兩系不育系Y58S的花藥培養(yǎng)與花培后代的鑒定篩選

黃翠紅，楊瑰麗，黃 明，周丹華，劉永柱，郭 濤，陳志強(qiáng)，王 慧

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

兩系不育系Y58S的花藥培養(yǎng)與花培后代的鑒定篩選

黃翠紅，楊瑰麗，黃 明，周丹華，劉永柱，郭 濤，陳志強(qiáng)，王 慧

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

花藥培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)不育系育種的結(jié)合能有效加快新的光溫敏不育系材料的選育進(jìn)程。為了篩選出適合兩系不育系Y58S的花藥培養(yǎng)條件，利用10種不同培養(yǎng)基對(duì)兩系不育系Y58S不同雜交組合F2代進(jìn)行花藥培養(yǎng)。培養(yǎng)基E（NMB+2 mg/L 2，4-D+2 mg/L NAA+1 mg/L KT+0.5 g/L脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.5 g/L水解酪蛋白+25 g/L蔗糖+25 g/L麥芽糖+10 g/L瓊脂粉）較為適合兩系不育系Y58S的花藥培養(yǎng)；同時(shí)，材料的基因類型對(duì)花藥培養(yǎng)力有著顯著的影響，粳稻血緣的滲入有利于兩系不育系花藥培養(yǎng)力的提高?；ㄋ幣囵B(yǎng)后代田間性狀觀察結(jié)果表明，在當(dāng)代花藥培養(yǎng)植株中發(fā)現(xiàn)較多的二倍體植株，少部分為單倍體、四倍體植株，尚未發(fā)現(xiàn)非整倍體；篩選出一個(gè)表現(xiàn)較好的不育株系。

水稻；兩系不育系；Y58S；花藥培養(yǎng)；花培后代

黃翠紅，楊瑰麗，黃明，等.兩系不育系Y58S的花藥培養(yǎng)與花培后代的鑒定篩選［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（5）：31-36.

不斷提純改良不育系是兩系法雜交水稻研究和超級(jí)雜交水稻組合選育的關(guān)鍵。鑒于花培育種具有純合快、選育效率高、可使農(nóng)藝性狀和育性同步穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，花藥培養(yǎng)技術(shù)可在較短的周期內(nèi)使包括溫光反應(yīng)特性在內(nèi)的各種性狀不再分離，大大縮短育種進(jìn)程，也可用于育成不育系的提純［1］。周元昌等對(duì)培矮 64 S 的核心種子進(jìn)行花藥培養(yǎng)，結(jié)果在H后代株系間發(fā)生育性分離，篩選出了完全不育的不育系培矮 64 HS，在不育期間其花粉不育度達(dá)99.8%以上，且不育期較長，育性和后代遺傳均穩(wěn)定。證明了花藥培養(yǎng)在培矮64S的遺傳純化上是有效的［2］。馬鎮(zhèn)榮等也用花藥培養(yǎng)對(duì)兩用核不育系培矮64S進(jìn)行提純與改良，結(jié)果表明花藥培養(yǎng)是提純及改良兩用核不育系的有效途徑［3］。陳遠(yuǎn)孟等對(duì)3個(gè)光（溫）敏核不育系培選S、農(nóng)墾58S、以及培矮64S進(jìn)行花藥培養(yǎng)，其花粉植株均有育性轉(zhuǎn)換的特性，且在H3代花粉植株的株系中，得到花粉不育度＞99.5%的植株比對(duì)照的株系多，表明了應(yīng)用花培對(duì)光（溫）敏核不育系提純的可行性［4］。但在水稻花藥培養(yǎng)中，基因型是影響花藥培養(yǎng)里的一個(gè)重要因素［5］，一般來說，花藥培養(yǎng)力的大小為：糯稻＞粳稻＞粳/秈稻＞秈型雜交稻＞秈稻［6］。而光溫敏核不育系和非光溫敏核不育系在花藥培養(yǎng)效率上不存在顯著差異，花藥培養(yǎng)里僅與供試材料的基因型有關(guān)［7］。利用光溫敏核不育材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)雖然可以加速不育系的選育，但可能由于培養(yǎng)條件不合適，或者花粉的敗育而影響愈傷的誘導(dǎo)和分化。因此，需要尋找新的培養(yǎng)基或調(diào)整現(xiàn)有配方，還包括附加成分的增減、培養(yǎng)條件的改善等，目的在于提高愈傷組織的誘導(dǎo)率和綠苗的分化率［8］。

