miR-19b-1在腎癌中的表達(dá)及臨床意義的研究

胡　佳，金　露，何　韜，史本濤，來永慶，倪梁朝

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州　510182；2. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳　518036)

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·基礎(chǔ)研究·

miR-19b-1在腎癌中的表達(dá)及臨床意義的研究

胡佳1,2，金露2，何韜1,2，史本濤2，來永慶2，倪梁朝2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州510182；2. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳518036)

摘要：目的檢測腎癌細(xì)胞(ACHN、786O、769P)與人胚腎細(xì)胞(HEK-293T)、腎癌及對應(yīng)癌旁組織的miR-19b-1的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。 方法利用qPCR技術(shù)檢測miR-19b-1在腎癌細(xì)胞與人胚腎細(xì)胞、腎癌組織與配對組織中的表達(dá)量，運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)方法分析其與臨床病理之間有無相關(guān)性。結(jié)果miR-19b-1在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)量比正常細(xì)胞高，在腎癌組織中的表達(dá)量是對應(yīng)癌旁組織的2.2倍，且其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與患者的年齡、性別及病理分期無關(guān)(P>0.05)。 結(jié)論腎癌組織及腎癌細(xì)胞中miR-19b-1表達(dá)上調(diào)，提示腎癌的發(fā)生可能與miR-19b-1上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎癌；microRNA；microRNA-19b-1；表達(dá)；病理特征

腎癌(renal carcinoma)亦稱腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)、腎腺癌，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于膀胱癌[1]。腎癌有10余種病理類型，包括透明細(xì)胞癌、乳頭狀狀癌和嫌色細(xì)胞癌等[2]。腎癌的早期癥狀不典型，只有約10%的患者具有典型腎癌三聯(lián)征，即疼痛、血尿、腫塊[3]。腎癌的發(fā)病原因至今不清，其可能的危險因素包括：遺傳、吸煙、肥胖、石棉、高血壓等[4]。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是非編碼RNA(non-coding)家族的新成員，是一類約有22～24個核苷酸長度的小分子，約一半的蛋白質(zhì)編碼基因受其調(diào)節(jié)[5]。主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮其調(diào)控作用，通過對mRNA降解或蛋白質(zhì)翻譯抑制來調(diào)控靶基因。據(jù)報道，miR-19b-1是miR中的重要組成部分，參與人體多種病理生理調(diào)節(jié)[6]，在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤新生血管的形成中扮演了重要的角色[6]。本實(shí)驗(yàn)選取30例手術(shù)切除的腎癌標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織，通過qPCR技術(shù)測算miR-19b-1在腫瘤組織的表達(dá)量，分析其在腎癌發(fā)病機(jī)制中的所起的作用。對miR-19b-1在腎癌發(fā)病機(jī)制中的研究有望為腎癌的治療提供一種有效的新策略[7]。

1資料與方法

1.1標(biāo)本及臨床資料實(shí)驗(yàn)標(biāo)本30對(已獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意)，均來自北京大學(xué)深圳醫(yī)院2013年3月至2014年11月手術(shù)切除的腎癌及癌旁組織(與病灶間隔5 cm以上)，切除的組織在RNA保護(hù)液中儲存，約24 h后置入-80 ℃液氮中保存。每例都有完整的病理學(xué)資料(表1)。其中男20例，女10例，平均年齡為52歲。腎癌的組織學(xué)分型采用國際通行的2004年WHO的分類標(biāo)準(zhǔn)，臨床分型參考國際抗癌協(xié)會TNM分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將腎癌細(xì)胞(ACHN、786O、769P)和人胚腎細(xì)胞(HEK-293T)置于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入全培養(yǎng)基(含90%DMEM培養(yǎng)基、1%谷氨酰胺、1%抗生素、10%胎牛血清)4 mL，在適宜的溫度、適宜的CO2濃度及pH等環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3主要試劑和儀器RNA提取試劑Trizol(Invitrogen,USA)、miRNA專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen,Germany)、普通RT-PCR儀(BIQ-RAD，USA)、miScriptSYBR Green PCR Kit(Qiagen,germany)、ABI PRISM7000熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,USA)、NanoDrop2000c紫外線分光光度儀。相關(guān)普通試劑及實(shí)驗(yàn)常用設(shè)備由北京大學(xué)深圳醫(yī)院廣東省男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4miRNA前期測序及篩選華大基因研究所(Illumina Hiseq2000測序儀)進(jìn)行前期測序，篩選出在腎癌及對應(yīng)癌旁組織的表達(dá)具有差異性的microRNA。miR-19b-1 作為研究對象被選取。

