阻抗光譜在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

朱　丹，李強(qiáng)強(qiáng)，逄秀梅，劉　悅，王　雪，賈　曼，陳　剛（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081）

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阻抗光譜在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

朱丹，李強(qiáng)強(qiáng)，逄秀梅，劉悅，王雪，賈曼，陳剛*
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081）

摘要：電化學(xué)阻抗譜（EIS）由于免標(biāo)記，測定簡便，靈敏度高等優(yōu)點受到關(guān)注，逐漸成為電化學(xué)生物傳感器中的研究熱點。文中簡要概述了EIS技術(shù)的相關(guān)概念、原理，以及在酶、免疫、DNA、細(xì)胞、離子通道傳感器等生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：電化學(xué)阻抗譜；生物傳感器；研究進(jìn)展

0　引言

生物傳感技術(shù)是集化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)和信息學(xué)等多學(xué)科的分析技術(shù)［1］，它以生物活性材料，如酶、抗原、抗體和細(xì)胞等為感知元件，通過信號轉(zhuǎn)換器，如電化學(xué)、熱、壓電和表面聲波等，得到可定量識別的數(shù)字信號。電化學(xué)生物傳感器由于其靈敏度高、檢測范圍廣及可操作性強(qiáng)等優(yōu)點，近些年來得到廣泛的關(guān)注。尤其是基于電化學(xué)的葡萄糖生物傳感器，在疾病和病原體的診斷和檢測中，發(fā)揮著重要的作用。近期的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，生物傳感器有關(guān)的文章中有近一半涉及到了電化學(xué)方法，包括電位型，電流型，電容型和電導(dǎo)性四種形式，并且相關(guān)的比較文獻(xiàn)綜述也有發(fā)表。其中，電化學(xué)阻抗傳感器（Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS），因為其高靈敏度和穩(wěn)定性，逐漸成為研究熱點［2］。

電化學(xué)阻抗譜具有良好的界面表征作用，多用來檢測修飾有生物分子的電極界面的生物學(xué)反應(yīng)特性，如載體表面電容或電子傳遞電阻等。20世紀(jì)60年代初，荷蘭物理化學(xué)家Sluyters首次在實驗中實現(xiàn)了電化學(xué)中交流阻抗譜方法的應(yīng)用［2］。此后，隨著儀器的發(fā)展，阻抗譜方法在電化學(xué)傳感器中的研究得到迅速發(fā)展，如酶傳感器，免疫傳感器，DNA傳感器，離子通道傳感器，細(xì)胞和微生物傳感器等［3］。

1　電化學(xué)阻抗譜分析法的基本原理

EIS分析法測量電極和生物敏感膜的小信號阻抗的頻率響應(yīng)，微小振幅正弦電流或電壓不會對生物大分子的測定造成干擾，因此該方法敏感性高，可測量到極微的信號。當(dāng)電極處于平衡電位時測定EIS，對電極表面生物分子膜的影響較小，能夠真實地反映膜本身的電化學(xué)性質(zhì)。

通常電阻Z值是通過測量在微小振幅變化的擾動電壓作用下產(chǎn)生的電流信號得到的，是電壓V（t）和電流I（t）的比值，可由公式（1）表示［4］。其中，V0和I0分別是初始的電壓和電流值，f是頻率，t是時間，Ф是電壓-時間函數(shù)和電流-時間函數(shù)之間的相位角，Y是導(dǎo)納，與阻抗互為倒數(shù)關(guān)系。

電阻是一個復(fù)雜的值，因為交流電勢與電流信號的比值（系統(tǒng)的阻抗）不僅隨正弦波頻率（f）變化，另外阻抗的相位角（Ф）也會隨（f0）變化。因此，阻抗值既可以用模擬系數(shù)（|Z|）和相位角（Ф）表示，也可以用阻抗的實部（ZR）和虛部（ZI）表示。鑒于此，阻抗的測定可以有兩種方式：①波特圖（Bode plot），包括兩條曲線，橫坐標(biāo)是平率的對數(shù)，縱坐標(biāo)分別是阻抗模擬值的對數(shù)（log|Z|）和阻抗的相位角（Ф）；② 奈奎斯特圖（Nyquist plot），以阻抗的實部（ZR）為橫軸，以阻抗的虛部的負(fù)數(shù)（-ZI）為縱軸，圖中的每個點分別代表不同的頻率，其中左側(cè)的頻率高，為高頻區(qū)，右側(cè)的頻率低，為低頻區(qū)。

