C aspase-3、D I APH-3蛋白在浸潤性乳腺癌中的作用研究*

張玲玲，張亞男，耿翠芝，丁妍，楊會釵，馬力，劉月平

（1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 病理科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院 功能科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 乳腺中心，河北 石家莊 050011）

臨床論著

C aspase-3、D I APH-3蛋白在浸潤性乳腺癌中的作用研究*

張玲玲1，張亞男2，耿翠芝3，丁妍1，楊會釵1，馬力3，劉月平1

（1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 病理科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院 功能科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 乳腺中心，河北 石家莊 050011）

目的探討浸潤性乳腺癌組織中C as pas e-3、D IAPH-3蛋白的表達與臨床病理特征及預后的關系。方法采用免疫組織化學El i Vi s i on法檢測C as pas e-3、D IAPH-3在浸潤性乳腺癌（n=240）及癌旁組織（n=44）中的表達情況，并分析其與臨床病理特征及預后的關系。結果C as pas e-3、D IAPH-3在浸潤性乳腺癌組織中表達的陽性率（36.7%和40.8%）低于癌旁組織（81.8%和86.7%），P＜0.05。C as pas e-3的陽性表達率隨淋巴結轉移數的增多、腫瘤長徑的增加、臨床分期的提高、脈管瘤栓的產生及P53的陽性表達的增強而降低。D IAPH-3的表達隨淋巴結轉移數的增加、脈管瘤栓的產生及臨床分期的提高而降低。Kapl an-M ei er單因素生存分析顯示C as pas e-3和D IAPH-3蛋白陽性組患者的5年生存率（95.5%、95.8%），高于陰性組（85.5%、84.5%）。C O X多因素生存分析顯示D IAPH-3陰性表達與患者不良預后正相關（O R＾=1.687，95%C I:1.032，2.758）。結論浸潤性乳腺癌組織中C as pas e-3、D IAPH-3蛋白表達均低于癌旁正常乳腺組織，兩者均與乳腺癌的進展及預后密切相關，但兩者之間無關聯；D IAPH-3的低表達提示患者預后不良，可能是預測乳腺癌患者預后的獨立因素之一。

浸潤性乳腺癌；C as pas e-3；D IAPH-3；預后

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，普遍認為其發(fā)生、發(fā)展及預后是一個多因素、不同基因共同參與下的復雜病理過程。腫瘤細胞凋亡及增殖的失衡，促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Caspase-3是Caspase家族的重要成員，是細胞凋亡過程中的關鍵效應因子，參與多種因素誘導的細胞凋亡。近來研究顯示Caspase-3在多種惡性腫瘤中表達均低于正常組織，并且是預測腫瘤預后的有效因子之一［1-4］。DIAPH-3屬于Form i n蛋白家族，是構成細胞骨架的肌動蛋白結合蛋白，其具有催化肌動蛋白單體成核及促進肌動蛋白絲延伸的作用。研究發(fā)現，DIAPH-3蛋白在癌細胞中表達下調或缺失使細胞侵襲、轉移能力明顯增強［5］。兩者的表達與乳腺癌預后的關系如何國內外報道較少，本研究探討乳腺癌中Caspase-3及DIAPH-3的表達情況與患者臨床病理特征及預后的關系，以期為乳腺癌的防治及預后評估提供新的初步實驗依據。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取2009年1月1日-2009年12月31日于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院原發(fā)浸潤性乳腺癌患者手術切除后的乳腺癌組織240例，腫瘤組織經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，所有患者術前均未接受過正規(guī)放、化療及內分泌等治療，并有完整的臨床隨訪資料，以電話方式隨訪，隨訪時間自手術之日起到末次隨訪日，隨訪率100%。按照國際抗癌聯盟和美國癌癥聯合會聯合發(fā)表的第七版臨床分期進行分期。所有患者均為女性，年齡20～83歲，中位年齡51歲，Ⅰ期病理32例，Ⅱ期病理178例，Ⅲ期病理30例。

