基于氨基酸的抗垢涂層及森林腦炎快速診斷

王卓霄，王漢奇，程 昉*，孫澹逸，康曉平，楊銀輝（.大連理工大學(xué)制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連604）（.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京0007）

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基于氨基酸的抗垢涂層及森林腦炎快速診斷

王卓霄1，王漢奇1，程 昉1*，孫澹逸1，康曉平2，楊銀輝2
（1.大連理工大學(xué)制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024）
（2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100071）

摘要：待檢樣品中蛋白質(zhì)的非特異性吸附是傳感器檢測(cè)臨床血清亟待解決的問題。該文提出了一種在傳感器表面制備抗蛋白質(zhì)非特異性吸附涂層的方法，以二乙烯基砜（DVS）作為偶聯(lián)劑，將天然氨基酸分子鍵合在經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）修飾的傳感器表面，制備出一類新型抗垢涂層。通過蛋白吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)多種氨基酸進(jìn)行了篩選，并結(jié)合接觸角的變化對(duì)鍵合條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）表征了制備的涂層。結(jié)果表明，使用賴氨酸（50 mmol/L）在pH9.5的條件下制備的抗垢涂層具有最優(yōu)的抗蛋白非特異性吸附能力。該文采用該方法在生物膜干涉?zhèn)鞲衅?（Biolayer Interferometry，BLI）表面制備了抗垢涂層，并以森林腦炎為例，對(duì)森林腦炎患者血清進(jìn)行檢測(cè)，得到測(cè)量結(jié)果與臨床ELISA檢測(cè)結(jié)果相吻合，表明該文所建立的方法可以應(yīng)用于血清樣品的快速定量檢測(cè)。該文構(gòu)建的基于天然氨基酸的抗垢涂層，制備簡(jiǎn)單，成本低廉，而且容易實(shí)現(xiàn)抗垢與特異性臨床診斷的雙功能，具有臨床應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：表面抗垢；乙烯基砜化學(xué)；天然氨基酸；APTES；森林腦炎

0　引言

隨著物理光學(xué)基礎(chǔ)研究的深入和儀器制造水平的提高，光學(xué)無標(biāo)記生物傳感器越來越多的被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)［1-3］。其中，硅基傳感器由于器件成本低廉、檢測(cè)定量快速等優(yōu)點(diǎn)成為了一種具有一定臨床檢測(cè)潛力的儀器［4］。然而，實(shí)際臨床樣品中（如血清）存在著大量的蛋白質(zhì)，所產(chǎn)生的非特異性吸附會(huì)干擾樣品檢測(cè)的結(jié)果［5-6］。

為了降低蛋白質(zhì)的非特異性吸附，多種抗垢材料被應(yīng)用于傳感器表面［7-9］，其中最常見的是聚乙二醇和兩性離子高分子材料。聚乙二醇分子中大量的乙氧基能與水分子形成氫鍵，在聚乙二醇分子周圍形成水化層，同時(shí)依靠聚乙二醇分子鏈的空間排斥力，阻礙生物大分子的非特異性吸附［10-11］。聚乙二醇具有電中性，無毒，無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為應(yīng)用最廣泛的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附材料。

兩性離子高分子是分子上均勻分布等量正負(fù)離子的電中性聚合物。兩性離子高分子通過離子作用與水分子形成一層致密的水化層，有效阻礙了生物大分子的非特異性吸附［12-14］。然而，兩性離子高分子所涉及的單體制備需要無水無氧操作，合成條件苛刻。此外，在傳感器表面聚合的控制性偏低，也限制了其廣泛的應(yīng)用。

氨基酸在生理?xiàng)l件下是一類天然的兩性離子化合物，已被應(yīng)用于多種抗垢涂層的構(gòu)建。例如，Chen等利用交替的谷氨酸/賴氨酸，在金表面制備了具有兩性離子結(jié)構(gòu)的抗垢涂層，通過表面等離子體共振（SPR）實(shí)驗(yàn)證明其有顯著的抗非特異性吸附能力，最低可達(dá)到0.3 ng/cm2［15］。Shi等分別用賴氨酸，甘氨酸，絲氨酸修飾聚丙烯腈膜，通過蛋白吸附實(shí)驗(yàn)證明賴氨酸鍵合的聚丙烯腈膜表面具有良好的抗垢能力［16］。Lin等用半胱氨酸分別在不銹鋼金屬和金表面制備了具有兩性離子結(jié)構(gòu)的抗垢涂層，通過蛋白吸附實(shí)驗(yàn)證明該涂層明顯改善了不銹鋼和金表面的抗垢能力［17］。而且，氨基酸分子中普遍存在的羧基和氨基可以進(jìn)一步偶聯(lián)生物大分子。

