正相高效液相色譜法測(cè)定腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過(guò)氧化物的含量

任 雙，宋 慧，耿志明，王道營(yíng)，張牧焓，孫 沖，徐為民，*（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 10095；.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 10014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 10095）

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正相高效液相色譜法測(cè)定腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過(guò)氧化物的含量

任 雙1，2，3，宋 慧1，2，耿志明2，王道營(yíng)2，張牧焓2，孫 沖2，徐為民1，2，3，*
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

采用正相高效液相色譜法對(duì)腌臘肉制品中的磷脂酰膽堿氫過(guò)氧化物（PC-OOH）進(jìn)行檢測(cè)。腌臘肉制品中的PC-OOH用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）提取，以合成的C16∶0/18∶2PC-OOH為標(biāo)樣，采用正相高效液相色譜-紫外法進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱：Lichrosorb Si60（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為水，B為正己烷-異丙醇（3∶2，V/V），采用梯度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：234 nm。結(jié)果表明：C16∶0/18∶2PC-OOH在20～600 nmol/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.999 9），檢出限為5.8 nmol/mL，定量限為19.4 nmol/mL，不同水平的平均回收率為79.4%～91.9%。實(shí)際樣品分析顯示，農(nóng)家臘腸A、B和火腿中方樣品中PC-OOH的含量比較高，為92.4、106.4 nmol/g和102.5 nmol/g，煙熏肉中未檢出PC-OOH。本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法簡(jiǎn)便快捷、具有較好的靈敏度和可靠性，可用于腌臘肉制品中PC-OOH的定量分析。

腌臘肉制品；1-棕櫚酰-2-亞油酰-磷脂酰膽堿；氫過(guò)氧化物；正相高效液相色譜法

在光、金屬離子、酶等存在的條件下，脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生初級(jí)氧化產(chǎn)物——脂質(zhì)氫過(guò)氧化物（hydroperoxides，HPs）。脂質(zhì)HPs進(jìn)一步降解形成一系列揮發(fā)性和非揮發(fā)性次級(jí)氧化產(chǎn)物，是食品酸敗、產(chǎn)生異味的主要原因［1-2］。脂質(zhì)氧化降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)安全，其產(chǎn)物與多種疾病的形成與發(fā)展相關(guān)，如心血管疾?。?］、阿爾茨海默氏?。?］、癌癥［5］和衰老［6］。磷脂是細(xì)胞膜和血清脂蛋白的主要成分，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量顯著高于脂肪酸甘油酯，因此有關(guān)磷脂HPs，尤其是磷脂酰膽堿HPs （PC-OOH）的研究，是脂質(zhì)氧化的研究重點(diǎn)［7］。在現(xiàn)有的脂質(zhì)HPs分析方法中，碘量法［8］、比色法［9］和硫代巴比妥酸法［10］等主要用于脂質(zhì)HPs總量的測(cè)定，缺乏選擇性，不適用于PC-OOH的分析?；诠入赘孰倪^(guò)氧化物酶和環(huán)氧化酶的一些酶促反應(yīng)方法［11］，具有較好的選擇性和靈敏度，但是這些酶通常都難以獲得。高效液相色譜-柱后衍生分析法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，均具有優(yōu)異的選擇性和靈敏度，滿足食品及生物樣本中包括PC-OOH在內(nèi)的脂質(zhì)HPs的定性定量分析，但前者由于衍生反應(yīng)自身的局限，缺少穩(wěn)定性，而后者運(yùn)行費(fèi)用昂貴、難以普及。高效液相色譜-紫外檢測(cè)器分析法［12-14］，利用PUFA氧化后產(chǎn)生的共軛雙鍵在234 nm波長(zhǎng)處的特征吸收，對(duì)其HPs進(jìn)行定性、定量分析。高效液相色譜-紫外檢測(cè)器分析法適用于含共軛雙鍵的脂肪酸HPs的分析，具有較好的選擇性和靈敏度，操作簡(jiǎn)便且無(wú)需昂貴設(shè)備及設(shè)施。這一方法早期多用于脂質(zhì)氧化模擬體系中亞油酸（linoleic acid，LA）及其甲酯的初級(jí)氧化產(chǎn)物L(fēng)A-OOH的分析，隨后被成功應(yīng)用于包括PC-OOH在內(nèi)的人體紅細(xì)胞膜磷脂HPs的分析，但尚未見(jiàn)其應(yīng)用于動(dòng)物性食品中磷脂HPs分析的研究報(bào)道。

