HPLC手性固定相法拆分阿普斯特對映體

張冬雷　高　瑛　宋　丹　王　璜　馬　蘭（天津合美醫(yī)藥科技有限公司　天津　300308）

HPLC手性固定相法拆分阿普斯特對映體

張冬雷高瑛宋丹王璜馬蘭（天津合美醫(yī)藥科技有限公司天津300308）

目的：建立新的高效液相色譜手性固定相法分離阿普斯特（Apremilast）的一對對映體?？疾炝鲃酉嘟M成、添加劑種類以及柱溫等對阿普斯特對映體分離的影響。方法：采用Chiralpak OJ-H（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；以正己烷-異丙醇（45∶55）為流動相；流速為1.0mL·min-1；檢測波長：254nm。結(jié)果：阿普斯特的兩個對映異構(gòu)體能得到良好的分離。結(jié)論：本方法操作簡便，快速，重復(fù)性良好，適合阿普斯特的對映體分離及光學(xué)純度的測定。

阿普斯特 HPLC手性固定相 對映體拆分

1引言

阿普斯特（Apremilast）是由美國細(xì)胞基因公司開發(fā)的具有抗炎作用的PDE4酶抑制劑，2014年3月21日經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于成人活躍型銀屑病性關(guān)節(jié)炎（PsA）的治療，同年9月23日，被FDA批準(zhǔn)用于治療中度至重度斑塊型銀屑?。╬laque psoriasis），具有廣闊的市場前景。根據(jù)文獻(xiàn)報道，其S型異構(gòu)體的活性要比R型至少高5倍［1］，因此阿普斯特是以S型進行臨床試驗并最終上市。美國細(xì)胞基因公司的專利中采用安捷倫公司的Ultron Chiral ES-OVS色譜柱分離阿普斯特對映異構(gòu)體［2］，該色譜柱為蛋白柱，使用條件限制較多，保存條件苛刻，壽命短；蒙發(fā)明等改用大賽璐的AS-H色譜柱建立了新的對映體測定方法［3］，并進行了方法學(xué)驗證，但該色譜柱為大賽璐第一代色譜柱，固定相是涂布在硅膠上，可使用的流動相種類有限，要求高，壽命往往較短。本文使用大賽璐的IA柱開發(fā)了新的方法，該色譜柱的固定相為硅膠鍵合型，較涂布型色譜柱穩(wěn)定性大大增加，有效解決了上述問題，也給阿普斯特的對映體測定提供了全新的選擇。

2材料和方法

2.1實驗材料：阿普斯特對照品（自制，批號為20140416，含量99.5%），阿普斯特對映體對照品（自制，20140418，含量99.9%）；正己烷，無水乙醇及異丙醇均為色譜純試劑（天津康科德科技有限公司）；二乙胺為分析純試劑（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

2.2儀器：LC-20A型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器（島津公司）。

2.3方法

2.3.1實驗色譜條件：色譜柱：Chiralpak IA（4.6mm×250mm，5μm，Daicel Chemical Industries，LTD，日本）；柱溫：35℃；流動相：正己烷-異丙醇（45∶55）；流速為：1.0mL·min-1；檢測波長：234nm；進樣量：20μL。

2.3.2樣品的配制：系統(tǒng)適用性溶液的配制：分別取阿普斯特對照品及阿普斯特對映體對照品500.12和10.01mg，置于同1個100mL量瓶中，加適量甲醇溶解后，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，可得含阿普斯特0.5001mg·mL-1及其對映體10.01μg· mL-1的溶液，作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。

3結(jié)果

3.1流動相的選擇：Chiralpak IA手性柱是將直鏈淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）通過共價鍵鍵合在硅膠表面制成，樣品分子與固定相之間的作用力主要是氫鍵作用、π-π作用、偶極-偶極作用及立體效應(yīng)。流動相通常選用烷烴加適量有機改性劑組成。對于弱堿性化合物，在流動相中加入二乙胺或三乙胺呈弱堿性，可使藥物離子化程度降低，更容易與固定相發(fā)生作用，有利于手性分離；對于弱酸性藥物則相反。因此采用正己烷為流動相主體，調(diào)節(jié)有機改性劑比例，必要時調(diào)節(jié)酸堿以改善分離。

3.1.1流動相中有機改性劑的種類對對映體保留和分離的影響：本文考察了流動相中分別以相同濃度的乙醇和異丙醇作為有機改性劑時對阿普斯特對映體分離的影響，結(jié)果見表1。從表中可見使用乙醇效果較差，異丙醇則可以使阿普斯特的兩個對映體得到良好的分離。使用異丙醇時兩對映體的保留更強，選擇性因子α更好，因此選擇異丙醇作為有機改性劑。

