E3泛素連接酶Siah-1與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的關(guān)系研究

谷巍，張雪坤，趙正歷，孫殿靜，路玉李，耿建林

（河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 衡水 053000）

E3泛素連接酶Siah-1與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的關(guān)系研究

谷巍，張雪坤，趙正歷，孫殿靜，路玉李，耿建林

（河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 衡水 053000）

目的探討E3泛素連接酶Si ah-1與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的關(guān)系。方法器官浴槽和血管張力系統(tǒng)測定雄性C 57BL/6小鼠，以及雄性db/db糖尿病小鼠的離體胸主動脈血管張力；蛋白質(zhì)印跡法（W es t ern bl ot）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定小鼠Si ah-1和連環(huán)蛋白（β-cat eni n）水平。結(jié)果糖尿病小鼠離體胸主動脈血管對乙酰膽堿（Ach）引發(fā)的舒張反應(yīng)低于正常小鼠（t=24.270，P=0.000），Si ah-1抑制劑孵育30 m i n的糖尿病小鼠對Ach引發(fā)的舒張反應(yīng)與正常小鼠無明顯差異（t=1.991，P=0.327）。各組小鼠對硝普鈉（SN P）引發(fā)的血管舒張呈現(xiàn)良好的反應(yīng)，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.145，P=0.541）。經(jīng)Si ah-1抑制劑處理的糖尿病小鼠Si ah-1濃度明顯降低（t=5.483，P=0.017），而β-cat eni n濃度明顯升高（t=6.670，P=0.023）。在有β-cat eni n抑制劑的情況下，使用Si ah-1抑制劑的糖尿病小鼠血管內(nèi)皮舒張反應(yīng)明顯低于正常小鼠（t=1.441，P=0.378）。結(jié)論E3泛素連接酶Si ah-1參與了糖尿病血管內(nèi)皮損傷的過程，其機制可能與對β-cat eni n信號通路的影響有關(guān)。

E3泛素連接酶Si ah-1；糖尿病；血管內(nèi)皮損傷

研究表明，血管內(nèi)皮功能損傷是糖尿病血管并發(fā)癥的始動因素，也是造成糖尿病患者致殘致死的重要原因［1-2］。E3泛素連接酶Si ah-1具有多種生物功能，可與多種不同底物蛋白結(jié)合，將其泛素化并通過蛋白酶體途徑降解，從而參與細胞周期調(diào)控和細胞分化凋亡等過程［3-5］。關(guān)于Si ah-1的研究雖然很多，但有關(guān)Si ah-1與糖尿病血管內(nèi)皮細胞功能損傷的研究尚缺乏詳細報道。據(jù)文獻調(diào)研，Si ah-1能夠介導β-cat eni n蛋白的泛素化和降解，而β-cat eni n能夠調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡，推測Si ah-1可能通過β-cat eni n信號通路引起血管內(nèi)皮損傷［6］。本研究旨在探討Si ah-1在糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料與動物

1.1.1實驗材料M yograph血管張力系統(tǒng)620M（丹麥DM T公司），M acLabA/D張力換能器和PowerLab信號系統(tǒng)（澳大利亞PowerLab公司），乙酰膽堿（Acet yl chol i ne，Ach）、去氧腎上腺素（Phenyl ephri ne，Phe）和硝普鈉（sodi um ni t roprussi de，SNP）（美國Si gm a公司），Si ah-1抑制劑和β-cat eni n抑制劑（美國St em RD公司），Si ah-1一抗、兔抗鼠Si ah-1二抗和 β-cat eni n酶聯(lián)免疫吸附法（enzym e-l i nked i m m unosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Sant a Cruz公司）。

1.1.2實驗動物雄性C57BL/6小鼠，以及雄性db/ db糖尿病小鼠，均購自上海斯萊克實驗動物中心。購回后飼養(yǎng)于本院實驗動物中心，維持室溫（20±2）℃，相對濕度60%。本實驗遵循《實驗動物保護條例》，對實驗動物進行嚴格的檢驗檢疫和飼育管理。