二乙烯基砜（DVS）是一種親和層析偶聯(lián)劑，一端的乙烯基與瓊脂糖凝膠化學(xué)鍵合，另一端可以與多種有機(jī)小分子和生物大分子進(jìn)行共價(jià)鍵偶聯(lián)。近年來，該偶聯(lián)方法已被應(yīng)用于金襯底、硅襯底和紙襯底的生物傳感功能化。例如，該課題組通過DVS將含有羥基金表面與4-巰基吡啶鍵連，利用SPR研究疏水電荷誘導(dǎo)層析中抗體和配體的相互作用［18］。Shang等通過DVS將硅表面與糖類化合物鍵連，得到具有生物功能的穩(wěn)定表面［19］。Yu等通過將DVS鍵連在纖維素上，得到具有可以和生物分子鍵連的纖維素膜［20］。該方法反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，適用于多種基團(tuán)（氨基、巰基和羥基）的偶聯(lián)。近期，該課題組的研究表明乙烯基砜基團(tuán)在弱堿性水溶液中與氨基反應(yīng)，其反應(yīng)速率可以通過溶液pH值等因素進(jìn)行調(diào)控［21］。

生物膜干涉技術(shù)（biolayer Interferometry，BLI）是一種光學(xué)無標(biāo)記的快速檢測(cè)技術(shù)。其檢測(cè)原理是基于傳感器表面生物膜厚度的變化引起的干涉光譜漂移，通過跟蹤漂移位移，可獲得表面上生物大分子吸附和解離的情況［22-24］。該生物傳感技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)［23］。Maragos通過固定DON抗體用BLI對(duì)小麥中小分子脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)下限可達(dá)0.09 mg/kg［25］。McGrath等通過固定軟骨藻酸抗體檢測(cè)食品中軟骨藻酸，最低檢測(cè)下限可達(dá)18 μg/g［26］。證明BLI是一種靈敏度高，檢測(cè)下限低，線性范圍寬，適用范圍廣的快速檢測(cè)技術(shù)。

該文以DVS為偶聯(lián)劑，將氨基酸固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）修飾的硅基材料表面［27］，制備出一類抗垢涂層。通過蛋白吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)苯丙氨酸（Phe），甘氨酸（Gly），精氨酸（Arg），半胱氨酸（Cys）和賴氨酸（Lys）涂層進(jìn)行了篩選。其中，以賴氨酸為例并結(jié)合接觸角的測(cè)量結(jié)果對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）對(duì)所制備的涂層進(jìn)行了表征，獲得了一種抗蛋白質(zhì)非特異性吸附能力優(yōu)良的抗垢涂層。利用該方法在生物膜干涉?zhèn)鞲衅鞅砻嬷苽淞丝构竿繉?，?duì)其表面蛋白質(zhì)非特異性吸附進(jìn)行了評(píng)價(jià)；并在涂層表面固定了森林腦炎重組抗原，對(duì)森林腦炎患者血清樣品進(jìn)行了快速檢測(cè)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

冰乙酸（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；無水乙醇（優(yōu)級(jí)純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；Phe，Gly，Arg，Cys，Lys（北京百靈威科技有限公司）；APTES（98%，北京百靈威科技有限公司）；DVS（98%，北京中科拓展化學(xué)技術(shù)有限公司）；過氧化氫（30%，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的牛血清白蛋白（BSA-hrp，BOSSBIO）；硫酸（98%，北京化工廠）；四甲基聯(lián)苯胺（可溶型單組分TMB底物溶液，天根生化科技有限公司）；牛血清白蛋白 （BSA，98%，MELONEPHARMA）；人血清（human serum，99%，SIGMA）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，阿拉?。?；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，阿拉?。?；氨基乙醇（MEA，阿拉?。?/p>