腌臘肉制品是以畜禽肉類為原料，在低溫條件下，通過(guò)加鹽（或鹽鹵）和香料進(jìn)行腌制，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的自然風(fēng)干成熟，形成獨(dú)特腌臘風(fēng)味的傳統(tǒng)肉制品。動(dòng)物肌肉中的磷脂（亦稱肌內(nèi)磷脂）占肌內(nèi)總脂肪的50%以上，肌內(nèi)磷脂中PC占45%～60%［15］。磷脂中的多不飽和脂肪酸是脂質(zhì)氧化反應(yīng)最主要的靶標(biāo)［12］，對(duì)于腌臘肉制品的生產(chǎn)工藝而言，脂質(zhì)氧化、尤其是肌內(nèi)磷脂氧化是最主要的生化反應(yīng)，是風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源，在某種程度上決定了產(chǎn)品品質(zhì)，因此對(duì)磷脂氧化進(jìn)行必要的監(jiān)測(cè)與調(diào)控至關(guān)重要［16-17］。目前通常采用過(guò)氧化值、硫代巴比妥酸、雙烯值以及羰基值等的檢測(cè)，評(píng)價(jià)腌臘肉制品中脂質(zhì)氧化的程度。但對(duì)于脂質(zhì)氧化產(chǎn)物類別、產(chǎn)生途徑，并在此基礎(chǔ)上對(duì)脂質(zhì)氧化進(jìn)行調(diào)控?zé)o法足夠的信息。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自由基氧化法，制備肌內(nèi)磷脂中最常見(jiàn)的磷脂酰膽堿分子種C16∶0/18∶2PC的氫過(guò)氧化物（C16∶0/18∶2PC-OOH），并以此為PC-OOH標(biāo)樣，建立腌臘肉制品中PC-OOH的高效液相色譜分析方法。樣品中的PC-OOH經(jīng)提取、濃縮后，在硅膠柱上分離，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，PAD）在234 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡(jiǎn)便、快捷，擁有良好的靈敏度。這一方法可用于腌臘肉制品生產(chǎn)過(guò)程中磷脂酰膽堿氧化的監(jiān)測(cè)，也可用于肉制品加工過(guò)程中磷脂酰膽堿氧化途徑、及其對(duì)脂質(zhì)氧化貢獻(xiàn)等相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)家臘腸、蘇式臘腸、煙熏肉 市購(gòu)。

磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（C16∶0/18∶2PC，純度99%） 美國(guó)Sigma公司；異丙苯過(guò)氧化物 加拿大TRC公司；甲醇、氯仿、正己烷、異丙醇（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司；自由基誘導(dǎo)劑2，2′-偶氮二異庚腈（純度99%） 上海一基實(shí)業(yè)有限公司；三苯基磷化合物（1，3-bis（diphenylphosphino）propane，DPPP，純度95%）東京化成工業(yè)株式會(huì)社；水由純水儀（美國(guó)Millipore公司）制備；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜（PAD） 美國(guó)Milford公司；Biofuge stratos高速離心機(jī) 德國(guó)Heraeus公司；HS2060A超聲波振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；烘箱上海索譜儀器有限公司；RE-85C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)品的制備

［18］方法，并略做修改。稱取20.0 mg標(biāo)品C16∶0/18∶2PC溶于5 mL甲醇，再加入20.0 mg自由基誘導(dǎo)劑2，2′-偶氮二異庚腈，在黑暗中，30 ℃條件下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后再加入2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（2，6-di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT），防止C16∶0/18∶2PC-OOH進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。制得未知濃度的C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)文獻(xiàn)［19-20］選擇貯存條件為-20℃，保存期：1 個(gè)月。