1.2方法

1.2.1離體胸主動脈血管環(huán)準備小鼠吸入二氧化碳CO2處死，迅速取胸主動脈血管，置于4℃含有5%CO2和95%氧O2混合氣體的改良Krebs液（pH= 7.4，氯化鈉NaCl=119.0m m ol/L，氯化鉀KCl=4.7m m ol/L，碳酸氫鈉NaH CO3=25.0m m ol/L，磷酸二氫鉀KH2PO4= 1.2 m m ol/L，氯化鈣CaCl2·2H2O=2.5 m m ol/L，氯化鎂M gCl2·6H2O=1.0 m m ol/L，葡萄糖=11.0 m m ol/L），小心分離主動脈血管周圍附著的脂肪和結(jié)締組織，然后剪成2～3 m m長的血管環(huán)。通過2根細不銹鋼絲將血管環(huán)懸掛于預先裝有20 m l改良Krebs液的器官浴槽，維持溫度37℃，并持續(xù)通5%CO2和95%O2混合氣體。1根鋼絲連接肌張力換能器，另1根鋼絲固定于標本架，調(diào)節(jié)血管環(huán)靜息張力至2.0 g，平衡90 m i n。在Krebs液中加入6×10-2m ol/L的KCl溶液，引發(fā)血管收縮以檢測血管收縮功能，然后沖洗、平衡3次。實驗前，加入10-6m ol/L Phe引發(fā)血管收縮，再加入1×10-6m ol/L的Ach以檢測血管內(nèi)皮舒張功能，選擇舒張＞80%的胸主動脈血管環(huán)用于張力測定。

1.2.2離體血管張力測定①調(diào)節(jié)血管環(huán)靜息張力至2.0 g，平衡90 m i n。在Krebs液中加入1×10-6m ol/L 的Phe，待血管收縮穩(wěn)定后，按1×10-9～1×10-4m ol/L的濃度依次加入Ach（或者依次加入1×10-10～1× 10-5m ol/L SNP），記錄每一濃度下主動脈環(huán)的張力。②在Krebs液中加入1×10-6m ol/L Si ah-1抑制劑預處理血管30 m i n，再加入1×10-6m ol/L Phe，待血管收縮穩(wěn)定后，按1×10-9～1×10-3m ol/L濃度依次加入Ach，記錄每一濃度下主動脈環(huán)的張力。③在Krebs液中加入1×10-6m ol/L的β-cat eni n抑制劑和Si ah-1抑制劑預處理血管30 m i n，再加入1×10-6m ol/L Phe，待血管收縮穩(wěn)定后，按1×10-9～1×10-3m ol/L濃度依次加入Ach，記錄每一濃度下主動脈環(huán)的張力。

1.2.3W es t ern bl ot檢測SIAH-1水平提取小鼠血管內(nèi)皮細胞蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取50μg等量總蛋白上樣，恒壓80 V過濃縮膠，恒壓120 V過分離膠，電泳分離。恒壓80 V轉(zhuǎn)膜2 h至硝酸纖維膜。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（t ri s buf f ered sal i neand t ween 20，TBST）淋洗3×10 m i n，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗，4℃孵育過夜。第2天，TBST淋洗3×10 m i n。熒光二抗，37℃下孵育1 h。TBST淋洗3×10 m i n，增強化學發(fā)光法（enhanced chem i l um i nescence，ECL）顯色。采用圖像分析軟件，以β-act i n為內(nèi)參，進行光密度值分析。

1.2.4ELISA檢測β-cat eni n水平提取小鼠血管內(nèi)皮細胞，按照β-cat eni n ELISA試劑盒說明書操作，測定β-cat eni n水平。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Si ah-1在離體胸主動脈血管內(nèi)皮舒張中的作用