森林腦炎重組抗原和森林腦炎病人血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。食人魚溶液：濃硫酸∶過氧化氫=3∶1（V/V），過氧化氫滴加至冰浴的濃硫酸中（注意：食人魚溶液對(duì)有機(jī)物有極強(qiáng)腐蝕性）；2%（V/V）APTES溶液：0.2 mL APTES溶于10 mL 95%乙醇中，并滴加1～2滴冰醋酸；10%（V/V）DVS溶液：1 mL DVS+8 mL PBS緩沖液+1 mL丙酮，調(diào)節(jié)pH到9.5；PBS緩沖液：磷酸鹽10 mmol/L，氯化鈉150 mmol/L，pH7.4；氨基酸溶液皆為50 mmol/L溶液。

1.2抗垢涂層的制備

硅基材料表面的抗垢涂層制備流程如圖1所示，將硅片切割為1 cm×1 cm樣品，用食人魚溶液90℃處理1 h，分別用水和乙醇洗滌兩次，N2吹干。然后將硅片浸入APTES溶液，30℃反應(yīng)16 h，分別用水和乙醇洗滌2次，N2吹干，130℃真空交聯(lián)4 h。將APTES處理樣品浸入DVS溶液25℃反應(yīng)12 h，分別用水和乙醇洗滌兩次，N2吹干。將DVS處理樣品分別浸入氨基酸溶液中25℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束分別用水和乙醇洗滌兩

次，N2吹干，避光保存。

圖1　硅基材料表面基于氨基酸的抗垢涂層制備流程Fig.1　The preparation scheme of the amino acid based antifouling coatings on silicon surface

1.3抗垢涂層的表征

采用Thermo Scientific ESCALAB 250Xi型X射線光電子能譜儀進(jìn)行X射線光電子能譜測(cè)試。XPS測(cè)試中使用帶單色器的鋁靶X射線源（Al Kα，hv=1486.6 eV），激發(fā)功率為150 W，光電子發(fā)射角為90°。樣品全譜分析范圍為0～1100 eV，步長(zhǎng)為1 eV；高分辨譜圖分析步長(zhǎng)為0.1 eV。元素結(jié)合能用沾污C 1s（284.9 eV）校正。

采用大恒DH-HV1351UM接觸角儀進(jìn)行靜態(tài)接觸角測(cè)試，測(cè)量時(shí)將2 μL超純水滴在樣品表面，采用切線法測(cè)定靜態(tài)接觸角，每個(gè)樣品重復(fù)三次取平均值。

1.4蛋白吸附實(shí)驗(yàn)

將樣品浸入BSA-hrp（1 μg/mL，pH7.4）溶液中，37℃孵育1.5 h，PBS洗滌2次，加入300 μL PBS溶液和 200 μL TMB溶液 37℃下孵育 5 min，加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定450 nm處吸光度。

1.5BLI傳感器探頭的抗垢性能評(píng)價(jià)

按照?qǐng)D 1所示，在 BLI傳感器（ForteBio，BLItz）的氨基探頭制備抗垢涂層，分別插入1 mg/mL BSA溶液，10%人血清中，對(duì)探頭的抗垢性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6BLI傳感器探頭森林腦炎重組抗原的固定

按照?qǐng)D1，在BLI傳感器的氨基探頭制備抗垢涂層，之后將含有抗垢涂層的探頭置于NHS/ EDC（0.5 mol/L，0.55 mol/L）溶液中4℃活化30 min，然后置于0.2 mg/mL的森林腦炎重組抗原溶液（pH7.4）中室溫反應(yīng)40 min。最后使用氨基乙醇 （50 mmol/L，pH9.5）封閉30 min，PBS洗滌2次，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.7森林腦炎血清樣品檢測(cè)

將固定有森林腦炎重組抗原的探頭安裝在BLI傳感器上，對(duì)森林腦炎患者的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定步驟如下:首先將探頭插入PBS緩沖液中測(cè)定基線30 s，然后依次插入10%森林腦炎患者血清樣品中120 s，對(duì)患者血清中森林腦炎抗體進(jìn)行檢測(cè)，之后插入PBS緩沖液中解離60 s。測(cè)定結(jié)束以100 mmol/L甘氨酸緩沖液再生BLI傳感器探頭。測(cè)定中通過2200 r/min震動(dòng)以維持樣品溶液的均勻分布。