1.2主要試劑

El i Vi si on二抗及DAB顯色試劑盒由福州邁新生物技術有限公司提供，兔抗人Caspase-3及兔抗人DIAPH-3多克隆抗體分別購自Prot ei nt ech和北京西雅金橋生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學El i Vi s i on法石蠟包埋的組織，4μm連續(xù)切片，行H E染色和免疫組織化學染色。采用高壓法進行抗原修復，嚴格按說明書步驟操作，每次免疫組織化學染色均設同步陽性和陰性對照（Caspase-3陽性對照為肺腺癌組織，DIAPH-3陽性對照為宮頸鱗狀細胞癌組織，陰性對照均用PBS代替一抗）。

1.3.2結果判讀標準光鏡下觀察，40倍物鏡鏡下隨機選取10個以上視野范圍，每個視野范圍200個以上細胞，染色強度標準：無色為0分；淺黃色：1分；棕黃色顆粒：2分；棕褐色顆粒：3分。染色程度均須與背景對照。陽性細胞百分比標準：陰性為0分；陽性細胞≤10%：1分；11%～25%：2分；26%～50%：3分；≥50%：4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分為免疫反應陽性［6］。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，等級資料應用四格表χ2檢驗，組間相關性用Spearm an秩相關分析，單因素生存分析用Kapl an-M ei er法，多因素生存分析用COX比例風險模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1C aspase-3及D I APH-3蛋白在正常乳腺及浸潤性乳腺癌組織中的表達

在正常乳腺組織和浸潤性乳腺癌組織中Caspase-3免疫陽性反應產物呈淡黃色或棕色顆粒狀，主要位于胞漿，胞核內也可見著色。DIAPH-3的表達呈淡黃色或棕黃色，主要位于胞漿和胞膜（見圖1）。正常乳腺組織和乳腺癌組織中Caspase-3陽性表達率分別為81.8%（36/44）和36.7%（88/240），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.408，P＜0.05）；DIAPH-3的陽性表達率分別為86.7%（38/44）和40.8%（98/240），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.444，P＜0.05）。

圖1　C aspase-3和D I APH-3在正常乳腺導管上皮及浸潤性乳腺癌組織中的陽性表達 （El i Vi si on×20）

2.2浸潤性乳腺癌中D I APH-3及C aspase-3蛋白的表達與臨床病理特征的相關性

Caspase-3在無淋巴結轉移組、1～3個淋巴結轉移組、3個以上淋巴結轉移組的陽性表達率分別為50.0%、41.4%和3.4%，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即Caspase-3的表達與淋巴結轉移有關。腫瘤長徑≤2.5 cm組和＞2.5 cm組的陽性率分別為47.8%和21.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有脈管瘤栓組的陽性表達率為43.8%，無脈管瘤栓組的陽性表達率為22.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Caspase-3的P53陽性組的陽性表達率為27.3%，陰性組的陽性表達率為44.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Caspase-3在乳腺癌組織中的表達與P53負相關；臨床分期Ⅰ期陽性率為62.5%，Ⅱ期40.0%，Ⅲ期13.3%，差異有統(tǒng)計學意義，即臨床分期越晚，Caspase-3的陽性表達率越低。而其表達與患者的年齡、腫瘤的分化程度及ER/PR/H ER2的陽性率無關（P＞0.05）（見表1）。

DIAPH-3在無淋巴結轉移組、1～3個淋巴結轉移組、3個以上淋巴結轉移組的陽性表達率分別為53.2%、41.4%和13.8%，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即DIAPH-3的表達與淋巴結轉移有關。有脈管瘤栓組的陽性表達率為55.0%，高于無脈管瘤栓組的陽性表達率12.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示DIAPH-3低表達有可能促進腫瘤的侵襲和轉移。臨床分期Ⅰ期陽性率為50.0%，Ⅱ期為42.7%，Ⅲ期為20.0%，差異有統(tǒng)計學意義，即臨床分期越晚，DIAPH-3的陽性表達率越低。其表達與ER/ PR/H ER2及P53的陽性率無關（P＞0.05）（見表1）。

