慈竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及其脅迫誘導表達

劉紅梅，胡尚連*，曹 穎，盧學琴，徐 剛，龍治堅，任 鵬

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，綿陽 621010)

慈竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及其脅迫誘導表達

劉紅梅1,2，胡尚連1,2*，曹 穎1,2，盧學琴1,2，徐 剛1,2，龍治堅1,2，任 鵬1,2

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，綿陽 621010)

為了解慈竹WRKY生物學功能以及通過基因工程手段改良竹類植物。利用已獲得慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆獲得2條WRKY轉(zhuǎn)錄因子,分別命名為BeWRKY1 (GenBank：KJ462124)和BeWRKY2 (GenBank：KJ462125)，兩者分別編碼189和295個氨基酸殘基。序列分析表明，兩者編碼的蛋白均含有一個完整的WRKY superfamily的保守結(jié)構(gòu)域。BeWRKY1屬于Ⅱc亞家族；BeWRKY2則與TaWRKY16和AtWRKY39等聚為一枝，屬于Ⅱd亞家族。定量PCR分析表明，BeWRKY1和BeWRKY2分別在莖和完全展開葉中具有較高表達量。200mmol·L-1NaCl和20% PEG 6000脅迫處理激活了BeWRKY1表達，卻減少了BeWRKY2的轉(zhuǎn)錄積累。結(jié)果表明BeWRKY1可能短時間內(nèi)迅速參與逆境響應；BeWRKY2對干旱和ABA脅迫傷害更為敏感，而可能不參與高鹽類脅迫保護反應。

慈竹；WRKY；克??；生物信息學分析；脅迫誘導

WRKY蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]，含有高度保守的WRKY域的鋅指蛋白，其保守域約由60個氨基酸殘基組成[2]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)的數(shù)量將其分為Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類[3]。Ⅰ類含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，Ⅱ類和Ⅲ類雖都含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)不同。其中的Ⅱ類還根據(jù)不同的序列特征分為5個亞群[4]。目前已從擬南芥[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、小麥(Triticumaestivum)[7]、(Solanumlycopersicum)[2]、毛竹(Phyllostachysheterocyclacv.Pubescens)[8]等植物中克隆得到大量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，但在慈竹中尚未見報道。WRKY蛋白具有快速、瞬時、具組織特異性誘導表達特性。其不僅與植物的生物與非生物脅迫應答密切相關，也與植物生長發(fā)育調(diào)控有關[9-11]。WRKY在非生物脅迫和非生物方面，研究表明水稻OsWRKY11[12]和OsWRKY45[ 13]、菊花WRKY3[14]、有24條WRKY基因[15]以及擬南芥AtWRKY30[16]均表現(xiàn)由抗干旱脅迫的能力，其中OsWRKY45不但具有抗干旱的能力還有抗高溫和抗病毒的能力[13]。在植物生長發(fā)育以及衰老過程中，研究發(fā)現(xiàn)ScWRKY1轉(zhuǎn)錄因子在胚胎形成過程中發(fā)揮著至關重要的作用[17]?？茖W家發(fā)現(xiàn)在擬南芥的幼片和成熟葉片AtWRKY6轉(zhuǎn)錄因子幾乎不表達，而在其衰老葉片中檢測到很高的表達量，因此判斷其與植物衰老程序密切相關[18]。雖然目前大量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能已被證實，但還有大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子待更深入的進行研究。

慈竹(Bambusaemeiensis)是我國西南地區(qū)普遍栽培的大型叢生竹種[19]，廣泛用于造紙和園林綠化[20]，在所有竹種中慈竹屬于iV級紙漿竹[21]，是重要的工業(yè)原料。但慈竹易受多種不利因素的影響而大面積減產(chǎn)。既影響新竹，又影響筍的生長[22]；因此改良慈竹品種迫在眉睫。近年來隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的廣泛應用，毛竹、麻竹等竹種的基因組和(或)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)被公布[23-24]，但慈竹的研究相對較少。本課題組利用RNA-Seq技術(shù)進行了慈竹筍轉(zhuǎn)錄組研究，為發(fā)現(xiàn)慈竹筍發(fā)育、特征代謝合成和分解途徑等提供了大量的候選基因，還為慈竹SSR和SNP等分子標記的開發(fā)提供了極為豐富的序列基礎(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。本研究以此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，篩選并克隆了其中2個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并進行生物信息學和脅迫誘導表達模式分析，為了解慈竹WRKY生物學功能以及通過基因工程手段改良竹類植物奠定了一定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和菌株