1.5總RNA的提取根據(jù)Trizol說明書的指導(dǎo)，將30對標(biāo)本在-80 ℃液氮中研磨，總RNA由Trizol試劑提取，通過紫外線分光光度儀測量RNA的質(zhì)量及濃度?？俁NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA：參考miScript Reverse Transcription Kit說明書要求，逆轉(zhuǎn)錄在普通PCR儀上進(jìn)行，20 μL的反應(yīng)體系中加入1 μg RNA,將反應(yīng)體系溫度設(shè)置為37 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min,然后稀釋10倍，合成后的產(chǎn)物在-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6熒光定量qPCR檢測miR-19b-1根據(jù)miScript SYBR Green PCR Kit試劑說明書，模板是反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，qRT-PCR反應(yīng)在LC480熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系的總體積為10 μL，其中QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix有 5 μL,miR-19b-1的上游引物(5＇-AGTTTTGCAGGTTTGCATCCAGC-3＇)及下游通用引物miScript Universal primer(Qiagen公司贈送)各有0.4 μL，RNase-free water有3.2 μL。內(nèi)參基因U6snRNA的上游引物為5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游引物為5＇-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。

1.7數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析qPCR儀所得數(shù)據(jù)用U6作為內(nèi)參處理后，再運(yùn)用△△CT法進(jìn)行分析，△CT=CTmiR-19b-1-CTU6,△△CT=△CTRCC-△CTN。最后將得到的△CT通過2-△CT計算還原為miR-19b-1相對表達(dá)量，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后得到正態(tài)分布圖型。miR-19b-1在癌組織中的表達(dá)量是正常組織表達(dá)量倍數(shù)由2-△△CT計算得出。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件分析，比較miR-19b-1在腎癌及癌旁組織中表達(dá)量可用配對t檢驗(yàn)，四格法χ2檢驗(yàn)用于比較miR-19b-1在腎癌及癌旁組織中表達(dá)量與臨床病理之間的關(guān)系，P>0.05時認(rèn)為無統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-19b-1在腎癌細(xì)胞(786O、ACHN)及腎癌組織中表達(dá)上調(diào)通過qPCR檢測miR-19b-1在細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果miR-19b-1在腎癌細(xì)胞(786O、769P、ACHN)中表達(dá)水平顯著高于正常人胚腎細(xì)胞(HEK-293T)(圖1 A)。由2-ΔCT計算miR-19b-1在兩者中相對表達(dá)量(圖1 B)。由2-ΔΔCT計算miR-19b-1在癌組織相對癌旁組織表達(dá)倍數(shù)的平均值為11倍。miR-19b-1的表達(dá)量在癌組織及癌旁組織中比值進(jìn)行Log2(C/N)轉(zhuǎn)換(圖2)，其中表達(dá)下調(diào)有3例(10%)，上調(diào)27例(90%)。

圖1　miR-19b-1在不同細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況

A：miR-19b-1在腎癌細(xì)胞(ACHN、769P、786O)及正常胚腎細(xì)胞(293T)中的相對表達(dá)量。與正常胚腎細(xì)胞相比，miR-19b-1在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)(*P<0.05)；B：miR-19b-1在癌旁及腎癌組織中miR-19b-1的相對表達(dá)量。與癌旁組織相比，miR-19b-1在腎癌組織中高表達(dá)(**P<0.05)。

圖2　30對腎癌組織中miR-19b-1的相對表達(dá)量

與正常組織相比，miR-19b-1在腎癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)(27/30，P<0.05)。

2.2miR-19b-1在腎癌組織中的表達(dá)水平與患者年齡、性別、病理分期及組織學(xué)類型之間無相關(guān)性樣本的高表達(dá)組與低表達(dá)組的分類以miR-19b-1的相對表達(dá)量的平均值2.20為界分為高表達(dá)組、低表達(dá)組。兩組間的年齡、性別、腫瘤病理分期差異均無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1miR-19b-1在腎癌中的表達(dá)與臨床病理(例)

