土壤微生物分離純化和分子鑒定實(shí)驗(yàn)研究

吳秋芳，付　亮，路志芳（安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽455000）

土壤微生物分離純化和分子鑒定實(shí)驗(yàn)研究

吳秋芳，付亮，路志芳
（安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽455000）

摘要：通過微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“微生物分離純化和分子鑒定”的實(shí)施，在生物技術(shù)專業(yè)本科生中開展了土壤細(xì)菌的分離、純化和鑒定實(shí)驗(yàn)。學(xué)生在老師的帶領(lǐng)下從太行山采集了土壤樣品，利用平板法進(jìn)行了土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的分離、純化，對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行了16SrDNA序列分析，結(jié)果表明：該細(xì)菌為假單孢桿菌。學(xué)生通過野外采集土樣，實(shí)驗(yàn)室分離純化的實(shí)驗(yàn)過程，既鍛煉了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)動手能力，又培養(yǎng)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，加深了學(xué)生對微生物理論知識的理解，提高了學(xué)生的創(chuàng)新能力。

關(guān)鍵詞：土壤細(xì)菌；分離純化，分子鑒定；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

D01：10.19329/j.cnki.1673-2928.2016.04.010

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是面向生物技術(shù)、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品、發(fā)酵和農(nóng)林等專業(yè)的學(xué)生所開設(shè)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，其教學(xué)目的是，通過微生物實(shí)驗(yàn)的開展，幫助學(xué)生理解課堂基礎(chǔ)理論知識，掌握基本的實(shí)驗(yàn)方法，提高學(xué)生的綜合能力的培養(yǎng)。通過長期的實(shí)驗(yàn)教學(xué)的積累，將“土壤微生物分離純化鑒定”進(jìn)行了凝練和總結(jié)，建立了綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“土壤細(xì)菌分離純化和分子鑒定”，通過對土壤樣品處理中微生物純化分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的研究與探索，豐富了生物技術(shù)專業(yè)的微生物實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的教學(xué)內(nèi)容，使學(xué)生掌握了微生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)操作技能，了解了微生物學(xué)的基礎(chǔ)理論知識，加深了學(xué)生對課堂理論基礎(chǔ)知識的理解，培養(yǎng)了學(xué)生觀察、思考和分析問題的能力，提高了學(xué)生解決問題的能力，激發(fā)了學(xué)生的勇于開拓創(chuàng)新的精神，達(dá)到了培養(yǎng)應(yīng)用型人才的目的［1-3］。

1土壤細(xì)菌分離純化實(shí)驗(yàn)

微生物實(shí)驗(yàn)主要包括環(huán)境微生物的檢測和菌落識別、各類微生物的形態(tài)觀察，生長繁殖的測定，菌種的分離、培養(yǎng)、鑒定和保藏等內(nèi)容［4］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的特點(diǎn)，設(shè)計了微生物綜合實(shí)驗(yàn)“土壤微生物分離純化鑒定”實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有若干實(shí)驗(yàn)組成，所有實(shí)驗(yàn)均為微生物基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生在老師的指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作

1.1.1土壤樣品采集

樣品采集時間為2015年6月1日，地點(diǎn)在太行山大峽谷（E113.514587，N35.640880，海拔：1251.20），裝入事先準(zhǔn)備好的無菌牛皮袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室［5］，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2土壤菌懸液的制備

稱取鮮土樣于盛有滅菌的無菌水的培養(yǎng)瓶（事先放好無菌的玻璃珠）中，室溫下在搖床上充分振蕩，然后逐級稀釋成不同稀釋度待用。

1.1.3培養(yǎng)基的配制

不同微生物的分離培養(yǎng)使用不同的培養(yǎng)基種類。1）細(xì)菌培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，pH調(diào)為7；2）真菌培養(yǎng)使用PDA培養(yǎng)基，pH自然；3）放線菌培養(yǎng)使用高氏一號培養(yǎng)基，pH調(diào)為7。

1.1.4實(shí)驗(yàn)用品的包裝

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)皿5個一捆用報紙包好用橡皮筋扎好，錐形瓶用封口膜封口用橡皮筋扎緊，不同規(guī)格的槍頭裝槍頭盒中，待滅菌后使用。