OMEG植物總RNA提取試劑盒購自成都博瑞克生物技術(shù)有限公司；PrimerScript RT reagent Kit perferct real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa LA Taq 聚合酶、T4-DNA連接酶、PGM-T vector、EcoRⅠ均購至天津的TaKaRa公司；膠回收試劑盒，質(zhì)粒試劑盒，DH5α感受態(tài)細胞；IPTG、X-Gal、Amp+等購至北京的天根公司；Nacl、PEG -6000、ABA均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 慈竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆

采集西南科技大學資源圃中的慈竹筍(露出地面100 cm)用于轉(zhuǎn)錄組高通量測序。以獲得的慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，從100 cm高的慈竹筍克隆了2個WRKY基因：WRKY1的引物為5′ATGGCGGCTTCGTTAGGACTAA 3′(上游引物)和5′TCAGAAGAGCAGTGAGCCTGCA 3′(下游引物)；WRKY2的引物為5′ATGGAGGAAGTGGAGGAGGCCA 3′(上游引物)和5′CTAAGCTTGCGCAGACTGAGTT 3′(下游引物)。采用 LA-Taq酶(TaKaRa)進行目的基因擴增。將PCR回收產(chǎn)物連接到pGM-T載體，測序分析。

1.3 氨基酸多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過NCBI里的BLAST進行在線分析與之相近物種的同源率。利用ClustalW2將兩者編碼的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的毛竹、小麥的全長WRKY編碼的氨基酸序列進行比對分析。利用Mega5.2的Pairwise alignment和Multiple alignment程序?qū)寺～@得的慈竹BeWRKY1和BeWRKY2以及在GeneBank里搜索得到的毛竹、小麥、水稻、擬南芥、大麥(Hordeumvulgare)的151條WRKY進行分析，再采用Construct/Test Neibhbor-Joining Tree生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 WRKY基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測

利用ExPaSy(www.expasy.ch/tools/)工具中的 CPH models程序在線對慈竹、毛竹、小麥和水稻進行同源模建，再利用RasMol預測軟件對預測的WRKY基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行分析。

1.5 慈竹WRKY基因的表達模式和脅迫誘導表達分析

用Real-timePCR方法進行組織表達模式和脅迫誘導表達分析。分別采集慈竹的竹筍(100 cm)，當年生且完全抽枝的慈竹莖稈、完全展開葉和未完全展開葉進行組織表達模式分析，每一個分析取三次生物學重復。取培養(yǎng)30 d且生長狀態(tài)良好的慈竹實生幼苗(蛭石+1/10倍Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng))，參考擬南芥[25]、玉米[26]、毛竹[8,27]的脅迫處理方法，分別以NaCl(0、50、100、150、200、250 mmol·L-1)、PEG-6000(0、5、10、15、20、25%)、ABA(0、5、10、50、100、200 μmol·L-1)進行預實驗，每個處理重復3次(每個重復取3個獨立植株)。由預試驗結(jié)果分析，本試驗分別以NaCl(0、200 mmol·L-1)、PEG6000(0、20%) 、ABA(0、200 μmol·L-1)進行脅迫處理，每個處理重復3次(每個重復取3個獨立植株)，分別在0 h(未處理的對照)、6 h、12 h、24 h、48 h及7 d(天)取樣，保存于-80 ℃冰箱備用。采用Plant RNA Kit試劑盒提取RNA，用PrimeScript?RT reagent Kit perfect real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。分別以WRKY1F/R(5′GGCAAGAAGGCTGTCAAG3′;5′ACCCCGTCGTAGGTAGTG3′)和WRKY2F/R(5′TTTCCAGTCCTTCTTGTCG3′;5′CACTTTCCATTCCCATCC3′)為引物，以慈竹Tublin基因[19]為內(nèi)參(Tublin-F 5′GCCGTGAACTCATCCCCTT3′；Tublin-R 5′TTGTTCTTGGCATCCCACAT3′)，在Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor上進行Real- time PCR分析，用2-ΔΔCT計算法計算其表達量[28]。