選擇內(nèi)皮功能完好的胸主動脈血管環(huán)進行張力測定。加入Phe預收縮血管，再加入Ach或SNP引發(fā)血管舒張，比較各組小鼠對Ach引發(fā)的血管舒張反應(yīng)，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.731，P=0.032），其中糖尿病小鼠離體胸主動脈血管對Ach引發(fā)的舒張反應(yīng)明顯低于正常小鼠（t=24.270，P=0.000），而經(jīng)過Si ah-1抑制劑孵育30 m i n的糖尿病小鼠對Ach引發(fā)的舒張反應(yīng)與正常小鼠無明顯差異（t=1.991，P=0.327），提示Si ah-1抑制劑可改變糖尿病小鼠對Ach引起的血管舒張反應(yīng)。

各組小鼠對SNP引發(fā)的血管舒張呈現(xiàn)良好的反應(yīng)，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.145，P=0.541），提示糖尿病小鼠出現(xiàn)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損。見表1。

表1　小鼠離體胸主動脈血管舒張功能測定

2.2Si ah-1對β-cat eni n信號通路的影響

在前面的實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)Si ah-1抑制劑可改變糖尿病小鼠對Ach引發(fā)的血管舒張反應(yīng)。Si ah-1抑制劑處理糖尿病小鼠后，采用W est ern bl ot和ELISA檢測Si ah-1和β-cat eni n的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Si ah-1抑制劑處理的糖尿病小鼠Si ah-1濃度降低（t=5.483，P=0.017），而β-cat eni n濃度升高（t= 6.670，P=0.023），提示Si ah-1可能影響糖尿病小鼠β-cat eni n水平（見附圖和表2）。為進一步研究Si ah-1對β-cat eni n通路的影響，采用β-cat eni n抑制劑處理糖尿病小鼠，以阻斷β-cat eni n信號通路，再采用Si ah-1抑制劑處理該糖尿病小鼠，然后取離體胸主動脈血管測定血管張力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用β-cat eni n抑制劑的情況下，Si ah-1抑制劑無法改變糖尿病小鼠對Ach引起的血管舒張反應(yīng)（t= 1.441，P=0.378）（見表3）。以上結(jié)果提示，Si ah-1可能通過β-cat eni n信號通路參與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的過程。

附圖　W est ern bl ot檢測Si ah-1水平

表2　ELI SA檢測β-cat eni n水平 （n=10，pg/m l，±s）

表2　ELI SA檢測β-cat eni n水平 （n=10，pg/m l，±s）

組別P值糖尿病小鼠　3 3 . 4 ± 3 . 5 　6 . 6 7 0 　0 . 0 2 3 S i a h -1抑制劑糖尿病小鼠　4 5 . 1 ± 4 . 3 β -c a t e n i n t 值

表3　Ach引發(fā)的小鼠離體胸主動脈血管舒張 （n=10，%，±s）

表3　Ach引發(fā)的小鼠離體胸主動脈血管舒張 （n=10，%，±s）

組別P值糖尿病小鼠　1 8 . 7 ± 5 . 3 1 . 4 4 1 　0 . 3 7 8 β -c a t e n i n / S i a h -1抑制劑糖尿病小鼠　2 2 . 3 ± 5 . 9最大舒張反應(yīng)t 值

3　討論

Si ah家族蛋白是一類由40～80個氨基酸組成的，具有高度保守性的蛋白［7］。其中Si ah-1蛋白含有一個Ri ng-dom ai n結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有E3泛素連接酶的功能，可以介導β-cat eni n、腺癌息肉病基因（adenom at ous pol yposi s col i gene，APC）、c-M yb等多種蛋白質(zhì)經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑降解［8-9］。Si ah-1具有多種生物學功能，有研究發(fā)現(xiàn)其具有腫瘤抑制因子的作用，可通過P21W af-1/Ci p-1途徑抑制腫瘤細胞的增殖，可通過P53調(diào)節(jié)細胞凋亡［10-11］。而有關(guān)Si ah-1與糖尿病血管內(nèi)皮細胞功能損傷的研究尚缺乏詳細報道。β-cat eni n是由781個氨基酸組成的細胞黏附分子，是W nt信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，對細胞的增殖和分化起著重要的調(diào)控作用［12-13］。有研究顯示，β-cat eni n可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡及促進其增生，以改善受損的血管內(nèi)皮功能［14］。