一般是將測量得到的電化學(xué)過程用等效電路進(jìn)行模擬后進(jìn)行計算得到。進(jìn)行電化學(xué)阻抗測定時，對于工作電極需要控制以下三個條件：①在開路電位（OCP）下測量，根據(jù)溶液成分來確定平衡電位，在測定過程中保持穩(wěn)定，常在二電極系統(tǒng)中使用；②固定工作電極的直流電壓，保證氧化還原等過程的發(fā)生，常用于三電極系統(tǒng)中；③確定工作電極的通過電流，一般用于三電極系統(tǒng)中的恒電流模式［4］。等效電路的有效元件包括電解質(zhì)溶液電阻（Rs），界面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret），電解質(zhì)中離子運(yùn)動產(chǎn)生的阻抗Zw（Warburg阻抗）等效電感（L），界面區(qū)間電荷產(chǎn)生的電雙層電容（CPE）等。電極反應(yīng)的等效電路一般可以用上述有效元件的串聯(lián)、并聯(lián)電路等進(jìn)行模擬，常用的阻抗圖譜為Nyquist plot（圖1A），現(xiàn)代阻抗圖譜分析包括數(shù)據(jù)分析和電路模擬等軟件，可以根據(jù)文獻(xiàn)中的或者軟件中已有的模型確定，一般用圖1B中的等效電路進(jìn)行擬合（擬合曲線如圖1A中的實線所示），計算出實驗需要的Ret值以及幫助判斷生物膜形成和生物學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)過程和機(jī)制。

圖1?。ˋ）虛線為法拉第阻抗譜Nyquist模式示意圖，實線為由等效電路圖擬合得到的曲線。（B）等效電路圖，Rs：電解質(zhì)溶液電阻；CPE：界面區(qū)間電荷產(chǎn)生的電雙層電容；Ret：界面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移阻抗；Zw：電解質(zhì)中離子運(yùn)動產(chǎn)生的阻抗Fig.1?。ˋ）Dash line:The Nyquist plot of the faradaic impedance；Solid line:The fitting line according to the equivalent circuit.（B）The equivalent circuit，Rs-solution-phase resistance；CPE-double-layer capacitance；Retelectron transfer resistance；Zw-Warburg impedance

阻抗譜通常分為法拉第阻抗譜和非法拉第阻抗譜［5］。法拉第阻抗譜中，在溶液中引入氧化還原探針測定異相電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret），電極附近的帶電表面會產(chǎn)生引力或斥力，進(jìn)而影響Ret值的測定，表面電荷主要受pH、溫度等因素的影響。另外，Ret值也受免疫傳感器中探針與目標(biāo)物結(jié)合引起的膜厚度變化或者分子構(gòu)象厚度的變化影響，多用于分析生物學(xué)反應(yīng)過程。非法拉第阻抗譜主要用由有效元件模擬得到的等效電路確定，通常用電容的變化來測定溶液中目標(biāo)物的濃度。一般的等效電路包含三種電容，分別是自組裝膜本身、探針層和雙電層，多用于分析生物敏感膜形成過程。