2 結(jié)果分析

2.1 慈竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆和氨基酸多序列比對

根據(jù)設計的引物，以100 cm高的慈竹筍cDNA為模板，進行PCR擴增，獲得了兩個WRKY轉(zhuǎn)錄因子。測序分析結(jié)果表明，BeWRKY1(GenBank：KJ462124)長570 bp，編碼189個氨基酸殘基；BeWRKY2(GenBank：KJ462125)長888bp，編碼295個氨基酸殘基。將克隆到的慈竹BeWRKY1和BeWRKY2，與毛竹的PheWRKY1(GenBank：GU944762.1)、小麥的TaWRKY16(GenBank：EU665428.1)的氨基酸序列比對。結(jié)果表明，這四個WRKY轉(zhuǎn)錄因子均含有一個WRKY保守域結(jié)構(gòu)(圖1，黑色框區(qū)域)。BLAST結(jié)果表明，慈竹BeWRKY1 和毛竹的PheWRKY1 基因的相似性最高，為92%，都屬于酸性蛋白；慈竹BeWRKY2 基因與小麥的TaWRKY16也有較高的相似性，為89%，均屬于堿性蛋白。

圖1 四個WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸多序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignmen of four WRKY transcription factors

2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用Mega5.2構(gòu)建進化樹，對慈竹、毛竹、小麥、水稻、擬南芥以及大麥共計151條WRKY轉(zhuǎn)錄因子進行分析。所有的轉(zhuǎn)錄因子聚成三大類，分別為Ⅰ類，Ⅱ類和Ⅲ類。Ⅱ類又聚成Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，Ⅱd及Ⅱe5個亞類。圖2A可知，BeWRKY1與PheWRKY1、AtWRKY50 和OsWRKY67 聚成一小枝，它們屬于Ⅱc亞類；BeWRKY2與TaWRKY16、AtWRKY39和AtWRKY74聚為一枝，屬于Ⅱd亞類。

用MEME軟件分析這些WRKY氨基酸序列的保守基序(圖2-B)。其中，BeWRKY2和BeWRKY2、PheWRKY1和TaWRKY16均有3個motif。其中motif 1的寬度為35，其正則表達式為[ER]GC[GP][AV][KR]K[HR]VER[CD][VGR]DDP[SCR][MY][LV]I[TV]TY[DE]G[EV]H[NK]H[AT][RT][MP][GP][FT][GQ]；motif 2的寬度為41，其正則表達式為[KR][IV][GP][AF][IR][ST][NR][KS][EI][AV][DE]I[LP][DP]D[EG][FY][KS]WRKYG[KQ]K[AP][IV]K[GN]SP[HN]PR[GN]YY[KR]CS[ST]；motif 3寬度為27，正則表達式為[AE][LMT][DS]D[HP][VHR][NP][AFS][EQ][QY][AS]P[AR][PR][RV][CF][AST]G[AR]G[DE]D[GH]N[GDE][KN][CDT]。從motif模式圖中看出，BeWRKY1和PheWRKY12、BeWRKY2和TaWRKY2結(jié)構(gòu)相似，與進化樹分析結(jié)果一致，進步一論證了它們同屬于WRKYⅡ類家族。

圖2 慈竹BeWRKY1和BeWRKY2基因與其他物種WRKY基因編碼氨基酸的聚類(A)和氨基酸序列保守基序分析(B)Fig.2 A：Cluster of the deduced amino acid sequences of BeWRKY1 and BeWRKY2; B：The analysis of their conserved motifs Be：Bambusa emeiensis Os：Oryza sativa At：Arabidopsis thaliana Ta：Triticum aestivum Hv：Hordeum vulgare L. Phe：Phyllostachys heterocycla cv. Pubescens

2.3 慈竹、毛竹、小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)上折疊，盤繞而成。CPH models在線預測慈竹、毛竹和小麥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)。如圖3所示，三個不同物種均含有豐富的β-折疊?β-轉(zhuǎn)角，無其它的結(jié)構(gòu)。慈竹BeWRKY2與小麥TaWRKY16編碼的蛋白質(zhì)的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角數(shù)量相同，兩者結(jié)構(gòu)相似。慈竹BeWRKY1與PheWRKY1編碼的蛋白質(zhì)有相同數(shù)量的β-轉(zhuǎn)角，但慈竹的β-折疊比毛竹多3個，兩者結(jié)構(gòu)存在一定的差別。

