79±0.03，心肌損傷組β2腎上腺素能受體mRNA表達量明顯低于非心肌損傷組(P<0.05)。

表1　2組不同時間兒茶酚胺濃度變化

注：①與術前比較，P<0.05；②與非心肌損傷組同期比較，P<0.05。

3討論

顱內(nèi)動脈瘤合并心肌損傷臨床常見，前期研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血后中樞性交感神經(jīng)興奮，導致交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素、腎上腺素，后者作用于心肌，發(fā)生兒茶酚胺毒性作用，終致心肌損傷[2]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，合并心肌損傷的顱內(nèi)動脈瘤動物模型，術后血漿腎上腺素、去甲腎上腺素濃度逐漸升高，術后2周達到高峰，術后3周開始下降；心肌損傷組心肌局部組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達明顯下降，而非心肌損傷組則無上述變化。提示動脈瘤并發(fā)心肌損傷可能與機體交感活性興奮甚至亢進、兒茶酚胺大量釋放有關。分析原因可能為：①交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，交感神經(jīng)末梢釋放大量腎上腺素、去甲腎上腺素等兒茶酚胺，其與心肌表面包括β2受體在內(nèi)的腎上腺素能受體結合，產(chǎn)生兒茶酚胺毒性作用，臨床出現(xiàn)心律失常、心電圖ST段變化、肌鈣蛋白等心肌損傷標志物升高、甚至心肌室壁運動異常等心功能不全表現(xiàn)[6-7]。②氧化應激損傷。多個研究已經(jīng)明確，去甲腎上腺素可誘導體外細胞模型中心肌細胞損傷，導致心肌細胞超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯降低，丙二醛(MDA)含量明顯升高，應用腎上腺能受體阻斷藥后SOD升高而MDA含量明顯下降，說明機體交感神經(jīng)活性興奮可誘導氧化應激反應進而導致心肌損傷[8-9]。③心肌冠脈血管功能失調(diào)。交感神經(jīng)興奮，血漿兒茶酚胺濃度升高，作用于心肌冠脈血管內(nèi)皮相應受體，導致冠脈血管收縮、舒張功能失調(diào)，繼之心肌細胞缺氧缺血，心肌細胞電生理異常，臨床出現(xiàn)各種類型心律失常，心肌細胞缺血嚴重時，還會導致心肌細胞器質性損傷，包括肌鈣蛋白I在內(nèi)的心肌損傷標志物升高，心功能受損[10]。④心肌無菌性炎癥。動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血，體內(nèi)交感神經(jīng)末梢釋放大量兒茶酚胺，其通過免疫細胞上α、β腎上腺素能受體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用[11]，激活機體心肌局部炎癥因子，炎癥遞質大量釋放，心肌局部炎癥反應綜合征與抗炎反應綜合征比例失調(diào)，炎癥反應劇烈，加劇心肌損傷。⑤能量代謝異常，心肌細胞能量不足。顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血合并心肌損傷時，機體應激狀態(tài)下兒茶酚胺分泌增多，營養(yǎng)物質代謝異常，血中糖酵解增強，產(chǎn)生乳酸增多，ATP下降，心肌細胞鈉鉀泵功能失常，心肌細胞收縮、舒張功能及電生理功能受損；另外應激時，兒茶酚胺是較強的脂解激素，其介導β2受體激活，導致脂肪分解加速，酮體大量生成，心肌細胞能量來源不足，心肌受損[12]。⑥激素允許作用。哺乳動物體內(nèi)存在糖皮質激素，通過經(jīng)典的基因組機制促進兒茶酚胺的生物合成或增加血管平滑肌細胞膜上兒茶酚胺受體數(shù)量，及調(diào)節(jié)受體介導的細胞信息傳遞過程，從而增加心血管系統(tǒng)對兒茶酚胺縮血管物質的敏感性[13]，在交感神經(jīng)興奮、亢進的情況下，激素允許作用強化，擴大兒茶酚胺心肌毒性作用，加劇心肌損傷。