1.3.2 C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)品的定量

按參考文獻(xiàn)［21］，并略做修改。首先使用熒光分光光度計(jì)建立過(guò)氧化值（peroxide value，POV）標(biāo)曲，取0.5、2、4、6、8 nmol異丙苯過(guò)氧化物，分別加入裝有0.8 mL 3 μg/mL DPPP溶液的試管中，最后定容為1.6 mL。60 ℃烘箱中反應(yīng)1 h，冰水浴30 min，然后使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)352 nm，發(fā)射波長(zhǎng)380 nm，建立POV標(biāo)準(zhǔn)曲線。

與此同時(shí)，取100 μL上述C16∶0/18∶2PC-OOH溶液，加入裝有0.8 mL 3 μg/mL DPPP溶液的試管中，最后定容為1.6 mL。60 ℃烘箱中反應(yīng)1 h，冰水浴30 min，然后使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。根據(jù)上面的POV標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到C16∶0/18∶2PC-OOH的質(zhì)量濃度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量1.3.2節(jié)中定量的C16∶0/18∶2PC-OOH溶液，用甲醇稀釋，配制800 nmol/mL C16∶0/18∶2PC-OOH儲(chǔ)備液。用移液管吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相B（正己烷-異丙醇，3∶2，V/V）稀釋配制物質(zhì)的量濃度為20、80、240、420、600 nmol/mL的C16∶0/18∶2PC-OOH系列工作溶液，儲(chǔ)存于-20℃，1 個(gè)月以內(nèi)使用。

1.3.4 樣品處理

根據(jù)Folch等的方法［22］，略作修改提取脂質(zhì)。樣品粉碎后，取3.0 g 于80 mL離心管中，加入20 mL含有0.1% BHT的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，低速勻漿后再加入25 mL氯仿-甲醇，靜置1 h，5 000 r/min離心15 min，過(guò)濾后濾渣中再加入15 mL氯仿-甲醇，合并2 次的濾液，加入0.3 倍體積的生理鹽水（7.3 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl2），然后3 000 r/min離心15 min，吸凈上層液體，剩余液體用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸干，最后加入氯仿溶解，定容至2.0 mL，在-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Lichrosorb Si60（250 mm×4.0 mm，5 μ m）；流動(dòng)相：A為水，B為正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）；梯度洗脫（表1），流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：234 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluti on p rogram

1.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配制不同質(zhì)量濃度的C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行正相高效液相色譜測(cè)定，以測(cè)定的結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取一份農(nóng)家臘腸樣品A，在1 d的不同時(shí)段對(duì)樣品進(jìn)行6 次正相高效液相色譜測(cè)定，連續(xù)4 d每天測(cè)定一次，以測(cè)得的結(jié)果分別計(jì)算日內(nèi)和日間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取3.01 g農(nóng)家臘腸樣品B，根據(jù)其PC-OOH含量添加不同水平的C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.4節(jié)樣品處理步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定PC-OOH含量，計(jì)算回收率，樣品做3 次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

腌臘肉制品水分低，蛋白質(zhì)含量高，按Folch等［22］的方法進(jìn)行提取，C16∶0/18∶2PC-OOH的提取率很低。本實(shí)驗(yàn)將生理鹽水的用量從0.2 倍提高到0.3 倍，同時(shí)對(duì)濾渣進(jìn)行第2次萃取、離心分離，極大地提高了C16∶0/18∶2PCOOH提取率，最終C16∶0/18∶2PC-OOH的回收率達(dá)到79.4%～91.9%。

在磷脂的分離及定量分析中，常采用固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）小柱（如氨丙基硅膠小柱）對(duì)磷脂進(jìn)行分離、凈化、濃縮［22-23］。在本實(shí)驗(yàn)中，也嘗試使用了硅膠柱、氨基柱等SPE小柱，但這些小柱并未對(duì)樣品中C16∶0/18∶2PC-OOH有顯著的凈化、濃縮作用，甚至SPE小柱的使用反而降低了回收率。圖1、2分別是C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖，C16∶0/18∶2PCOOH與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)基線分離，本實(shí)驗(yàn)確定的樣品處理方法具有理想的提取、凈化效果，滿足腌臘肉制品中PCOOH分析的要求。