圖3 慈竹、毛竹和小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Model of the tertiary structure of protein coded by WRKY transcription factors from Bambusa emeiensis，Phyllostachys heterocycla cv.Pubescens and Triticum aestivum

圖4 實時定量PCR分析BeWRKY1，BeWRKY2在不同組織的表達Fig.4 Quantitative real-time PCR analysis of the expression patterns of BeWRKY1 and BeWRKY2 in different tissues

2.4 慈竹BeWRKY1、BeWRKY2基因組織表達分析

分析BeWRKY1和BeWRKY2基因在慈竹中組織特異性表達。結(jié)果表明，這兩個轉(zhuǎn)錄因子具有一定的組織表達特異性(圖4)。BeWRKY1相對表達量依次為莖>筍>未展開葉>完全展開葉，各個部位的相對表達量的差異較大，在莖中表達量最高。而BeWRKY2的相對表達量為完全展開葉>莖>未展開葉>筍，展開葉的相對表達量高于其他各部位的相對表達量。

2.5 脅迫處理對葉片中BeWRKY1和BeWRKY2表達影響

用實時定量PCR分析了在不同脅迫處理下慈竹幼苗葉片中BeWRKY1和BeWRKY2的表達情況，并進行顯著性分析(Tublin基因為內(nèi)參)。如圖5A所示，在NaCl(200 mmol·L-1)和PEG- 6000(20%)脅迫6 h，BeWRKY1表達水平在6 h時顯著性上調(diào)，分別是未處理的3.3倍、1.5倍，但隨著脅迫時間的延長，它的表達量緩慢下降，說明此基因可能短時間內(nèi)迅速參與逆境響應。在NaCl脅迫處理48 h和7 d時，BeWRKY2的表達水平并沒有明顯變化，可見鹽脅迫對BeWRKY2轉(zhuǎn)錄積累的影響較??；而在PEG和ABA脅迫處理的慈竹幼苗葉片中，BeWRKY2的表達在6 h后顯著下調(diào)：脅迫至12 h時，BeWRKY2的表達水平降至最低，隨后逐漸回升，7 d時與對照基本持平(圖5B),說明BeWRKY2對干旱和ABA脅迫更為敏感。

圖5 脅迫處理下BeWRKY1和BeWRKY2的表達量變化Fig.5 Differential expression of BeWRKY1 and BeWRKY2 under stress treatments

3 討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，是近年來發(fā)現(xiàn)的植物體內(nèi)特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其與植物的非生物及生物脅迫應答[12-13]、抗病[8]、生長發(fā)育[29]、以及衰老息息相關[15]。近年來WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應中的研究已經(jīng)成為植物分子生物學領域的前沿課題。

本研究以慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，克隆了兩條慈竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子序列BeWRKY1和BeWRKY2。其中BeWRKY1與已經(jīng)報道的毛竹PheWRKY1轉(zhuǎn)錄因子同源率高達92%，都屬于酸性蛋白；BeWRKY2與小麥TaWRKY16轉(zhuǎn)錄因子同源最高為89%，均屬于堿性蛋白。系統(tǒng)進化樹分析表明，BeWRKY1與PheWRKY1、AtWRKY50 和OsWRKY67 聚成一小枝，屬于Ⅱc亞家族類。這一家族中的某些成員，如與PheWRKY1等，在抗病方面以及抗非生物脅迫具有一定的功能[8]。而BeWRKY2與AtWRKY39、AtWRKY74和TaWRKY2聚為一枝，屬于Ⅱd亞家族類。研究表明AtWRKY39突變體種子在高溫處理下萌發(fā)率降低，存活率也大大降低。反之，過表達植株對熱高溫脅迫耐受力增強。在高溫脅迫下擬南芥AtWRKY39突變體植物中水楊酸調(diào)控的PR1和水楊酸相關的MBF1c基因均表現(xiàn)為下調(diào)，在過表達植株中兩基因的表達增強，表明AtWRKY39正調(diào)控水楊酸和茉莉酮酸通路相互作用應答高溫脅迫[30]。推斷這一亞家族中的成員可能與抗高溫干旱有關。