2　電化學(xué)阻抗譜分析法在傳感器中的應(yīng)用

2.1電化學(xué)阻抗譜分析法在酶傳感器中的應(yīng)用

酶傳感器是以測量在電極上修飾酶以及在酶催化作用下發(fā)生的氧化還原反應(yīng)或者產(chǎn)物的形成等過程中產(chǎn)生的電阻變化為基礎(chǔ)，進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量分析。其中，酶的固定是研究的前沿?zé)狳c，通過固載酶技術(shù)，將酶固定或者束縛在特定的區(qū)域范圍內(nèi)，進(jìn)行其特定的催化反應(yīng)，并且可以進(jìn)行一定程度的重復(fù)利用和回收，穩(wěn)定性好，效率高［6］。常見的酶傳感器有脲酶，葡萄糖氧化酶，辣根過氧化物酶，醇氧化酶，乙酰膽堿酯酶等。常用的固載材料包括石墨烯，碳納米管，膠體金等。有關(guān)酶傳感器已多有報道［7］，Lu等［8］將金剛烷胺修飾的辣根過氧化物酶（HRP-ADA）固定在環(huán)糊精修飾的石墨烯（CD-GR）上，用交流阻抗譜法分別研究了組裝過程和固定酶的催化活性，傳感器對雙氧水（H2O2）的檢測限可以達(dá)到0.1 μmol/L，并且在0.7～35 μmol/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。郭明等［6］建立了基于碳納米管的乙酰膽堿酯酶（CNT-AChE）的電化學(xué)生物傳感器，通過優(yōu)化不同的電極修飾方法，構(gòu)建了等效電路模型，成功實現(xiàn)了對農(nóng)藥異丙威的檢測。Barsan等［9］將葡萄糖氧化酶（GOx）和氮摻雜石墨烯（NG）分散在帶正電荷的殼聚糖聚合物上，通過層層自組裝技術(shù)修飾金電極，構(gòu)建了新型葡萄糖氧化酶傳感器，檢測限為64 μmol/L，線性關(guān)系良好。

2.2電化學(xué)阻抗譜分析法在免疫傳感器中的應(yīng)用

在免疫傳感器的研究中，電化學(xué)阻抗譜檢測目標(biāo)物的方法由于其高靈敏度、高特異性、檢測速度快、免標(biāo)記等優(yōu)勢已經(jīng)引起了極大的關(guān)注，在食品安全，疾病診斷等方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用，實現(xiàn)了小分子痕量及細(xì)菌檢測［10-13］。在電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建中，一般是將抗體或抗原固定在導(dǎo)電的材料上，進(jìn)而修飾電極，因此，抗原或抗體的固定是構(gòu)建的關(guān)鍵步驟。Jia等［14］比較了二抗（羊抗人）（anti-hIgG）分別在裸金電極、碳納米管/金電極（MWCNT/Au）、戊二醛/鄰氨基苯硫醇/金電極（GA/4AT/Au）、膠體金/鄰氨基苯硫醇/金電極（nanoAu/4AT/Au）等的吸附力和與人抗體hIgG的結(jié)合力，結(jié)果表明膠體金修飾的電極由于大的比表面積及共價結(jié)合等優(yōu)勢效果最好；Yan等［15］將克倫特羅抗體共價連接在羧基化修飾的石墨烯上，結(jié)合二抗的信號放大作用，檢測限可以達(dá)到6.57 pg/mL，線性范圍為0.01 ng/mL 到10 ng/mL。Maalouf等［16］通過生物-親和素方法將大腸桿菌抗體結(jié)合在金電極表面的自組裝膜上，用EIS的檢測方法，成功實現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測；Li等［17］將嗜肺軍團(tuán)菌的抗體共價結(jié)合在金芯片上，構(gòu)建了一次性免疫芯片系統(tǒng)，結(jié)合EIS的方法實現(xiàn)了對嗜肺軍團(tuán)菌的檢測，可以進(jìn)一步應(yīng)用在臨床和環(huán)境樣品的檢測中。EIS方法檢測靈敏度好，特異性強(qiáng)，在免疫傳感器中有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3電化學(xué)阻抗譜分析法在DNA傳感器中的應(yīng)用

