人乳頭瘤病毒HPV33型E6E7蛋白的表達(dá)及多克隆抗體的制備

盧鈞雄　段煉　王若倫　易俊波

518000,廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

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人乳頭瘤病毒HPV33型E6E7蛋白的表達(dá)及多克隆抗體的制備

盧鈞雄段煉王若倫易俊波

518000,廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

【摘要】目的表達(dá)人乳頭瘤HPV33型病毒癌蛋白E6E7，并免疫小鼠制備抗體。方法從HPV33型基因組中擴(kuò)增出E6 E7的基因片段，通過(guò)基因測(cè)序加以證實(shí)；將其克隆至原核表達(dá)載體pET28a中，在大腸埃希菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)HIS親核層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，收集重組蛋白免疫的小鼠陽(yáng)性血清，經(jīng)ProteinA/G親核層析柱純化得到多克隆抗體,同時(shí)將E6 E7克隆至真核表達(dá)載體pCDNA3.1/His C中，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，分別采用免疫熒光法和Western Blot檢測(cè)抗體的特異性。結(jié)果用得到高純度的重組蛋白E6、E7 制備的多克隆抗體，具有良好的特異性。結(jié)論這種高純度重組E6、E7蛋白和抗體有望用于HPV33型人乳頭瘤疾病的臨床檢測(cè)及發(fā)生機(jī)制的研究。

【主題詞】宮頸腫瘤；人乳頭瘤HPV33；E6 E7蛋白，多克隆抗體

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81403031)

人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的最重要的原因之一，它們?cè)谏衬[瘤的病因?qū)W中起著關(guān)鍵作用[1]。HPV是一類無(wú)包膜的DNA 病毒，通過(guò)感染上皮組織細(xì)胞，引起上皮組織的良惡性增生，HPV分為高危型HPV(如HPV16/18/31/33/58)和低危型(如HPV6/11)[2],其中高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要誘因[3]，受到HPV感染，就可能會(huì)發(fā)展為宮頸癌前病變，在癌變的過(guò)程中被認(rèn)為癌基因的E6、E7蛋白又是誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵因素[4-6]。

HPV病毒在殼體內(nèi)以環(huán)狀雙鏈DNA存在，全長(zhǎng)約為8 kb,其中E6、E7基因序列相當(dāng)保守，E6編碼大約150個(gè)氨基酸，E7蛋白由98個(gè)氨基酸組成。E6、E7基因在HPV整合狀態(tài)時(shí)，總是保留完整，也就是說(shuō)它們是病毒誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需的癌蛋白，其功能分別通過(guò)干擾宿主細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，如p53和pRB促進(jìn)永生化。E6蛋白的表達(dá)，與p53的相互作用，是造成被感染細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性的原因，E7蛋白則降解滅活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白(pRB)[7]，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。

我們克隆到HPV33型E6、E7基因，表達(dá)重組蛋白，得到多克隆抗體，經(jīng)檢測(cè)，多克隆抗體具有高度的特異性。

1材料與方法

1.1病毒、菌株和質(zhì)粒HPV33型病毒組織液由深圳市慢性病防治院贈(zèng)送，本研究室保存；宿主菌Rosetta、DH5α、表達(dá)載體pET28a、pCDNA3.1/His C由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、Ex Taq DNA聚合酶、BamHⅠ及EcoRⅠ購(gòu)于大連寶生物公司；DNA抽提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；DNA標(biāo)志物DL 2 000、十二烷基硫酸鈉(SDS-Na)、Tris堿、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)及氨芐青霉素系上海生工生物工程公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)標(biāo)志物購(gòu)于美國(guó)Biorad公司。

1.3擴(kuò)增E6 /E7 基因片段采用病毒基因組DNA提取試劑盒從HPV33型病毒組織液中提取HPV33病毒DNA，貯存于-20℃。設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增E6基因片段克隆入表達(dá)載體pET28a及pCDNA3.1/His C中， P1: 5’-AGCGGATCCTTTCAAGACACTGAGGAA-3’;P2: 5’-ATCGAATTCCAGTGCAGTTTCTCTACG-3’;

上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn),下游引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn);設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增E7基因片段克隆入表達(dá)載體pET28a及pCDNA3.1/His C中， P3: 5’-AGTGGATCCAGAGGACACAAGCCAACG-3’;P4: 5’-CATGAATTCTTGTTGTGCACAGGTAGG-3’;上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn),下游引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4序列分析特異性PCR產(chǎn)物純化后與pM18-T載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切目的基因片段的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a及pCDNA3.1/His C，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收，分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取單克降菌落，PCR鑒定成功后提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切進(jìn)一步鑒定質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6、 pET28a-HPV33-E7及pCDNA3.1/His C-HPV33-E6、pCDNA3.1/His C-HPV33-E7。

1.6E6 /E7重組蛋白的表達(dá)將獲得的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6、pET28a-HPV33-E7轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌Rosetta中，挑菌培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，裂解后，取上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.7表達(dá)蛋白的純化以搖瓶發(fā)酵pET28a-HPV33-E6/Rosetta和pET28a-HPV33-E7/Rosetta，離心收集1升菌體，超聲破碎，離心取上清以經(jīng)HIS親核層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度。