本研究結(jié)果顯示，Si ah-1抑制劑可以有效改變糖尿病小鼠對Ach引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。因為Si ah-1可以介導β-cat eni n的泛素化和降解，因此筆者推測Si ah-1對血管內(nèi)皮功能的作用可能與β-cat eni n有關(guān)。如果是的話，那么阻斷該通路應(yīng)該就能影響糖尿病血管內(nèi)皮功能。為此，研究采用 Si ah-1抑制劑處理糖尿病小鼠，結(jié)果β-cat eni n濃度明顯升高，進一步證明Si ah-1可以介導β-cat eni n的降解。如果Si ah-1是通過βcat eni n信號通路調(diào)控血管內(nèi)皮功能，那么，在阻斷β-cat eni n的情況下，Si ah-1抑制劑將無法改變Ach引起的血管舒張反應(yīng)。為此，研究中采用β-cat eni n抑制劑處理糖尿病小鼠，以阻斷β-cat eni n信號通路，再采用Si ah-1抑制劑處理該糖尿病小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在β-cat eni n抑制劑存在的情況下，Si ah-1抑制劑無法改變糖尿病小鼠對Ach引起的血管舒張反應(yīng)。以上結(jié)果提示，Si ah-1可能通過β-cat eni n信號通路參與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的過程。

綜上所述，E3泛素連接酶Si ah-1參與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的過程，其機制可能與對β-cat eni n信號通路的影響有關(guān)。抑制Si ah-1活性有望成為預防或治療糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷的新方法，其具體應(yīng)用有待進一步的研究。

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（申海菊編輯）

Relationship between E3 ubiquitin ligase SIAH1 and diabetic vascular endothelial injury

Wei Gu，Xue-kun Zhang，Zheng-li Zhao，Dian-jing Sun，Yu-li Lu，Jian-lin Geng
（Department of Endocrinology，Harrison International Peace Hospital of Hengshui City，Hengshui，Hebei 053000，China）

Objective To investigate the relationship between E3 ubiquitin ligase SIAH1 and diabetic vascular endothelial injury.Methods C57BL/6 rats and db/db rats were used in our study.Tension of isolated thoracic aorta was measured by organ bath and the vascular tension system.The levels of SIAH1 and βcatenin were detected by Western blot and ELISA.Results The vascular endothelial diastolic reaction induced by acetylcholine（Ach）in the db/db rats was significantly lower than that of the normal rats（t=24.270，P= 0.000）.There was no significant difference in the vascular endothelial diastolic reaction induced by Ach between the db/db rats using SIANH1 inhibitor and the normal rats（t=1.991，P=0.327）.There was no significant difference in the vascular endothelial diastolic reaction induced by sodium nitroprusside（SNP）between the db/db rats and the normal rats（F=0.145，P=0.541）.The level of SIAH1 decreased（t=5.483，P= 0.017）and that of β-catenin increased（t=6.670，P=0.023）in the db/db rats using SIAH1 inhibitor.In the presence of β-catenin inhibitor，the vascular endothelial diastolic reaction of the diabetic rats using SIAH1 inhibitor had no significant difference from that of the normal rats（t=1.441，P=0.378）.Conclusions E3 ubiquitin ligase SIAH1 is involved in the process of vascular endothelial injury in diabetes，the mechanismmay be related to its effect on β-catenin signal pathway.

E3 ubiquitin ligase SIAH1；diabetes；vascular endothelial injury

R 587.1

A

1005-8982（2016）05-0022-04

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.005

2015-10-26

張雪坤，E-m ai l：3262407372@163.com