DNA生物傳感器是近年來發(fā)展迅速，較為新穎的一類傳感器，是研究熱點之一，具有較大的研究價值和應(yīng)用前景。DNA是一種帶負(fù)電荷的生物分子，當(dāng)單鏈DNA或雙鏈DNA附著于電極表面時，電極表面會出現(xiàn)負(fù)電荷層。在氧化還原電極的作用下，電極表面的負(fù)電荷層會對氧化還原電極產(chǎn)生靜電排斥作用，這種作用會表現(xiàn)為在EIS中實部阻抗的增加，因此滴汞電極、金電極、玻碳電極等可被用作辨別單鏈DNA、雙鏈DNA以及合成的多聚核苷酸的傳感器材料。但是由于DNA分子較小，其能量變化（如生化特性、反應(yīng)特性）也相對較弱，相應(yīng)地應(yīng)用于DNA傳感器的傳感技術(shù)要比其他生物大分子傳感器更靈敏，因此需要開發(fā)靈敏度更高的生物傳感器。近年來，一些新的電極替代材料相繼被應(yīng)用到DNA生物傳感器的研究中，比如硅，量子點（如硫化鎘，CdS等）。另外，傳統(tǒng)電極經(jīng)過不同的材料（如金屬離子［18］或氧化物［19-20］，納米材料［21-22］，聚合物［23-25］，磁性微球［26］等）修飾后也會極大地提高傳感器的靈敏度。Manesse等［27］用金/無定型硅（Au/SiOx）復(fù)核膜結(jié)合DNA，用EIS方法進(jìn)行檢測，并用表面等離子共振 （SPR）的方法進(jìn)行了結(jié)果確證。Li等［18］用不同的金屬離子Mg2+、Zn2+、Ni2+和Co2+與DNA-肽核酸（PNA）膜結(jié)合修飾金電極，并用阻抗譜法比較了其不同的修飾效果，得出Ni2+與DNA-PNA膜結(jié)合效果最好，阻抗值最小，并且可以用來檢測C-T錯配。

采用電活性小分子作為雜交指示或者將納米材料引入以及電活性小分子和納米材料配合使用，提高電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度和特異性，最終目的是將其進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用，如進(jìn)行食品中殘留農(nóng)獸藥的測定，臨床上病源基因、微生物等的檢測。Istamboulié等［28］設(shè)計了一種新型DNA傳感器，將用六乙二醇修飾的含21個堿基的寡核苷酸通過碳二亞胺法固定在重氮化活化的碳絲網(wǎng)印刷電極上，并用循環(huán)伏安法和阻抗法進(jìn)行表征，成功用于牛奶中黃曲霉毒素（AFM1）的檢測，檢測范圍為2～150 ng/L，檢測限是1.15 ng/L。在Huang等［29］的研究中，報道了可以用于檢測人乳頭瘤病毒（HPV）的DNA傳感器，將捕獲探針固定在石墨烯/納米金/聚硫堇修飾的玻碳電極上（G/Au NR/PT-GCE），并用［Ru（phen）3］2+作為氧化還原指示劑和信號放大劑，成功實現(xiàn)HPV 的DNA測定，檢測范圍為1.0×10-13到1.0×10-10mol/L，檢測限是4.03×10-14mol/L，另外有望用于人血漿樣品中HPV DNA的測定，進(jìn)而用于臨床研究中。

2.4電化學(xué)阻抗譜分析法在細(xì)胞傳感器中的應(yīng)用

細(xì)胞作為組成有機(jī)體形態(tài)和功能的基本單位，對其結(jié)構(gòu)和活動等的研究在生命科學(xué)研究中有著重要的基礎(chǔ)作用。因此，以電化學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞傳感器的設(shè)計和構(gòu)建，成為目前生物傳感器研究領(lǐng)域的一大熱點。目前，已有文獻(xiàn)報道的電化學(xué)細(xì)胞傳感器主要是用來檢測細(xì)胞的類別、活性、濃度，幫助揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能關(guān)系或者外源分子對細(xì)胞功能的影響［30-33］。由于電化學(xué)阻抗譜無需標(biāo)記物，制備簡單且靈敏度高，因此基于電化學(xué)阻抗譜分析法的細(xì)胞傳感器已逐步應(yīng)用于細(xì)胞的檢測，如張茜等［34］以聚苯胺納米纖維-膠體金復(fù)合膜（PANI-NF/AuNPs）構(gòu)建傳感器界面，并修飾上轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf），利用Tf與人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）間的特異性識別作用，捕獲細(xì)胞到傳感器界面，進(jìn)而利用電化學(xué)阻抗譜研究姜黃素對HeLa細(xì)胞的抑制作用，靈敏度高，特異性好。2.5電化學(xué)阻抗譜分析法在離子通道傳感器中的應(yīng)用