Y58S 是湖南雜交水稻研究中心新選育而成的光溫敏不育系，2005年2月通過湖南省農(nóng)作物品種審定。它具有配合力高、抗逆性強(qiáng)、綜合性狀優(yōu)良等特點(diǎn)，適合配制廣適性超級(jí)稻組合。我們通過對(duì)光溫敏核不育系Y58S不同雜交后代進(jìn)行花藥培養(yǎng)研究，探究出對(duì)光溫敏核不育系材料適宜的花培條件，同時(shí)通過對(duì)花培后代材料篩選，以期獲得新的兩系不育系材料，為花培育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

兩系不育系材料：Y58S/02428、Y58S/合豐占，F(xiàn)2代（F1代中選擇不育株系割兜留禾頭，經(jīng)人工氣候箱處理轉(zhuǎn)育后留種）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取材與低溫預(yù)處理 試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)場農(nóng)學(xué)分場進(jìn)行，供試材料于2013年早造開始種植，常規(guī)田間管理。當(dāng)植株處于孕穗期時(shí)，在晴天下午從田間選取劍葉與下一葉的葉枕距約5～10cm的帶苞葉稻穗。將多數(shù)花粉發(fā)育時(shí)期處于單核中晚期的稻穗用濕潤紗布包裹，置于7～8℃下低溫預(yù)處理7～10 d。

1.2.2 培養(yǎng)基 誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基：分別選用N6 和NMB為基本培養(yǎng)基，并在激素水平與有機(jī)添加物上進(jìn)行調(diào)控（表1）、瓊脂10 g/L、蔗糖和麥芽糖各25g/L。

表1 不同培養(yǎng)基水平的篩選

分化培養(yǎng)基：統(tǒng)一使用MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA 3 mg/L、NAA 1 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂10 g/L。

生根壯苗培養(yǎng)基：采用l/2MS培養(yǎng)基，不附加激素，蔗糖25 g/L。

所有培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8左右。

1.2.3 接種條件 用75%酒精對(duì)稻穗進(jìn)行表面消毒，剝除葉鞘，置于燒杯中用2%次氯酸鈉消毒10～15 min，期間不時(shí)震蕩攪拌，以保證消毒完全，然后用無菌水沖洗3遍，用無菌紗布吸干水分，在無菌條件下用“剪穎抖藥法”把花藥接種至培養(yǎng)瓶中。將供試材料接種在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基上都分別接種10瓶，每瓶約100～120枚花藥，每個(gè)處理3次重復(fù)。

當(dāng)愈傷長出至2～3 mm時(shí)，挑選乳白色、表面光滑、結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個(gè)供試材料分別接種8瓶，每瓶接種8塊愈傷組織塊。

1.2.4 培養(yǎng)方法 花藥培養(yǎng)分為誘導(dǎo)培養(yǎng)階段和分化培養(yǎng)階段，誘導(dǎo)階段于26～28℃下暗培養(yǎng)，于接種后2～3 d統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)瓶中所接種的花藥枚數(shù)，接種后30～60 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織塊數(shù)；分化階段先暗培養(yǎng)3 d，后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)，使其有一個(gè)過渡適應(yīng)階段，更快適應(yīng)轉(zhuǎn)換了的環(huán)境，進(jìn)而提高分化力。一般光培養(yǎng)的光照時(shí)間為10～12 h/d，光強(qiáng)1 000～1 500 lx，室溫保持26～28℃，分化培養(yǎng)45 d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)綠苗叢數(shù)、白苗叢數(shù)等。

整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析，確定各材料在不同培養(yǎng)基中對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率和后續(xù)分化效果的影響。