慈竹兩個WRKY轉(zhuǎn)錄因子均有WRKY superfamily的保守結(jié)構(gòu)域，但編碼的蛋白理化參數(shù)差異較大。實時定量PCR結(jié)果表明，BeWRKY1和BeWRKY2分別在莖和展開葉的表達量較高，表明這兩個轉(zhuǎn)錄因子在抗逆方面可能具有不同的功能。逆境誘導表達的結(jié)果也證實了這一推論。在200 mmol·L-1NaCl和20% PEG 6 000處理下，BeWRKY1在脅迫處理6 h時表達量均明顯升高，說明此基因可能短時間內(nèi)迅速參與逆境響應；脅迫后期其表達量又緩慢下降至與0 h基本持平，可能是植物體避免過度應答造成傷害的一種自我保護特性[2]。研究報道多個WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗旱和抗鹽脅迫[31]。如與BeWRKY1同屬于Ⅱc家族的TaWRKY10(GenBank：HQ700327)基因在小麥受高鹽、干旱脅迫下均表現(xiàn)為先急劇上調(diào)后緩慢下降與0h持平。在過表達TaWRKY10的煙草植株中，TaWRKY10通過降低ROS積累和激活脅迫防御相關基因的表達來提高抗旱和抗鹽的能力[32]。另外Babitha等證明Ⅱc 家族的AtWRKY28過表達的擬南芥植物在高鹽、干旱和氧化處理下抗脅迫能力明顯增強[33]。在干旱和ABA脅迫下，BeWRKY2表達明顯降低，表明BeWRKY2對干旱和ABA脅迫傷害更為敏感，而可能不參與高鹽類脅迫保護反應。據(jù)研究報道屬于Ⅱd家族的水稻OsWRKY11基因增強了水稻耐高溫和干旱的能力[12]，因此BeWRKY2可能與抗干旱等有關。BeWRKY1和BeWRKY2的抗非生物脅迫功能仍需進一步驗證。

慈竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究處于初級階段，其功能還需要進一步深入研究。BeWRKY1和BeWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的克隆、信息學分析、表達模式的分析和功能初步探究可為以慈竹品種改良提供理論依據(jù)。現(xiàn)階段本研究室已經(jīng)成功構(gòu)建了BeWRKY1和BeWRKY2的過表達載體和RNAi表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草和楊樹，為深入研究其功能奠定了基礎。

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Cloning of WRKY Transcription Factors inBambusaemeiensisand Stress-induced Expressions

LIU Hong-mei1,2，HU Shang-lian1,2*,CAO Ying1,2，LU Xue-qin1,2， XU Gang1,2，LONG Zhi-jian1,2，REN Peng1,2

(1.College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,Sichuan,China；2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province， Mianyang 621010，Sichuan，China)

In order to explore the biological function of WRKY inBambusaemeiensisthen modify bamboo plants through genetic engineering. Two WRKY genes were cloned based on RNA transcriptome data ofBambusaemeiensis，which were named asBeWRKY1 (GenBank：KJ462124) andBeWRKY2(GenBank：KJ462125)，and encoded 189 and 295 amino acids，respectively. Blastp analysis indicated that both of them contained a WRKY conserved domain. BeWRKY1 belonged to Ⅱc subfamily，whereas BeWRKY2，aligned withTaWRKY16 andAtWRKY39，belonged to Ⅱd subfamily. Real-time PCR analysis showed thatBeWRKY1 exhibited higher expression in stems，while the expression level ofBeWRKY2 was higher in the full expanded leaves. 200 mmol·L-1NaCl and 20% PEG 6000 stresses triggeredBeWRKY1 expression，but decreased the transcript accumulation ofBeWRKY2.The results showed thatBeWRKY1 may response to stress in short time.BeWRKY2 was more sensitive to drought and ABA stresses，but did not participate in the protection of high salt stress response.

Bambusaemeiensis;WRKY;Cloning;Bioinformatics analysis;Stress-induced expression

2016-01-25

國家自然科學基金青年基金項目(31400257，31400333)；四川省“十三五”重點攻關資助項目(2016NYZ0038)

劉紅梅(1988-)，女，漢，碩士研究生,從事植物遺傳與品種改良研究。通信作者：胡尚連(1966-)，女，漢，教授，博士，從事植物生理與生物技術(shù)研究。E-mail：hushanglian@126.com