基于仿生學(xué)離子通道的傳感技術(shù)是電化學(xué)傳感器研究中的新興領(lǐng)域，研究表明化學(xué)改性膜結(jié)合仿生學(xué)離子通道在仿生學(xué)、制藥學(xué)以及生物分析學(xué)等有著重要的作用［35］。另外，電化學(xué)阻抗譜 （EIS）是離子通道生物傳感器分析的理想工具，可以測量較廣范圍內(nèi)的離子種類，離子濃度，雙分子膜結(jié)構(gòu)等［36］。阻抗光譜可以量化不同的界面成分，固定方法，離子濃度，離子種類等帶來的界面電容或電阻變化，如R?mer等［37］用EIS方法研究在不同的脂質(zhì)雙分子層固體基質(zhì)上通過短桿菌肽通道的離子運(yùn)輸情況。Kohli等［38］用EIS方法研究了不同濃度的十二烷基磺酸鈉（DBS）在用十八烷基三甲氧基硅烷修飾的氧化鋁膜碳納米管的傳導(dǎo)機(jī)理，證明表面活性劑分子DBS能夠減少界面疏水性，并作為開關(guān)控制離子在界面的進(jìn)出，進(jìn)一步闡釋了EIS在離子通道傳感器中的應(yīng)用。近年來，Kozuch等［39］將人電壓依賴性陰離子通道（hVDAC）嵌在固定在納米金電極上的磷脂雙分子層中，并用EIS分析電壓介導(dǎo)的分子結(jié)構(gòu)變化。因此，EIS作為一種靈敏的、可靠的分析方法在離子通道傳感器的研究中起著重要的作用。

3　總結(jié)和展望

通過文獻(xiàn)報道可以看出，EIS分析方法在不同的生物傳感器的應(yīng)用，包括醫(yī)療、基因分析、食品工業(yè)以及環(huán)境分析中等均有著廣闊的前景。另外，EIS可以表征膜電荷轉(zhuǎn)移過程，是評估傳感器穩(wěn)定性和可靠性的有效方法。但是目前對EIS技術(shù)的研究仍有許多不足。首先，由于基質(zhì)干擾嚴(yán)重以及非特異性吸附的存在，現(xiàn)有的EIS的方法難以應(yīng)用到復(fù)雜樣品的檢測中，并且會降低檢測的靈敏度。其次，EIS是依賴時間和阻抗值變化進(jìn)行分析的方法，一個完整的阻抗譜涵蓋的頻率范圍廣，測量時間長，有時可能長達(dá)數(shù)小時，長時間的測量會增加不確定因素，進(jìn)而影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在使用中，EIS多作為一種表征方法，難以用于常規(guī)的測量中，目前，已有研究［40-41］致力于縮短測量時間，使即時阻抗譜的獲取成為可能。盡管有一些不足，但是EIS不需要標(biāo)記，并且可以直接測量，因此可以簡化傳感器，減少設(shè)計流程，便于組裝和攜帶；另外局部EIS可以用于研究微觀電極過程，比如電極表面修飾、局部氧化還原反應(yīng)、膜組分之間的電流影響、膜上電荷轉(zhuǎn)移等的研究，EIS的上述特性是其它方法難以替代的，隨著理論認(rèn)識的深入和發(fā)展，EIS分析方法會越來越完善，并逐步得到更廣泛的應(yīng)用。

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*通信聯(lián)系人，Tel.:010-82106559；fax:010-82106560，E-mail:chengang01@caas.cn

基金項目：“十一五”國家科技支撐計劃項目（2009BADB7B07）；農(nóng)業(yè)部引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計劃（948）項目（2013-S1）

Application of the impedance spectrum in the electrochemical sensor research

Zhu Dan，Li Qiang-qiang，Pang Xiu-mei，Liu Yue，Wang Xue，Jia Man，Chen Gang*
（Institute of quality standard and testing technology for agro-products caas，Beijing 100081，China）

Abstract:Owing to the advantages of the label-free，direct binding detection and high sensitivity，the electrochemical impedance spectrum has received much attention and become the research focus in the electrochemical sensor filed gradually.This article introduces the basic concepts，principles and application progress of the EIS method in various biosensors，including the immunosensor，DNA sensor，cell sensor，ion channel sensor，etc.

Key words:electrochemical impedance spectrum；biosensor；research progress