利用SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。一般的數(shù)據(jù)處理用Excel，統(tǒng)計(jì)分析用SAS 9.1.3軟件，差異顯著性用鄧肯氏新復(fù)極差法測驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y58S不同雜交組合F2代在不同培養(yǎng)基中的花藥培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 Y58S不同雜交F2代的愈傷誘導(dǎo)情況 對(duì)不同培養(yǎng)基中的水稻材料的出愈率（愈傷組織誘導(dǎo)率）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析結(jié)果（表2）表明，Y58S/02428的雜交F2代和Y58S/合豐占F2代在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上其誘導(dǎo)率有所不同。 可能由于02428是粳稻材料，而合豐占是秈稻材料，所以含有粳稻血緣的Y58S/02428組合的誘導(dǎo)率會(huì)高一些。其中，Y58S/02428組合在G培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，為14.33%，而Y58S/合豐占組合反而最低，只有1.57%。而在同一個(gè)雜交組合內(nèi)，誘導(dǎo)率也存在差異，Y58S/02428組合在G培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率可達(dá)到14.33%，其次分別為12.55%（D培養(yǎng)基）、11.71%（I培養(yǎng)基）、11.12%（E培養(yǎng)基），而在B培養(yǎng)基上才4.27%；Y58S/合豐占組合在E培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率表現(xiàn)最高，為8.38%，培養(yǎng)基D （7.18%）、B（6.30%）次之，而在G培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率表現(xiàn)最低，僅為1.57%，說明不同的培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率有一定影響，而不同血緣的材料對(duì)培養(yǎng)基的要求也有所不同。

表2 Y58S不同雜交組合在不同培養(yǎng)基的花藥誘導(dǎo)情況

對(duì)兩種不同的雜交組合在10種培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率進(jìn)行雙因素有重復(fù)的方差分析，結(jié)果（表3）表明，材料間與培養(yǎng)基間的差異均達(dá)到極顯著水平，這證明了不同雜交組合的花藥來源以及培養(yǎng)基的類型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響顯著。進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)率進(jìn)行多重比較（統(tǒng)一使用Duncan新復(fù)極差測驗(yàn)）的結(jié)果表明，在不同雜交組合方面，Y58S/02428組合的平均誘導(dǎo)率為9.37%，顯著高于Y58S/合豐占組合（4.54%）；而在培養(yǎng)基方面（表4），使用C培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)，所得到的誘導(dǎo)率是最低的，僅為4.40%；而D培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，為9.95%，E培養(yǎng)基（9.82%）次之，但兩者差異不顯著，因而可以將這兩種培養(yǎng)基視為較為適合于花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表3 Y58S不同雜交組合在不同培養(yǎng)基花藥誘導(dǎo)率的方差分析

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)花藥誘導(dǎo)率的多重比較分析

2.1.2 Y58S不同雜交F2代的愈傷分化情況 將10個(gè)不同雜交組合F2花藥誘導(dǎo)出來的愈傷組織轉(zhuǎn)移到相同的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行后續(xù)分化培養(yǎng)，并對(duì)其愈傷組織分化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表5）顯示，不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出來的愈傷組織因質(zhì)量水平不同，分化情況各異，部分出現(xiàn)零分化。綠苗分化率方面，最高值表現(xiàn)在F培養(yǎng)基上（75.00%），但只Y58S/合豐占組合有分化，而 Y58S/02428雜交組合卻是零分化；對(duì)于Y58S/02428雜交組合，最高綠苗分化率出現(xiàn)在培養(yǎng)基E上（25.00%），對(duì)應(yīng)Y58S/合豐占的分化率為15.38%（圖1）。總的來說，E培養(yǎng)基對(duì)于不同材料的綠苗分化率較為有利，廣譜性較強(qiáng)。

在花藥培養(yǎng)力（綠苗產(chǎn)率）方面，兩個(gè)雜交組合在誘導(dǎo)培養(yǎng)基E和誘導(dǎo)培養(yǎng)基B上表現(xiàn)稍好，且培養(yǎng)基E（2.78%、1.29%）更優(yōu)于培養(yǎng)基B （0.36%、0.35%）。誘導(dǎo)培養(yǎng)基E較為適合Y58S不同血緣材料的花藥培養(yǎng)，且具有一定的廣適性。Y58S/02428組合的花藥培養(yǎng)力均高于Y58S/合豐占雜交組合，表明轉(zhuǎn)入粳稻血緣有利于花培效力的提高，這與前人研究結(jié)果相同［6］。