2.3浸潤性乳腺癌中C aspase-3與D I APH-3蛋白表達的相關性

88例Caspase-3蛋白陽性表達患者中，DIAPH-3陽性表達36例，陽性表達率為40.9%（36/88）；152 例Caspase-3蛋白陰性表達患者中，DIAPH-3的陽性表達62例，陽性表達率為40.8%（62/152），經Spearm an秩相關分析，兩者無相關（P＞0.05）。

表2　浸潤性乳腺癌患者C aspase-3與D I APH-3蛋白不同表達組的5年生存率比較

圖2　C aspase-3蛋白陰性組與陽性組5年生存率的比較

2.4浸潤性乳腺癌中D I APH-3及C aspase-3蛋白的表達與患者預后的關系

單因素生存分析結果表明，浸潤性乳腺癌患者中，Caspase-3和DIAPH-3蛋白陽性者5年生存率為95.5%和95.8%，高于陰性組的85.5%和84.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2），兩者均為影響浸潤性乳腺癌預后的因素，提示檢測患者乳腺癌組織Caspase-3和DIAPH-3的表達將可能有助于臨床評價患者預后和治療（見圖2、3）。COX多因素生存分析顯示，DIAPH-3的表達是影響浸潤性乳腺癌預后的獨立指標之一（見表3）。

表1　免疫組織化學檢測C aspase-3和D I APH-3蛋白表達與臨床病理特征的關系

圖3　D I APH-3蛋白陰性組與陽性組5年生存率的比較

表3　240例浸潤性乳腺癌患者預后影響因素的C O X多因素分析結果

3　討論

細胞的增殖和凋亡失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個重要環(huán)節(jié)。Caspase-3作為凋亡家族的重要執(zhí)行者之一，在調亡下游發(fā)揮重要作用［7］。有關浸潤性乳腺癌組織中Caspase-3的表達情況觀點不一，李良宏等［8］認為乳腺癌組織中Caspase-3表達降低，且低表達的患者預后較差，并且與腫瘤的TNM分期和淋巴結轉移情況密切相關，是預測乳腺癌患者預后的獨立因素之一。薛書霞等［9］的研究結果顯示，Caspase-3蛋白在癌組織中的陽性表達率明顯低于乳腺增生和乳腺癌旁組織，并隨著臨床分期增加其陽性表達率下降。但王進京等［10］研究顯示Caspase-3在乳腺癌組織中表達陽性率升高。本研究結果表明，乳腺癌組織中Caspase-3蛋白的陽性表達率為36.7%，明顯低于癌旁正常組織的陽性表達率81.8%（P＜0.05），提示Caspase-3蛋白低表達促進乳腺癌細胞的異常增殖，與乳腺癌的發(fā)生密切相關。與臨床病理特征的相關性研究顯示，Caspase-3蛋白表達與患者淋巴結轉移數相關，淋巴結轉移數＞3個以上的病例的Caspase-3陽性表達率較無淋巴結轉移和0～3個淋巴結轉移患者明顯降低；有脈管瘤栓組Caspase-3蛋白的陽性表達率低于無脈管瘤栓者；Caspase-3蛋白陰性表達的患者腫瘤長徑越長，臨床分期較晚，同時本研究還發(fā)現，Caspase-3蛋白的表達與P53表達呈負相關，結論與東星等［11］的研究結果一致。本實驗研究結果提示，Caspase-3蛋白表達降低或缺失使浸潤性乳腺癌細胞的凋亡受到抑制，增殖、凋亡失衡，從而促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展；通過對Caspase-3活性測定，可能進一步了解乳腺癌發(fā)生、發(fā)展特點，對乳腺癌的診治和預后評估具有一定的作用，但COX多因素分析顯示，Caspase-3并非是浸潤性乳腺癌臨床預后判斷的獨立指標。