3討論

腎癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%，我國目前的發(fā)病率在6.0/10萬左右[8]。其發(fā)病原因不明，流行病學(xué)調(diào)查顯示部分腎癌的發(fā)病與吸煙、肥胖、高血壓以及一些工業(yè)物質(zhì)如黃曲霉素、放射線等有一定關(guān)系，此外還可能有遺傳因素[9]。腎癌的臨床癥狀不典型，許多患者發(fā)現(xiàn)后已進(jìn)入中晚期，預(yù)后較差[10]。腎癌標(biāo)記物的研究可提高患者的臨床診斷率，對患者的預(yù)后及治療至關(guān)重要[11]?，F(xiàn)已知腎癌的發(fā)生與抑癌基因的失活及原癌基因的激活密切相關(guān)。MiR-19b-1是一種非編碼RNA基因，在腎癌中的表達(dá)失控很常見。對靶基因的沉默取決于miR與靶基因的互補(bǔ)程度，若miR與靶基因完全互補(bǔ)時，則會導(dǎo)致靶mRNA的降解；若互補(bǔ)程度較低時，則會導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制[12]。人們在線蟲中發(fā)現(xiàn)了首個mircoRNA-lin-4,并證實(shí)其對線蟲幼蟲的發(fā)育具有調(diào)控作用，經(jīng)過多年研究證實(shí)，蛋白質(zhì)編碼基因約50%受mircoRNA的調(diào)控，提示在人體內(nèi)可能存在另一種全新的調(diào)控模式[13]。因此對mircoRNA在腎癌調(diào)控中的研究有助于揭示腎癌的發(fā)病機(jī)制。

通過前期測序，選擇在腎癌及癌旁組織中有表達(dá)差異的miR-19b-1作為實(shí)驗(yàn)對象，研究其在腎癌和癌旁組織中表達(dá)的差異性，并對其與臨床病理之間的相關(guān)性做進(jìn)一步研究。結(jié)果證實(shí)，miR-19b-1在腎癌中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，約為2.2倍。據(jù)此推測miR-19b-1在組織中高表達(dá)可能會導(dǎo)致腎癌的發(fā)生，其在腎癌的診斷及預(yù)后方面可能具有重大的臨床價值。另外，miR-19b-1在腎癌組織中的高表達(dá)與患者年齡、性別及病理分期無關(guān)(P>0.05)。

大量文獻(xiàn)報道了miR-19b-1與其他疾病的發(fā)生也具有密切關(guān)系，如乳腺癌[14]、前列腺癌[15]、肺癌[16]等。以肺癌為例，miR-19b-1促進(jìn)了肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)而形成了肺癌細(xì)胞(A549)、還能減少細(xì)胞之間的粘附，這導(dǎo)致肺癌細(xì)胞更容易轉(zhuǎn)移[17]。

MiR-19b-1在腎癌組織中高表達(dá)，或許可以通過某種抑制劑來抑制其在腎癌組織中的表達(dá)，從而為腎癌的治療提供一種新的方法。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-08-22修回日期：2015-09-29

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(No.81101922);廣東省自然科學(xué)基金(No.S2012010008365)

通訊作者:倪梁朝,主任醫(yī)師. E-mail:13609618222@163.com

作者簡介:胡佳(1990-)，男(漢族)，碩士在讀.研究方向：泌尿男生殖系腫瘤. E-mail: 1150416827@qq.com

中圖分類號:R737.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.03.019

Expression and clinical significance of miR-19b-1 in renal cell cancer

HU Jia1,2, JIN Lu2, HE Tao1,2, SHI Ben-tao2, LAI Yong-qing2, NI Liang-chao2

(1. Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182; 2. Department of Urology, Shenzhen Hospital of Peking University, Shenzhen 518036, China)

ABSTRACT:Objective To detect the expression of miR-19b-1 in renal cell carcinoma (RCC), paired tissues, kidney cancer cells (ACHN/786O/769P) and human embryo kidney cell line 293T (HEK-293T), and to analyze its relation with clinicopathological features. MethodsThe expression level of miR-19b-1 in renal carcinoma cells, normal kidney cells, renal tumor and corresponding adjacent tissues was detected with quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and the correlation with clinicopathological features was analyzed.ResultsThe expression of miR-19b-1 in renal tumor cells was significantly higher than in normal renal cells. In RCC tissues, it was approximately 2.2 times than in paired healthy tissues. The difference was statistically significant (P<0.05). It was not related with the patient’s age, gender and pathological stage (P>0.05).ConclusionThe miR-19b-1 was up-regulated in renal cancer tissues and kidney tumor cells, which indicated that it might be related with the occurrence of renal cell carcinoma.

KEY WORDS:renal cell carcinoma; microRNA; microRNA-19b-1; expression level; clinicopathological features