表5 Y58S不同雜交組合在不同培養(yǎng)基的愈傷分化率

圖1 Y58S不同雜交組合在不同培養(yǎng)基的綠苗分化率

白苗分化率方面，除了出現(xiàn)零分化的培養(yǎng)基，A培養(yǎng)基對(duì)于兩個(gè)雜交組合的白苗分化率都比較低，在Y58S/02428為1.04%、Y58S/合豐占為4.76%，其次是E培養(yǎng)基，Y58S/02428與Y58S/合豐占雜交組合的白苗分化率分別為8.33%、7.69%。表明誘導(dǎo)培養(yǎng)基A與誘導(dǎo)培養(yǎng)基E在控制白苗分化的水平上表現(xiàn)較好。

2.2 Y58S不同雜交組合F2花藥培養(yǎng)后代的田間表現(xiàn)

2.2.1 花藥培養(yǎng)后代的倍性觀察 經(jīng)過對(duì)花藥培養(yǎng)后代植株利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行初步倍性鑒定并結(jié)合田間種植表現(xiàn)觀察，結(jié)果（表6）表明：在當(dāng)代花藥培養(yǎng)植株中發(fā)現(xiàn)較多的二倍體植株（48.00%），少部分為單倍體（23.05%）、四倍體植株（7.19%），尚未發(fā)現(xiàn)非整倍體。其中，單倍體表現(xiàn)為植株矮小，葉片較小，根細(xì)?。凰谋扼w表現(xiàn)為植株較高、粗壯，葉片較寬，根較粗壯；而二倍體則處于這兩者間，并與原生種相似。

表6 花藥培養(yǎng)植株當(dāng)代的倍性表現(xiàn)

2.2.2 花藥培養(yǎng)后代的育性觀察 Y58S/02428與Y58S/合豐占兩個(gè) F2代組合獲得的花培后代的田間表現(xiàn)以偏粳型較多，結(jié)合花藥培養(yǎng)后代的育性觀察與鏡檢鑒定，同時(shí)從花培后代篩選出花粉不育且柱葉型表現(xiàn)較好株系6株，割兜留禾頭，待其孕穗、育性轉(zhuǎn)育敏感期移至人工氣候箱處理，成功轉(zhuǎn)育并收獲株系2株。2015早造繼續(xù)種植，其中一個(gè)來自Y58S/02428 F2代組合的花培后代株系的株葉型表現(xiàn)較好，育性觀察與鏡檢結(jié)果（圖2、圖3，封二）顯示為典敗類型，其育性穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步的研究觀察。

3 結(jié)論與討論

一般情況下，秈稻品種其花藥培養(yǎng)力較低，粳稻培養(yǎng)效率較高，秈粳雜交后代居中［9］。本研究以光溫敏核不育系Y58S為材料，對(duì)其不同雜交組合F2代進(jìn)行花藥培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)，不同基因型材料對(duì)花藥培養(yǎng)力影響極為顯著。不同雜交組合其花藥培養(yǎng)力也有所不同，與其雜交導(dǎo)入的外源基因有一定的關(guān)系，對(duì)于光溫敏核不育系Y58S來說，雜交組合Y58S/02428培養(yǎng)效果優(yōu)于雜交組合Y58S/合豐占，說明導(dǎo)入粳稻血緣能提高不育系的花藥培養(yǎng)力，并與前人研究結(jié)果相同，但導(dǎo)入粳稻血緣含量高低對(duì)秈稻花藥培養(yǎng)力影響大小還有待于進(jìn)一步研究。另外，培養(yǎng)基類型是影響花藥培養(yǎng)力的重要影響因素。對(duì)于不同的基因型材料，需要的培養(yǎng)基成分組成不同。一般情況下，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，N6適于粳稻、SK3適于秈粳雜交、合5適于秈稻、通用和M8對(duì)秈稻和粳稻均較適用。馮雙華等選用合5、M8和改良M8為基本培養(yǎng)基對(duì)培兩優(yōu)288、P88S/0293、秈型雜交稻兩優(yōu)培九進(jìn)行花培，結(jié)果表明，改良M8培養(yǎng)基比較適合不同的基因型材料［10］。王伍梅等通過多年的試驗(yàn)結(jié)果表明，N6培養(yǎng)基對(duì)多數(shù)秈粳交后代和粳稻的誘導(dǎo)效果都較好［11］。黃慧君等對(duì)不同激素種類以及濃度配比進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)研究表明，秈稻品種要求更高的生長素濃度，并且配合一定濃度的KT，有利于愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗的提高［12］。也有人認(rèn)為，適當(dāng)?shù)慕档蜕L素的濃度，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率有促進(jìn)作用。本研究通過改變培養(yǎng)基配方（包括基本培養(yǎng)基、激素配比以及有機(jī)添加物進(jìn)行綜合調(diào)配），探索到培養(yǎng)基E是適合光溫敏不育系的培養(yǎng)基，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用NMB培養(yǎng)基和激素配比2，4-D∶NAA∶KT為2∶2∶1較為適合，但秈稻花藥培養(yǎng)力與粳稻相比仍有一段距離，還需要進(jìn)一步探究最佳的培養(yǎng)基成分。