2　結(jié)果與討論

2.1氨基酸的篩選

采用含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的牛血清白蛋白（BSA-hrp）評(píng)價(jià)多種氨基酸修飾涂層的蛋白質(zhì)非特異性吸附水平。BSA蛋白在涂層表面吸附量越少，對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶催化氧化的發(fā)色底物TMB則越少。如圖2所示，該實(shí)驗(yàn)選取多種氨基酸 （Phe、Gly、Arg、Cys、Lys），并采用乙醇胺（MEA）作為對(duì)照，進(jìn)行了蛋白吸附評(píng)價(jià)。乙醇胺處理過的樣品表面富含羥基，具有一定的抗垢能力，為陽(yáng)性對(duì)照組。較于未經(jīng)處理的硅片樣品，含有Phe涂層有更高的蛋白質(zhì)非特異性吸附，這是由于Phe分子中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的疏水性。經(jīng)過Gly，Arg，Cys、Lys處理過的樣品表面對(duì)蛋白的吸附有不定程度的降低，表明含有親水性氨基酸涂層表面具有抗垢能力。Arg、Cys、Lys涂層表面的蛋白非特異性吸附比MEA表面低，歸功于涂層表面的兩性離子結(jié)構(gòu)通過離子作用形成的水合層更加致密。其中Lys處理過的樣品具有最好的抗垢能力，因此選擇Lys進(jìn)行深入的性能研究。2.2賴氨酸鍵合條件的篩選

圖2　不同氨基酸對(duì)涂層抗垢性能的比較Fig.2　Comparation of antifouling ability between the coatings prepared with different amino acids

以賴氨酸為例，通過純水在樣品表面的靜態(tài)接觸角變化對(duì)氨基酸鍵合的最優(yōu)條件進(jìn)行篩選。DVS處理的表面呈疏水性，鍵合氨基酸之后，由于氨基與羧基的作用，表面變?yōu)橛H水性，在此過程中靜態(tài)接觸角會(huì)相應(yīng)發(fā)生降低。如圖3（a）所示，在pH≥9.5時(shí)樣品表面的接觸角明顯降低，表明在該條件下Lys鍵合效率較高。

為進(jìn)一步優(yōu)化氨基酸鍵和條件，使用BSA-hrp對(duì)在不同pH下Lys處理的樣品進(jìn)行蛋白吸附實(shí)驗(yàn)。如圖3（b）所示，在pH11.5條件下，Lys處理的樣品表面蛋白吸附量最少，pH9.5條件下次之。但是pH11.5溶液的堿性過強(qiáng)，可能會(huì)導(dǎo)致已有硅基修飾層的化學(xué)腐蝕。因此，結(jié)合接觸角測(cè)量結(jié)果，認(rèn)為pH9.5為L(zhǎng)ys的最優(yōu)反應(yīng)pH。

2.3涂層的XPS表征

為了檢測(cè)抗垢涂層制備過程中樣品表面化學(xué)的變化，以賴氨酸為例，對(duì)各步驟處理的樣品進(jìn)行了XPS表征。圖4（a）展示了各步驟修飾后樣品的XPS全譜（0～1100 eV），相較于未處理樣品，化學(xué)修飾后樣品表面碳元素信號(hào)（285 eV）有了明顯增強(qiáng)，且在410 eV附近出現(xiàn)了氮元素的信號(hào)，表明處理后樣品表面偶聯(lián)了有機(jī)分子。C 1s高分辨譜圖如圖4（b）所示，未處理的樣品表面C 1s信號(hào)很弱，表明其表面有機(jī)物含量很低。APTES烷基化后，樣品表面285.0 eV處C 1s信號(hào)明顯增強(qiáng)，并且在286.3 eV處出現(xiàn)了新的峰，該峰可以歸屬為APTES上與氨基相連的*CH2。DVS處理后，286.3 eV處C 1s峰增強(qiáng)，這是由于DVS與表面氨基反應(yīng)之后，與砜基相連的碳信號(hào)與*CH2NH2信號(hào)疊加造成的。Lys處理后，在288.5 eV出現(xiàn)了羧基碳原子信號(hào)峰，表明Lys成功連接在了硅片表面。該結(jié)果表明經(jīng)過APTES，DVS，Lys三步處理后，樣品表面成功構(gòu)筑了含有賴氨酸的涂層。