本研究已初步證實顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血合并心肌損傷動物模型中，血漿腎上腺素、去甲腎上腺素濃度明顯上升，隨時間推移逐步上升直至術后2～3周，此時間動脈瘤正在形成，也易于合并心肌損傷，同時術后心肌局部組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達明顯下降，說明交感活性亢進、兒茶酚胺大量釋放甚至兒茶酚胺毒性是引起動脈瘤并發(fā)心肌損傷的重要原因，為今后尋找有效治療方法提供了理論依據(jù)。本研究不足之處在于：①動物模型交感神經(jīng)興奮、亢進原因除與動脈瘤原發(fā)疾病有關外，手術創(chuàng)傷、機體應激也是原因之一，兩方面因素疊加在一起是否會干擾實驗結果，手術早期這種影響可能更為突出？②本研究在頸部制作動脈瘤模型，雖然動脈瘤組織形態(tài)學、病理學特征與顱內(nèi)動脈瘤高度相似，但哺乳動物頸部存在頸動脈竇，頸部交感神經(jīng)分布豐富，動脈瘤在形成過程中可能也會誘發(fā)頸部交感神經(jīng)興奮，釋放兒茶酚胺，可能干擾研究。③目前關于交感神經(jīng)興奮、亢進的臨床檢測方法不多，手段有限，不能全面、深入的觀察、分析交感神經(jīng)功能變化。④心肌損傷原因眾多，本研究僅關注交感神經(jīng)興奮所釋放的兒茶酚胺毒性對心肌損傷作用，除此以外尚有其他原因。⑤如果給予腎上腺素能受體阻滯劑如美托樂爾等，是否可以阻斷、逆轉、恢復心肌損傷，如此，則能更進一步證明顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血并發(fā)心肌損傷與交感神經(jīng)興奮、亢進之間關系。上述這些都需要今后進一步研究。

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[作者簡介]方志成，男，主任醫(yī)師，主要從事急危重癥研究。 [通信作者]周昌娥，E-mail:13593751009@139.com

[基金項目]湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB314)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.006

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)22-2411-03

[收稿日期]2016-03-10

Experimental study of the relationship between myocardial injury of intracranial aneurysm and hyperfunction of sympathetic activity

FANG Zhicheng, ZHOU Chang’e，ZHANG Haoming

(TaiHe Hospital,HuBei University of Medicin，Shiyan 442000，Hubei,China)

Abstract:Objective It is to explore the relationship between myocardial injury of intracranial aneurysm and hyperfunction of sympathetic activity, thus to find out its mechanism and effective method for prevention and treatment. Methods 80 Japanese big ear rabbit were selected to establish aneurysm models by modified method of pancreatic elastase induction. According to the changes of myocardial enzyme spectrum, electrocardiogram (EKG) the myocardial injury animals were screened and divided into myocardial injury group and non-myocardial injury group.Plasma contents of noradrenaline (NE) and epinephrine (E) were determined by enzyme linked immunosorbent assay in both groups before operation and in 1, 2, 3 weeks after operation.In 3 weeks after operation the animals were killed and the expression of mRNA of β2-adrenoreceptor in myocardial tissue was detected by fluorescence analysis. Results The contents of NE and E were significantly higher after operation compared with that before operation in myocardial injury group(P<0.05), the contents reached peak value at 2 weeks after operation and began to decrease in the third weeks. No significant changes of the contents were found in non-myocardial injury group(P>0.05). The contents in myocardial injury group were higher than that in non-myocardial group at the same stage (P>0.05). Fluorescence quantitative analysis showed that the expression of mRNA of β2-adrenoreceptor in myocardial tissue of myocardial injury group was lower than that in non-myocardial injury group(P<0.05). Conclusion Aneurysm complicating with myocardial injury may be related with hyperfunction of sympathetic activity, much release of catecholamine which could induce cardiac muscle toxicity injury.

Key words:intracranial aneurysm; sympathetic toxicity;catecholamine