1.1.5滅菌

將配制好的培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用品以及純凈水在121℃滅菌20min，之后放烘箱烘干待用。

1.2土壤微生物的分離純化

將滅菌的培養(yǎng)基制成平板，待平板冷卻后，將土壤菌懸液10-2、10-3涂平板后進(jìn)行放線菌的形態(tài)觀察培養(yǎng)，將土壤菌懸液10-4、10-5涂平板后進(jìn)行真菌形態(tài)的觀察培養(yǎng)，將土壤菌懸液10-6、10-7涂平板后進(jìn)行細(xì)菌的形態(tài)觀察培養(yǎng)，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌和放線菌培養(yǎng)培養(yǎng)168h觀察菌落長勢，挑單菌落進(jìn)行分離純化3～4次，得到細(xì)菌純種。

1.3土壤微生物的形態(tài)觀察

在分離純化的微生物菌株中，將分離純化后的一株細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征的觀察，記錄單菌落的形態(tài)特征，并使用萊卡顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)的觀察，作為鑒定菌株的依據(jù)。圖1為分離純化的一株細(xì)菌菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落，圖2為萊卡顯微鏡下該細(xì)菌菌株的形態(tài)特征。

圖1：細(xì)菌菌落形態(tài)

圖2：細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)（萊卡顯微鏡下觀察結(jié)果）

1.4土壤微生物的生理生化特征的觀察

將上述分離純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色，明膠反應(yīng)。

圖3為分離純化的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)結(jié)果。

圖3：細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果（萊卡顯微鏡下觀察結(jié)果）

1.5細(xì)菌16S rDNA全序列的測定

將上述分離純化的這株細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA全序列的測定。

1）DNA提?。夯蚪M抽提盒（TAKARA）。

2）16SrDN擴(kuò)增：以細(xì)菌通用引物 F27（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和R14.2（5'-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）（引物均由上海杰里生物技術(shù)有限公司合成）擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA，擴(kuò)增片斷長度大約是1.5 kbPCR產(chǎn)物；

3）目的片段膠回收。膠回收試劑盒（TAKARA）；

4）連接到pMD19-T載體；

5）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TJP10；PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子；

6）測序（上海杰里生物技術(shù)有限公司）。

1.6細(xì)菌16S rDNA序列分析結(jié)果

將分離純化的一株細(xì)菌16S rDNA的全序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中參考數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與假單胞菌基因序列相似性為99%，因此初步判斷該細(xì)菌為假單胞桿菌。

爺爺奶奶照看孫女，因索要“帶孫費(fèi)”，與兒子兒媳對簿公堂，山東淄博市博山區(qū)人民法院日前經(jīng)過審理認(rèn)為，爺爺奶奶幫兒子媳婦帶孫子非法定義務(wù)，因此索要“帶孫費(fèi)”的要求合情合理合法，予以支持。

2土壤微生物分離純化實(shí)驗(yàn)效果

2.1豐富的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極主動性

本項(xiàng)目的土壤微生物的分離純化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括了野外土樣的采集，細(xì)菌、真菌和放線菌的分離純化、形態(tài)觀察、生理特征的觀察、菌落計數(shù)和分子鑒定等內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富，開闊了學(xué)生的視野，增長了學(xué)生的見識。通?；A(chǔ)微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容主要以細(xì)菌為實(shí)驗(yàn)對象開展教學(xué)，學(xué)生因此對細(xì)菌的認(rèn)識較深，而對于真菌和放線菌的認(rèn)識更多地停留在概念上，印象較為模糊，通過本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施，使學(xué)生對細(xì)菌、真菌和放線菌的認(rèn)識進(jìn)一步加深，了解不同微生物種類分離需要使用不同的培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基的PH還直接影響到微生物的分離效果，尤其是放線菌的分離對培養(yǎng)基的種類和PH要求更高。豐富的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容使學(xué)生進(jìn)一步對微生物世界有了新的認(rèn)識，微生物原來這么漂亮，種類這么多，其直觀、鮮明的圖案可勾起學(xué)生的強(qiáng)烈興趣，促進(jìn)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，使枯燥的理論知識在學(xué)生心中升華，促進(jìn)了學(xué)生把理論知識轉(zhuǎn)化成實(shí)踐知識的動力，奠定了科研型和應(yīng)用型人才的培養(yǎng)基礎(chǔ)［6-8］。