愈傷組織在誘導(dǎo)階段往往會(huì)發(fā)生變異，出現(xiàn)染色體成倍增加、減少或缺失等，從而使花藥培養(yǎng)后代出現(xiàn)多倍體、單倍體或非整倍體等，因此對(duì)花藥培養(yǎng)后代進(jìn)行倍性鑒定尤為重要。

水稻花藥組織培養(yǎng)后產(chǎn)生的植株除單倍體外，還會(huì)有二倍體、三倍體以及各種異倍體［13］，花藥植株倍性發(fā)生變異主要是由于離體培養(yǎng)細(xì)胞染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在花藥培養(yǎng)中發(fā)生異常有絲分裂。如要獲得單倍體或純合二倍體，不但要做好倍性鑒定工作，前期培養(yǎng)條件也很重要。花藥培養(yǎng)易受到體細(xì)胞的干擾，在產(chǎn)生單倍體的同時(shí)也產(chǎn)生二倍體或四倍體；同時(shí)單倍體細(xì)胞的生長很容易被生長旺盛的多倍體細(xì)胞所掩蓋［14］。本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞分析法鑒定花藥組織培養(yǎng)后代的倍性為輔助手段，并結(jié)合田間觀察方法，抽樣花藥培養(yǎng)苗為185株，其中二倍體的平均頻率最高；其次為單倍體；而多倍體出現(xiàn)的頻率，未發(fā)現(xiàn)非整倍體、嵌合體等現(xiàn)象。表明光溫敏不育系Y58S/02428與Y58S/合豐占兩個(gè) F2代與其他水稻材料一樣，經(jīng)過花藥組織培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生自然加倍，并且受到多重因素的影響，其中兩個(gè)組合獲得的花培后代的田間表現(xiàn)以偏粳型居多，通過育性與田間表現(xiàn)篩選，其中一株來自Y58S/02428組合的不育單株表現(xiàn)較好將留作進(jìn)一步深入的研究，期望獲得具有一定育種價(jià)值的育性穩(wěn)定純合的新兩系不育系材料。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明利用光溫敏核不育材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)可以加速兩系不育系的選育，同時(shí)開展的花藥培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，提高并改善花藥培養(yǎng)力，能有效服務(wù)于光溫敏核不育系水稻的提純以及水稻育種工作。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Primary research on anther culture of photothermosensitive genic male sterile rice “Y58S”and selection of descendant of anther culture

HUANG Cui-hong，YANG Gui-li，HUANG Ming，ZHOU Dan-hua，LIU Yong-zhu，GUO Tao，CHEN Zhi-qiang，WANG Hui
（National Engineering Research Center of Plant Space Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The combination of anther culture techniques and traditional sterile lines breeding can effectively speed up the improvement of photo-thermosensitive genic male sterile（PTGMS） lines.To screen for the optimal culture medium for the two-line male sterile line，Y58S，we studied the effects of 10 different culture mediums on the F2generation of different cross combination between Y58S and selected male parents.The results showed that medium E（NMB+2 mg/L 2，4-D +2 mg/L NAA+1 mg/L KT+0.5 g/L Pro+0.5 g/L Gln+0.5 g/L CH+25 g/L sugar+25 g/L Maltose+10 g/L Agar）was more effective for anther culture of PTGMS lines.And introducing japonica rice by cross breeding improved anther culture ability of PTGMS lines，indicating that genetype played an important role in rice anther culture.The examination on traits in field of descendants displayed that most of the plants were diploid，some were haploid and tetraploid，and no non-integer ploidy，and a new PTGMS lines was screened.

rice；PTGMS lines；Y58S；anther culture；descendant of anther culture

S511.0353

A

1004-874X（2016）05-0031-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.007

2016-01-28