DIAPH-3為肌動蛋白結合蛋白，參與多種生物學過程，如細胞吞噬、微管穩(wěn)定及胞質分裂等，與肌動蛋白以及Ras基因同源物的GTP酶結合，具有促進肌動蛋白聚集、刺激細胞分裂、催化激動蛋白單體成核和促進肌動蛋白絲延伸的作用。有研究表明，在腫瘤侵襲、轉移和分化等病理狀態(tài)下，DIAPH-3表達失調，通過與Rho激酶結合在細胞的侵襲過程中扮演重要角色［12］。在乳腺癌細胞中DIAPH-3蛋白表達下調或缺失。構建DIAPH-3穩(wěn)定沉默表達載體，通過沉默DIAPH-3，發(fā)現DIAPH-3干擾后不穩(wěn)定的微管蛋白生成，細胞侵襲、轉移能力比沉默DIAPH-3前明顯增強［13］。You等［14］在前列腺癌細胞的研究中發(fā)現，DIAPH-3沉默導致干細胞向變形細胞的轉變，同時也引起癌細胞的轉移、侵襲。本研究結果顯示DIAPH-3表達減弱或缺失與浸潤性乳腺癌患者的淋巴結轉移數，是否有脈管瘤栓出現呈正相關。提示DIAPH-3表達減弱或缺失誘導浸潤性乳腺癌侵襲及轉移。與此同時，DIAPH-3陰性表達患者臨床分期較晚，提示DIAPH-3表達減弱或缺失促進了浸潤性乳腺癌的進展。Kapl an-M ei er單因素生存分析顯示DIAPH-3陰性表達組患者5年生存率為84.5%，低于陽性組的95.8%（P＜0.05）。COX模型多因素生存分析發(fā)現，DIAPH-3陰性表達組患者不良預后的風險是陽性組患者的 1.687倍（95%CI=1.032，2.758），并且不依賴患者其他臨床特征，可作為評估浸潤性乳腺癌患者預后的獨立指標。但其作用機制有待實驗進一步證實。

綜上所述，Caspase-3及DIAPH-3蛋白的低表達促進了浸潤性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但其機制仍不十分清楚，深入探討乳腺癌中DIAPH-3及Caspase-3的作用及機制，有望為乳腺癌的防治及預后評估提供有意義的理論依據。

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（申海菊編輯）

Role of caspase-3 and DIAPH3 in invasive breast cancer*

Ling-ling Zhang1，Ya-nan Zhang2，Cui-zhi Geng3，Yan Ding1，Hui-chai Yang1，Li Ma3，Yue-ping Liu1
（1.Department of Pathology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050011，China；2.Department of Functional Examination，the People's Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang，Hebei 050011，China；3.Center of Breast Diseases，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050011，China）

Objective To study the possible association of the expressions of caspase-3 and diaphanous related formin 3（DIAPH3）protein with clinicopathological features and prognosis in invasive breast cancer. Methods The expressions of caspase-3 and DIAPH3 protein in invasive breast cancer tissues from 240 cases and para-cancerous tissues from 44 cases were detected by immunohistochemical EliVision method，and then their relationships with the clinicopathological features and prognosis were analyzed.Results The positiveexpression rates of caspase-3 and DIAPH3 protein in the invasive breast cancer tissues（36.7%and 40.8% respectively）were significantly lower than those in the para-cancerous tissues（81.8%and 86.7%respectively，P＜0.05）.The expression of caspase-3 was negatively correlated with the number of lymph node metastasis，tumor size，advanced tumor clinical stage，vascular tumor embolus and positive expression of P53.The expression of DIAPH3 was also negatively correlated with the number of lymph node metastasis，vascular tumor embolusand advanced tumor clinical stage.Kaplan-Meier single factor analysis showed that the 5-year survival rates in the patients with positive expressions of caspase-3 and DIAPH3 were 95.5%and 95.8%respectively，significantly higher than those in the negative-expression patients（85.5%and 84.5%respectively）.The Cox model analysis showed that the negative expression of DIAPH3 might be a risk factor for the prognosis of invasive breast cancer（O R＾=1.687，95%CI:1.032，2.758）.Conclusions The negative expressions of caspase-3 and DIAPH3 protein are important for the development and prognosis ofinvasive breast cancer，but there is no correlation between them.The low expression of DIAPH3 is probably one of the independent factors of prognosis in breast cancer.

invasive breast cancer；caspase-3；DIAPH3；prognosis

R 737.9文獻識別碼：A

1005-8982（2016）05-0036-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.008

2015-09-16
*

河北省自然科學基金（No：H 2015206230）

劉月平，E-m ai l：annam a@163.com，Tel：0311-89065374