圖3?。╝）不同pH下Lys處理樣品的接觸角?。╞）不同pH下Lys處理樣品的蛋白質(zhì)吸附結(jié)果Fig.3　（a）The contact angles of the samples prepared with lysine at different pH.（b）The non-specific protein adsorption results of the samples prepared with lysine at different pH

圖4?。╝）未處理樣品，APTES烷基化樣品，DVS處理樣品，Lys處理樣品的XPS的全譜（b）未處理樣品，APTES烷基化樣品，DVS處理樣品，Lys處理樣品的C 1s高分辨譜圖Fig.4?。╝）XPS survey spectra and（b）high resolution C 1s spectra of bare Si sample，APTES-modified sample，DVS-modified sample and lysine-modified sample

2.4抗垢涂層的應(yīng)用

2.4.1賴氨酸抗垢涂層的實(shí)際效果評(píng)價(jià)

BLI是一種無需標(biāo)記的光學(xué)原理分析檢測(cè)技術(shù)。光在傳感器的生物膜上下界面形成的反射光發(fā)生干涉，形成干涉光譜。干涉光譜受生物膜層厚度的影響，當(dāng)傳感器表面發(fā)生生物大分子的吸附或解離，生物膜厚度發(fā)生變化，干涉光譜將相應(yīng)發(fā)生漂移。通過跟蹤干涉光譜的變化，可獲得表面上生物大分子吸附和解離的情況［28］。

對(duì)硅基的BLI傳感器探頭按照?qǐng)D1流程進(jìn)行修飾，制備含有Lys的抗垢涂層。分別使用1 mg/mL BSA，10%人血清樣品對(duì)探頭抗垢性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖5所示，具有抗垢涂層修飾的探頭，較于未經(jīng)修飾的探頭，BSA吸附量降低了98%，而人血清也下降了94%。上述蛋白質(zhì)吸附的明顯降低表明了含有Lys的抗垢涂層具有良好的抗垢能力。

圖5　（a）修飾賴氨酸抗垢涂層前后BLI傳感器對(duì)1 mg/mL BSA響應(yīng)信號(hào)的變化（b）修飾賴氨酸抗垢涂層前后BLI傳感器對(duì)10%人血清響應(yīng)信號(hào)的變化Fig.5　The differences in BLI response towards（a）1 mg/mL BSA and（b）10%human serum between the sensors with and without lysine-based antifouling coating

2.4.2BLI傳感器對(duì)森林腦炎患者血清樣品的檢測(cè)評(píng)價(jià)

森林腦炎（Tick Borne Encephalitis，TBE），是由黃病毒屬中蜱傳腦炎病毒導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病。森林腦炎的傳播媒介是蜱蟲，該疾病常見于草原和森林地區(qū)。臨床特征包括突起高熱、頭痛、意識(shí)障礙，約半數(shù)患者留有不同程度的后遺癥，表現(xiàn)為認(rèn)知語(yǔ)言障礙、共濟(jì)失調(diào)、頭痛、聽力喪失及脊神經(jīng)癱瘓等。該疾病發(fā)病快，后遺癥嚴(yán)重，所以臨床上的快速檢測(cè)尤為重要。

在含有抗垢涂層的探頭表面通過羧基活化固定森林腦炎重組抗原，在抗垢基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)森林腦炎抗體的雙功能化并應(yīng)用于森林腦炎患者診斷。如圖6（a）所示，傳感器探頭經(jīng)過30 s基線之后插入待測(cè)血清樣品，響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間升高，使用PBS洗滌仍有較好響應(yīng)，表明該探頭可以特異性檢測(cè)森林腦炎患者血清中的抗體，實(shí)現(xiàn)森林腦炎的診斷。使用三個(gè)含有抗垢涂層并固定有森林腦炎重組抗原的探頭分別對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)，三個(gè)探頭測(cè)試的結(jié)果基本相同，結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，表明使用該方法進(jìn)行森林腦炎檢測(cè)具有良好的重現(xiàn)性。