1.8小鼠多抗制備及純化分別取50 μg E6/E7純蛋白免疫小鼠，每種蛋白各免疫三只小鼠，免疫結(jié)束后以眼球取血法收集小鼠血清，小鼠血清用protein A柱進(jìn)行純化，最后將抗體加入50%后貯存于-20℃中。

1.9E6 /E7在真核細(xì)胞中表達(dá)平鋪293細(xì)胞于六孔板中至細(xì)胞密度達(dá)到80%，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，每孔中再加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基1.5 ml,取pCDNA3.1/His C-E6、pCDNA3.1/His C-E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解，收集蛋白，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.10多克隆抗體的特異性檢測(cè)分別取pCDNA3.1/His C-E6、pCDNA3.1/His C-E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞蛋白液20 μl，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜(NC膜)上，分別對(duì)應(yīng)加入制備的HPV33 E6/E7小鼠多抗,室溫?fù)u2 h后置于4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，以1∶40000比例加入羊抗鼠二抗(標(biāo)記HRP)(購(gòu)于吉泰公司)，室溫作用1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色。

1.11多克隆抗體與目標(biāo)蛋白E6E7的細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)293細(xì)胞，平鋪置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞濃度達(dá)到70%時(shí)，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/His C-HPV33-E6、pCDNA3.1/His C-HPV33-E7，24 h冰甲醇固定， PBSA穿膜，PBS清洗后每孔加入重組抗體反應(yīng)液(1∶500)200 μl，室溫靜止反應(yīng)1 h，PBS清洗后每孔加入鼠抗羊兩種熒光(Rhodamine,FITC)二抗反應(yīng)液(1∶500)200 μl，避光室溫反應(yīng)1 h后，PBS反復(fù)清洗，加入200 μl DAPI反應(yīng)液靜止5 min，純水反復(fù)沖洗，取出玻片壓片，置于共聚焦顯微鏡上觀察。

2結(jié)果

2.1E6/E7基因的擴(kuò)增取PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出特異的目的DNA片段，大小分別約440 bp和300 bp, 與預(yù)期的大小基本一致，初步證實(shí)PCR產(chǎn)物為目的基因片段，并且經(jīng)測(cè)序證實(shí)為正確的E6/E7基因。

2.2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7及pCDNA3.1/His C-HPV33-E6和pCDNA3.1/His C-HPV33-E7分別用相對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切，結(jié)果均切出與預(yù)期大小一致的基因片段(圖1)。

1, pET28a-HPV33-E6質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/ EcoRⅠ酶切;2,pCDNA3.1/His C-HPV33-E6質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ酶切；3, pET28a-HPV33-E7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/ EcoRⅠ酶切;4， pCDNA3.1/His C-HPV33-E7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ酶切鑒定圖1　重組質(zhì)粒的酶切鑒定1, pET28a-HPV33-E6 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠ；2 ,pCDNA3.1/His C-HPV33-E6 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠ；3 ,pET28a-HPV33-E7 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠ；4, pCDNA3.1/His C-HPV33-E7 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠFig.1　Identification of recombinant plasmids by restrictive enzyme digestion

2.3HPV33 E6/E7蛋白的原核表達(dá)及純化含有表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌的裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離、染色后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)的pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌在約Mr20000、Mr14000處各出現(xiàn)1條明顯新生蛋白帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌及空菌Rosetta在Mr處均沒(méi)有蛋白帶(圖2A)，可斷定此處 Mr20000、Mr14000蛋白帶為pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌的表達(dá)帶。以搖瓶發(fā)酵菌體，收集10克濕菌，以破碎緩沖液懸浮，經(jīng)過(guò)超聲破碎(3s/3s，500 W，15 min)，離心，上清經(jīng)HIS親核層析穿出，洗脫得到純品(圖2B)。

2A　重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 1. pET28a-HPV33-E7; 2. pET28a-HPV33-E6;2B　重組蛋白的純化 1. E6;2. E7圖2　重組HPV33 E6 E7蛋白的電泳及純化圖譜2A:1, pET28a-HPV33-E7 transformants with IPTG induction； 2, pET28a-HPV33-E6 transformants with IPTG induction； M, Protein molecular weight marker； 2B: 1,Purified pET28a-HPV33-E6 protein；2,Purified pET28a-HPV33-E7 protein；M, Protein molecular weight markerFig.2　SDS-PAGE of recombinants HPV33 E6 E7 proteins

2.4動(dòng)物免疫及多抗的制備以E6/E7純蛋白免疫小鼠制備多抗，經(jīng)與E6/E7純蛋白免疫印跡，均能夠產(chǎn)生抗體反應(yīng)(圖3)。

1：pCDNA3.1/His C-HPV33-E7細(xì)胞裂解液與E7抗體的Weston-Blot圖；2,3,4：pCDNA3.1/His C-HPV33-E6細(xì)胞裂解液與E6抗體的Weston-Blot圖3　HPV33E6/ E7抗體的免疫印跡1：Lysis buffer of pCDNA3.1/His C-HPV33-E7 with E7 antibody;2,3,4：Lysis buffer of pCDNA3.1/His C-HPV33-E6 with E6 antibodyM Protein molecular weight markerFig.3　Western Blot of HPV33 E6/ E7 antibodies