圖1 240 n mol /m L C16∶0 /18∶2P C-O O H 在234 nm波長(zhǎng)處的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of C16∶0/18∶2 PC-OOH （240 nmol/mL） detected at234 nm

圖2 農(nóng)家臘腸樣品 B 中106.4 nmo l/g P C-O O H 的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of PC-OOH （106.4 nmol/g） in farm-made sausage B sample

2.2 色譜條件的優(yōu)化

PC是一種兩性分子，由親水的頭部和疏水的尾部組成，呈弱極性，而PC-OOH的極性略強(qiáng)于PC。高效液相色譜法分析PC-OOH時(shí)可采用反相色譜柱分離［14，19，24］、也可采用正相色譜柱分離［12-13］。本實(shí)驗(yàn)在比較了反相色譜柱（C18）、正相柱（氨基柱、硅膠柱）分離腌臘肉制品中PC-OOH的效果后，選擇以硅膠柱（Lichrosorb Si60）為色譜柱，主要是因?yàn)槭褂梅聪嘀桶被鶗r(shí)，PC-OOH出峰太快，與其他磷脂類物質(zhì)的氫過(guò)氧化物的分離效果不好。

為了得到最佳的分離效果，分別配制了3 種流動(dòng)相體系：不同比例的乙腈-甲醇-水、正己烷-異丙醇和正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）-水，觀察三者對(duì)PC-OOH在硅膠柱上保留行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）-水組成的流動(dòng)相下PC-OOH的峰形最好，流動(dòng)相中水的增加有利于縮短保留時(shí)間、增加峰高，但水含量的上升影響流動(dòng)相互溶，同時(shí)對(duì)硅膠色譜柱帶來(lái)不利影響。采用等度洗脫時(shí)，PC-OOH出峰太快，不能與周圍的雜質(zhì)峰分離開(kāi)。在綜合考慮后確定了表1中的流動(dòng)相組成以及梯度洗脫方式。

PUFA氧化形成的初級(jí)產(chǎn)物含有共軛雙鍵，其在234 nm波長(zhǎng)處的特征性紫外吸收為采用紫外檢測(cè)器或PAD檢測(cè)成為可能。本實(shí)驗(yàn)采用PAD觀察了C16∶0/18∶2PC-OOH在190～400 nm波長(zhǎng)范圍的吸收，結(jié)果表明合成的C16∶0/18∶2PCOOH以及樣品中的PC-OOH同樣在234 nm波長(zhǎng)條件下有最大吸收峰，且在234 nm波長(zhǎng)條件下基線平穩(wěn)（圖1）。

本實(shí)驗(yàn)還觀察了溫度、流速對(duì)C16∶0/18∶2PC-OOH在正相硅膠柱上的保留行為的影響，二者對(duì)C16∶0/18∶2PC-OOH的保留時(shí)間有一定影響，但對(duì)檢測(cè)靈敏度影響不大，最終將溫度設(shè)為30 ℃，流速1.0 mL/min。在設(shè)定的色譜條件下，C16∶0/18∶2PC-OOH出峰時(shí)間在25.3～26.8 min，樣品中的PC-OOH出峰時(shí)間為24.8～26.8 min（圖1、2）。