用修飾有森林腦炎抗原的探頭對(duì)5個(gè)血清樣品（#1，2，3，4號(hào)樣品為森林腦炎患者的血清，#5樣品為正常人血清）進(jìn)行檢測(cè)，并使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) （ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay）進(jìn)行驗(yàn)證。如圖6（b），（c）所示，BLI傳感器檢測(cè)結(jié)果與ELISA結(jié)果相吻合。ELISA法是森林腦炎病毒檢測(cè)的最常用技術(shù)方法，BLI傳感器檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果相吻合，表明了該方法可以用于森林腦炎疾病的診斷。并且對(duì)比ELISA實(shí)驗(yàn)，BLI檢測(cè)實(shí)際樣品消耗量?。? μL）、測(cè)試耗時(shí)短（3 min）。

3　結(jié)論

該文建立了一種基于氨基酸的抗垢涂層制備方法。通過APTES對(duì)樣品表面進(jìn)行硅烷化，以DVS作為偶聯(lián)劑，使天然氨基酸固定在硅基材料表面，制備出一個(gè)系列的抗垢涂層。通過蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)篩選出Lys具有良好的抗垢性能。結(jié)合接觸角的測(cè)量對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化了Lys偶聯(lián)反應(yīng)條件，其最佳反應(yīng)pH為9.5。將該方法應(yīng)用于BLI傳感器探頭，BSA和人血清的蛋白吸附量分別下降98%和94%。通過羧基活化的方法對(duì)含有Lys抗垢涂層的探頭進(jìn)行森林腦炎抗原固定，可以用于森林腦炎疾病的臨床快速診斷，其結(jié)果與最常用的ELISA檢測(cè)法相互印證。該方法構(gòu)建的基于天然氨基酸的抗垢涂層，制備簡(jiǎn)單，成本低廉，而且可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)特異性臨床診斷的雙功能，具有臨床應(yīng)用潛力。

圖6?。╝）三個(gè)探頭對(duì)同一樣品的檢測(cè)結(jié)果（b）BLI傳感器檢測(cè)森林腦炎病人血清樣品的結(jié)果（c）ELISA檢測(cè)森林腦炎病人血清樣品的結(jié)果Fig.6?。╝）The BLI responses of three sensors towards the same sample.（b）The normalized intensity of BLI responses and（c）ELISA tests towards the serum of the Tick Borne Encephalitis patients

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*通信聯(lián)系人，Tel：15941139319，E-mail：ffcheng@dlut.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（21104008）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（DUT15ZD232）

Amino acid based antifouling coating and quick diagnosis of tick borne encephalitis

Wang Zhuo-xiao1，Wang Han-qi1，Cheng Fang1*，Sun Dan-yi1，Kang Xiao-ping2，Yang Yin-hui2
（1.Pharmaceutical Science and Technology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China）
（2.State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China）

Abstract：Non-specific protein adsorption remains a critical challenging for the application of biosensors toward rapid detection of proteins in human serum samples.Here，by coupling amino acids to（3-aminopropyl）triethoxysilane （APTES）modified silicon surface with divinyl sulfone（DVS），we have developed a new antifouling coating for biosensors.Among different types of amino acids examined，lysine-coated surface was most effective in reducing protein adsorption.Furthermore，through contact angle measurements and protein adsorption studies，the optimal condition for lysine coating preparation was determined to be reacting with 50 mmol/L lysine at pH9.5.The lysinecoated surface was also characterized by X-ray photoelectron spectroscopy.Finally，as a proof-of-concept，we applied the lysine coating on Biolayer Interferometry for the detection of Tick Borne Encephalitis，with results comparable to those obtained from enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.It shows that，besides simplicity and low cost of the coating process，this new antifouling coating has great potential to promote clinical applications of biosensors for rapid and quantitative protein detection from serum samples.

Key words：antifouling；vinyl sulfone chemistry；amino acid；APTES；tick borne encephalitis