表1不同種類的醇對阿普斯特對映體分離的影響

3.1.2流動相中異丙醇的濃度對對映體保留和分離的影響：流動相中異丙醇的濃度對對映體保留和分離的影響見表2。從表中可見，當(dāng)異丙醇的濃度在50%～60%之間時，兩對映體均能得到良好的分離。隨著異丙醇濃度增加，容量因子（k1、k2）、分離度（R）明顯減小，但選擇性因子α幾乎不變。流動相中極性成分（異丙醇）與固定相之間形成的氫鍵作用，抑制對映體與固定相之間的相互作用，可降低手性柱的手性識別能力。因此減少流動相中極性成分使保留時間延長，有利于對映體的分離。異丙醇濃度低于50%時，由于保留時間延長，擴散作用使色譜峰展寬。異丙醇濃度過大，會加大柱壓，減少手性柱的使用壽命，綜合考慮，選擇流動相中異丙醇的濃度為55%。

表2流動相中異丙醇的濃度對阿普斯特對映體色譜參數(shù)的影響

3.1.3流動相中酸堿添加劑對對映體分離的影響：阿普斯特分子顯中性，理論上酸堿添加劑對對映體的分離作用不大，但考慮到手性分離原理的復(fù)雜性，本文也對酸堿添加劑對對映體分離的影響進行研究，結(jié)果見表3。從表中可見，酸堿添加劑對阿普斯特和其對映體的分離基本沒有影響，因此流動相中不添加酸堿添加劑。

表3流動相中酸堿添加劑對阿普斯特對映體色譜參數(shù)的影響

3.1.4柱溫對對映體分離的影響：在其他色譜條件一定的情況下，考察了柱溫的變化對對映體的k1、k2、α、R的影響，結(jié)果見表4。從表中可見，隨著溫度的升高，對映體的保留減弱，分離度有所下降。有關(guān)文獻(xiàn)報道，對映體的色譜分離受熱力學(xué)控制［4］，為焓驅(qū)動過程，即柱溫越低分離效果越好。在低溫時分子的旋轉(zhuǎn)和熱動力減弱，使其與手性固定相作用的機會及強度增加，提高了手性識別作用。但過低的柱溫會增加流動相的黏度，使色譜系統(tǒng)壓力增大。

表4溫度對阿普斯特對映體分離的影響

3.2方法的專屬性：在上述最佳色譜條件下，取系統(tǒng)適用性溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，在該色譜條件下阿普斯特對映體能夠達(dá)到完全分離，分離度為3.01，前一個色譜峰為R型異構(gòu)體。

3.3方法的重復(fù)性及檢測限：在上述最佳色譜條件下，進樣6次，兩對映體的保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2.0%，說明該方法的重復(fù)性良好。將系統(tǒng)適用性溶液進一步稀釋，當(dāng)信噪比（S/N）為3時，測得兩對映體的檢測限約為15ng。

4討論

本文建立了高效液相色譜手性固定相法分離阿普斯特對映異構(gòu)體，同時考察了有機極性調(diào)節(jié)劑的種類和濃度及柱溫等因素對分離的影響。本方法操作簡便，快速，重復(fù)性良好，為分離阿普斯特對映異構(gòu)體及測定其光學(xué)純度提供了新的選擇。

［1］Hon-Wah Man，Peter Schafer，Lu Min Wong，et al.Discovery of （S）-N-｛2-［1-（3-Ethoxy-4-methoxy-phenyl）-2-methanesulfonylethyl］-1，3-dioxo-2，3-dihydro-1H-isoindol-4-yl｝acetamide （Apremilast），a potent and orally active phosphodiesterase 4 and tumor necrosis factor-α inhibitor［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2009，52（6）：1522-1524.

［2］喬治·W·穆勒，彼得·H·謝弗，漢華曼，等.包含（+）-2-［1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-甲基磺?；一?4-乙酰基氨基異吲哚啉-1，3-二酮的固體形式、其組合物及其用途.美國.專利申請?zhí)枺篊N200880129462［P］.公開日：2011.05.04.

［3］蒙發(fā)明.HPLC法測定阿普斯特對映異構(gòu)體［J］.化工中間體，2015（3）：37-38.

［4］翁文，林文士，熊雪珠，等.纖維素型手性固定相拆分亞砜系列化合物［J］.分析化學(xué)，2006，34（6）：805-808.

High performance liquid chromatographic separation of Apremilast using chiral column

Objective：A new method for the separation of Apremilast enantiomers was developed using high performance liquid chromatography with a chiral column as the stationary phases.The composition of mobile phase，types of mobile phase additives and column temperature were optimized to get better resolution.Methods：A Chiralpak IA（4.6mm×250mm，5μm）column was used，and the mobile phase was composed of hexane-isopropanol（45∶55）with a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 254nm. Results：Good baseline separation of Apremilast could be achieved under the optimized conditions.Conclusion：This method was simple，rapid，considerably reproducible and suitable for the enatiomers separation and the optical purity determination of Apremilast.

Apremilast High performance liquid chromatography（HPLC）Chiral column Enantioseparation

R927

B

1672-8351（2016）08-0109-03