亞油酸含有兩個(gè)C=C雙鍵，自由基誘導(dǎo)的C16∶0/18∶2PC的初級(jí)氧化產(chǎn)物C16∶0/18∶2PC-OOH有4 個(gè)異構(gòu)體［25-26］。在高效液相色譜的分析方法中，由于采用的色譜柱及流動(dòng)相的差異，這4個(gè)異構(gòu)體常呈現(xiàn)1 個(gè)色譜峰或2、3個(gè)相連的色譜峰［18，27］。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)立的色譜分離條件下，合成的C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)樣呈現(xiàn)出2 個(gè)相連的色譜峰，而在腌臘肉制品的色譜圖中，PC-OOH出峰時(shí)間比C16∶0/18∶2PCOOH有所提前，且呈現(xiàn)出3 個(gè)相連的色譜峰。磷脂中的多不飽和脂肪酸是脂質(zhì)氧化反應(yīng)最主要的標(biāo)靶，反應(yīng)形成的共軛雙鍵使得利用紫外檢測(cè)器或PAD在234 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)PC-OOH成為可能［12］。在動(dòng)物肌肉內(nèi)PC的sn-2上，主要是亞油酸（C18∶2），還有少量的花生四烯酸（C20∶4）；而在PC的sn-1上，除棕櫚酸（C16∶0）外，還有少量的硬脂酸（C18∶0）和亞油酸（C18∶1）［15］。正是由于動(dòng)物肌內(nèi)磷脂的PC分子種存在多樣性，以及腌臘肉制品加工過(guò)程中脂質(zhì)氧化的復(fù)雜性（酶促氧化、自由基誘導(dǎo)的自動(dòng)氧化同時(shí)存在），樣品中的PC-OOH為多種PC分子種的氫過(guò)氧化物的混合物［14，25，28］，它們的分子質(zhì)量都大于C16∶0/18∶2PC-OOH的分子質(zhì)量，經(jīng)過(guò)正相硅膠柱的分離，保留時(shí)間有所提前，并且色譜圖比C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)樣更加復(fù)雜。雖然PC-OOH呈現(xiàn)出多個(gè)色譜峰相連的現(xiàn)象，但其總面積反應(yīng)的是不同共軛雙鍵（包括不同異構(gòu)體以及不同PC分子種）的總吸收。鑒于動(dòng)物肌肉中PC的sn-1以棕櫚酸為主、sn-2以亞油酸為主，以合成的C16∶0/18∶2PCOOH為標(biāo)樣、以nmol/g為單位定量樣品中PC-OOH的總量是合理的，也是可行的。

2.3 線性范圍及最低檢出限

配制物質(zhì)的量濃度為20、80、240、420、600 nmol/mL 的C16∶0/18∶2PC-OOH系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在234 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行正相高效液相色譜測(cè)定分析，以C16∶0/18∶2PC-OOH物質(zhì)的量濃度/（nmol/mL）為橫坐標(biāo)X，以對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程Y=11 150X-47 379，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。由此可見(jiàn)在20～600 nmol/mL范圍內(nèi)，C16∶0/18∶2PC-OOH濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

按照3 倍信噪比（RSN=3）和10 倍信噪比（RSN=10）計(jì)算方法的檢出限和定量限，檢出限為5.8 nmol/mL，定量限為19.4 nmol/mL。按1.3.4節(jié)樣品處理?yè)Q算，樣品中的PC-OOH的檢出限為3.9 nmol/g，定量限為12.9 nmol/g。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

配制32、64、95 nmol/mL的C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.5節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，每個(gè)濃度重復(fù)操作3 次，記錄峰面積，得32、64、95 nmol/mL的C16∶0/18∶2PCOOH標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的RSD分別為1.1%、0.9%、0.3%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本方法的精密度通過(guò)對(duì)農(nóng)家臘腸樣品A中PC-OOH的日內(nèi)和日間實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。PCOOH精密度（RSD）的范圍為1.2%～2.6%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法具有較好的精密度。

表2 日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Intra-day precisi on of the method for determ in ati on of PC-OOH

表3 日間 精密 度實(shí) 驗(yàn)結(jié) 果Table 3 Inter-day precisi on of the method for determ in ati on of PC-OOH

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱取3.0 g農(nóng)家臘腸樣品B于離心管中，分別加入低、中、高水平的C16∶0/18∶2PC-OOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按1.3.4節(jié)進(jìn)行樣品處理，按1.3.5節(jié)色譜條件進(jìn)行正相高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 C 16∶0/18∶2PC-OO H不 同添 加水 平回 收率 測(cè)定 結(jié)果 （n=3）Table 4 Recoveries of C1 6∶0/18∶2PC-OO Ha td ifferentspi ked lev els（n= 3）

由表4可以看出，樣品回收率在79.4%～91.9%之間，平均回收率為87.5%。

2.7 實(shí)際樣品分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過(guò)氧化物的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)分別分析了農(nóng)家臘腸A、B和蘇式香腸、咸肉、火腿中方、煙熏肉的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。表5表明，農(nóng)家臘腸A、B和火腿中方樣品中PC-OOH的含量比較高，分別為92.4、106.4 nmol/g和102.5 nmol/g，在煙熏肉中未檢出PC-OOH。