2.5抗體的細(xì)胞免疫學(xué)結(jié)果結(jié)果顯示，在細(xì)胞表面均能觀察到二抗的紅色和綠色熒光，說(shuō)明制備的抗體能夠和E7蛋白有效結(jié)合。

1,pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293細(xì)胞與抗體E7反應(yīng)后通過(guò)紅熒光鼠二抗顯色圖;2,pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293細(xì)胞與抗體E7反應(yīng)后通過(guò)綠熒光鼠二抗顯色圖;3,pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293細(xì)胞核染色圖;4,照片疊加圖(1，2，3合并圖)圖4　HPV E7抗體的細(xì)胞免疫學(xué)結(jié)果1, pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293 with E7 antibody by using goat anti-mouse IgG-Rhodamine as secondary antibody; 2, pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293 with E7 antibody by using goat anti-mouse IgG-FITC as secondary antibody;3, DAPI; 4, MERGEFig.4　Immunological result of HPV E7 antibody

3討論

HPV病毒感染中，HPV16型檢出率最高， HPV33型的檢出率位居第二，并且在感染HPV33型的病例中還伴隨著混合感染，所以對(duì)HPV病毒的研究必需采用聯(lián)合檢測(cè)和治療。對(duì)HPV病毒各亞型要進(jìn)一步深入研究和探討，目前對(duì)HPV病毒的檢測(cè)采用三種方法，第一種方法是對(duì)HPV抗原的檢測(cè)，第二種方法是HPV抗體的檢測(cè)，第三種方法則是HPV-DNA檢測(cè)，單一的檢測(cè)方法準(zhǔn)確率都達(dá)不到80%,但HPV抗原/抗體與HPV-DNA的聯(lián)合檢測(cè)則檢出準(zhǔn)確率達(dá)94.8%[8]。我們針對(duì)抗原抗體的研究入手[9]，將HPV33的癌蛋白E6E7作為研究對(duì)象，從臨床檢測(cè)作為出發(fā)點(diǎn)來(lái)研究HPV33型在疾病中的應(yīng)用。

我們從病毒樣本中克隆到HPV33 E6 E7基因，裝入到原核表達(dá)載體中并成功在大腸埃希菌中表達(dá)，通過(guò)純化得到純蛋白，通過(guò)免疫小鼠制備抗體，通過(guò)對(duì)抗體的檢測(cè)，我們采用兩種方法，一種是通過(guò)常規(guī)的Westen-Blot方法，發(fā)現(xiàn)E7抗體特異性和靈敏度均非常好，E6抗體靈敏度比較特異性方面差一些，我們將進(jìn)一步改進(jìn)。針對(duì)E7抗體我們進(jìn)一步用另一種方法來(lái)檢定，即通過(guò)細(xì)胞免疫學(xué)的方法在細(xì)胞水平上檢測(cè)，我們將目標(biāo)蛋白E7分泌表達(dá)在細(xì)胞膜上[10]，用制備的E7抗體進(jìn)行反應(yīng)，再通過(guò)兩種熒光二抗顯色，在共聚焦顯微鏡下可以清楚觀察到熒光，我們制備的抗體可以應(yīng)用于宮頸癌疾病的理論研究及臨床治療。

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通信作者：易俊波， Email: myspacebo@hotmail.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.021

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81403031)

(收稿日期：2015-11-17)

Preparation of the polyclonal antibody of human papillomavirus type HPV33 for E6E7

LuJunxiong,DuanLian,WangRuolun,YiJunbo

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou518000,ChinaCorrespondingauthor:YiJunbo,Email:myspacebo@hotmail.com

【Abstract】ObjectiveTo clone and efficiently express E6E7 proteins of human papilloma virus HPV33 in E.coli. The recombinant proteins were purified and immunized to mice, and polyclonal antibodies were purified. MethodsE6 and E7 genes of HPV33 were amplified by PCR using HPV33 human papilloma virus as template,and were sub-cloned into pET28a and pCDNA3.1 / His C vectors. The recombinant plasmids pET28a-HPV33 E6 and pET28a-HPV33 E7 were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain．We purified the recombinant proteins and immunized mice for preparing antibodies, and the polyclonal antibodies were purified. Moreover the plasmids pCDNA3.1 / His C-HPV33 E6 and pCDNA3.1 / His C-HPV33 E7 were transfected into 293 cells.The cells were used in immunofluorescence and Western-Blot to detect antibody specificity. ResultsThe recombinant proteins were successfully obtained, and the polyclonal antibody was prepared, which had good specificity. ConclusionThe recombinant proteins and antibodies may be used in the clinical detection and pathogenesis research of HPV33 type human papilloma disease.

【Key words】Cervix neoplasms； Human papillomavirus type 33(HPV33)；E6,E7 proteins；Polyclonal antibody