2.2野外土樣采集開闊了學(xué)生的視野

學(xué)生在老師的帶領(lǐng)下，到太行山大峽谷采集了野外土壤樣品，土壤中有多種多樣的微生物種類，其野外采集過程開闊了學(xué)生的視野，采集之前的準(zhǔn)備環(huán)節(jié)和采集過程的操作，更使學(xué)生明白實(shí)驗(yàn)結(jié)果的獲得與整個實(shí)驗(yàn)過程有著緊密的聯(lián)系，實(shí)驗(yàn)過程的諸多細(xì)節(jié)對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著重要的影響。

2.3實(shí)驗(yàn)方法的多樣化培養(yǎng)了學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度

土壤樣品中微生物的種類多種多樣，將不同微生物從土壤中分離出來，需要多個實(shí)驗(yàn)步驟，每個步驟都需要若干準(zhǔn)備環(huán)節(jié)組成，為了獲得不同的微生物菌株，選擇了不同的培養(yǎng)基，甚至在培養(yǎng)基中加入了氯霉素等抗生素，來抑制不同雜菌的生長，就是這么嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作，學(xué)生做出的平板中細(xì)菌中混有真菌，真菌中混有細(xì)菌。為了進(jìn)一步純化微生物菌株，學(xué)生做實(shí)驗(yàn)更加認(rèn)真，對微生物進(jìn)行了多次劃線分離后終于得到了純菌落，這個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目著實(shí)培養(yǎng)了學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度，鍛煉了學(xué)生的動手操作能力，培養(yǎng)了學(xué)生了創(chuàng)新的能力［9-11］。

2.4分子生物學(xué)知識激發(fā)了學(xué)生的求知欲

3結(jié)語

土壤微生物分離純化與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目屬于綜合性實(shí)驗(yàn)，有多個實(shí)驗(yàn)組成，系統(tǒng)的把原本孤立的實(shí)驗(yàn)聯(lián)系起來，包括了野外土壤樣品的采集，實(shí)驗(yàn)儀器的使用、實(shí)驗(yàn)器皿的包裝、實(shí)驗(yàn)試劑的配制等，每個實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)都讓學(xué)生參與，鍛煉了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作基本技能，提高了學(xué)生學(xué)習(xí)的積極主動性，豐富了實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新思維，提升了實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平，促進(jìn)了我校微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：郝安林）

中圖分類號：Q93-3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-2928（2016）04-0027-03

收稿日期：2015-12-08

基金項(xiàng)目：安陽工學(xué)院校級基金項(xiàng)目（YJJ2015011）。

作者簡介：吳秋芳（1974-）女，河南安陽人，副教授，在讀博士，研究方向：環(huán)境微生物。

Purification and Molecular Identification Experiments of Microbe in Soil

WU Qiufang，F(xiàn)u Liang，LU Zhifang
（School of Biological and Food Engineering，Anyang Institute of Technology，Anyang，455000，China）

Abstract:With the progress of the microbe experimental project，"purification and molecular identification experiments of microbe"，the purification and molecular identification experiments of bacteria in soil were conducted by biotechnology majors.The students went to Taihang Mountains to collect soil samples and isolated the bacteria，fungi and actinomycetes from the soil and purified the bacteria by using pour plate method and streak plate method.The purified strain was preliminarily identified as Pseudomonas according to the analysis of its 16s rDNA sequence.Students through the field to collect soil samples，the separation，purification of lab experiment process and their practical ability was cultivated and their develop the students'interest in learning enthusiasm in leaming was stimulated.In addition，not only was students'understanding of the basic theoretical knowledge of micrology enhanced but also their creative adility were promoted.

Key words:in soin；isolation and purification；molecular identification；experiment