表5 實(shí)際樣品分析結(jié)果（n=3）Table5 C on tents of PC-OOH in real samples （n= 3）

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)樣品處理?xiàng)l件和色譜條件的優(yōu)化，以合成的C16∶0/18∶2PC-OOH為標(biāo)樣，建立了腌臘肉制品中PCOOH的正相高效液相色譜-PAD檢測(cè)方法。腌臘肉制品中的PC-OOH經(jīng)氯仿/甲醇提取、濃縮后，在正相硅膠柱上以水、正己烷、異丙醇為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。在20～600 nmol/mL的線性范圍內(nèi)，檢出限、定量限分別為5.8 nmol/mL和19.4 nmol/mL，在32～240 nmol/g的添加范圍內(nèi)，平均回收率87.5%。對(duì)實(shí)際樣品的分析檢測(cè)中，農(nóng)家臘腸A、B和火腿中方樣品中PC-OOH的含量比較高，分別為92.4、106.4 nmoL/g和102.5 nmoL/g，煙熏肉中PCOOH的含量太低，未檢出。結(jié)果表明，腌臘肉制品中普遍存在磷脂酰膽堿氫過(guò)氧化物，其形成途徑、影響因素及其最終歸宿值得進(jìn)一步關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便、具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性，可用于腌臘肉制品中PCOOH的檢測(cè)，也可用于肉制品加工過(guò)程中磷脂酰膽堿氧化途徑、及其對(duì)脂質(zhì)氧化貢獻(xiàn)等相關(guān)研究。

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Determination of Phosphatidylcholine Hydroperoxide in Dry Cured Meat Products by Normal-Phase High Performance Liquid Chromatography

REN Shuang1，2，3， SONG Hui1，2， GENG Zhiming2， WANG Daoying2， ZHANG Muhan2， SUN Chong2， XU Weimin1，2，3，*
（1.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；3.Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing， Nanjing 210095， China）

A normal-phase high-performance liquid chromatographic （HPLC） method was established to determine phosphatidylcholine monohydroperoxide （PC-OOH） in dry cured meat products.The PC-OOH in dry cured meat samples was extracted with chloroform/methanol （2:1， V/V）， followed by determination by normal-phase HPLC connected to a photo-diode array detector （HPLC-PAD） with synthetic C16:0/18:2PC-OOH as the standard.The chromatographic conditions were established using a Lichrosorb Si60column （250 mm × 4.0 mm， 5 μm） with a mobile phase consisting of water and n-hexane/isopropanol （3:2， V/V） in gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 234 nm.Results indicated that the linearity ranged from 20 to 600 nmol/mL （R2= 0.999 9）， and the limits of detection （LOD）and limits of quantification （LOQ） were 5.8 nmol/mL and 19.4 nmol/mL， respectively.The recoveries from spiked samples at concentration levels of 32-240 nmol/g were in the range of 79.4%-91.9%.The contents of PC-OOH in farm-made sausage A， B and Chinese ham samples were 92.4， 106.4 and 102.5 nmol/g， respectively， while PC-OOH in smoked meat was not detected.This method proved to be of high maneuverability， excellent sensitivity and high accuracy， and could be used for quantitative analysis of PC-OOH in dry cured meat samples.

dry cured meat； 1-palmitoyl-2-linoleoyl-phosphatidylcholine； hydroperoxide； normal-phase HPLC

10.7506/spkx1002-6630-201614027

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0154-06

任雙， 宋慧， 耿志明， 等.正相高效液相色譜法測(cè)定腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過(guò)氧化物的含量［J］.食品科學(xué)， 2016，37（14）: 154-159.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614027. http://www.spkx.net.cn

REN Shuang， SONG Hui， GENG Zhiming， et al.Determination of phosphatidylcholine hydroperoxide in dry cured meat products by normal-phase high performance liquid chromatography［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 154-159.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614027. http://www.spkx.net.cn

2015-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401560）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（13）3081）

任雙（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：2013108049@njau.edu.cn

*通信作者：徐為民（1969—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com