一種焚燒骨骼的DN A提取方法

凃 政， 石 屹， 張廣峰， 李萬水

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一種焚燒骨骼的DN A提取方法

凃 政， 石 屹， 張廣峰， 李萬水

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

摘要：本文介紹了一種針對燒骨的DNA有效提取方法。對燒骨進(jìn)行研磨制成骨粉，對骨粉進(jìn)行大體系脫鈣和裂解， 采用Amicon?Ultra-15 離心過濾器對獲得的脫鈣、裂解上清液進(jìn)行濃縮，提高DNA的回收率，使用硅膠膜法對濃縮后的DNA溶液進(jìn)行純化，并經(jīng)復(fù)合STR擴(kuò)增檢驗。使用上述方法成功完成兩起嚴(yán)重焚燒骨骼案件的檢驗，確定了受害人身源。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；燒骨；DNA提??；純化；短串聯(lián)重復(fù)序列

骨骼的STR檢驗是當(dāng)前鑒定未知名尸骸身份的一種有效手段。但是在實際辦案中經(jīng)常會遇到焚尸的案件，犯罪分子往往會通過焚燒尸體來達(dá)到毀尸滅跡的目的，此類案件中死者尸體的軟骨等軟組織已經(jīng)完全消失，骨骼開裂碎片化，骨骼內(nèi)的DNA經(jīng)過高溫燃燒，破壞降解十分嚴(yán)重，DNA含量大大降低，難以進(jìn)行檢驗。本文介紹了一種燒骨的DNA提取方法，并已在個案中得到成功的應(yīng)用。

1 試劑與方法

1.1 試劑、儀器

脫鈣液0.5 mol/L EDTA pH 8. 0（Promega，美國），蛋白酶K溶液（20 mg/mL），DTT溶液 （1 mol/ L），骨骼裂解液（Promega，美國），QIAquick?PCR純化試劑盒（Qiagen，德國），PowerPlex?21擴(kuò)增試劑盒（Promega，美國），Identifiler?Plus擴(kuò)增試劑盒（Thermo Fisher，美國）。Amicon?Ultra-15 10K離心過濾器（Millipore，德國），SPEX 6770冷凍研磨機(jī)（SPEX SamplePrep，美國）。

1.2 方法

提取方法參考文獻(xiàn)［1，2］，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。

樣品預(yù)處理 挑選焚燒程度相對較輕、厚度較厚的骨骼，用手術(shù)刀去除燒骨表面層和污垢，用純水沖洗干凈，在 5% （ W/V） 次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，純水洗滌3 次后依次用無水乙醇、乙醚各浸泡10 min，于通風(fēng)櫥中干燥用干凈濾紙包裹后砸成骨粉或用研磨機(jī)研磨成粉。

DNA提取 取適量骨粉（一般取2～5 g），置于50 mL 離心管中，加脫鈣液15 mL和蛋白酶K溶液100 μL，振蕩混勻后置于搖床上脫鈣12 h，離心更換脫鈣液和蛋白酶K溶液，再脫鈣一次。將離心收集的所有脫鈣上清液置于一新的50 mL 離心管中。向收集的脫鈣上清液中分別加入1 mL骨骼裂解液、50 μL DTT溶液以及200 μ L蛋白酶K溶液，于56℃水浴消化過夜；向已脫鈣的骨粉中加入500 μL骨骼裂解液、20 μL DTT溶液以及50 μ L蛋白酶K溶液，于56℃水浴消化12 h，再按前量補(bǔ)加蛋白酶K、DTT，消化2 h以上，期間振蕩3～5次。5000 g離心5 min后取上清液，將兩種上清液合并，并加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）進(jìn)行有機(jī)法抽提，5000 g離心5 min，吸取上層水相采用Amicon?Ultra-15過濾柱4000 g離心濃縮。從Amicon?Ultra-15過濾柱濃縮后的液體置于1.5 mL 離心管中，加入等體積的AL緩沖液，震蕩混勻，70℃孵育10 min后13000 rpm離心3 min，吸取上清液至新離心管中。之后使用QIAquick?PCR純化試劑盒純化：將PB緩沖液與所得的上清液按體積比2∶1混勻，加入到純化柱中，8000 g離心30 s，棄去濾過液。重復(fù)上述步驟直至液體全部過完純化柱。向純化柱中加入700 μL PE 洗滌液，于12000 g離心1 min，棄去濾過液，重復(fù)洗滌一次。12000 g空離2 min，以甩干純化柱中殘余液體。將純化柱置于新的1.5 mL離心管上，加入30 μ L 65℃預(yù)熱的EB 溶液至純化柱的中心，65℃孵育5 min，12000 g離心2 min，收集下層液體用于PCR反應(yīng)或置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR及電泳檢測 使用PowerPlex?21及Identifiler?Plus復(fù)合熒光試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，10 μ L體系，模板采用最大可加入量，循環(huán)數(shù)30個。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AB公司3500XL遺傳分析儀進(jìn)行檢測，GeneMapper ID軟件進(jìn)行STR分型，熒光峰的RFU值設(shè)定為≥50。操作按照相關(guān)試劑和儀器說明書進(jìn)行。

2 案例資料

案例11 2008年12月，出租車司機(jī)高某失蹤。2009年1月，辦案單位在黃河南岸找到可疑焚燒殘留物，其中有三塊疑似骨骼（見圖1左），需鑒定骨骼是否來自高某。經(jīng)法醫(yī)和電鏡檢驗，骨骼均已碳化，外觀呈黑色，三塊骨骼被焚燒程度一致，均可見骨外板、骨內(nèi)板和板障，最大骨塊為4.2 cm × 3.8 cm，電鏡檢見典型的哈氏系統(tǒng)，確認(rèn)燒骨為人骨。取其中一塊骨骼按上述方法進(jìn)行DNA檢驗，其STR分型結(jié)果見圖1右，經(jīng)與親屬樣本比對，死者確系高某。

案例22 2014年2月，胡某（2歲）在回家途中被打死。犯罪嫌疑人購買鐵鍋和汽油將尸體反復(fù)焚燒后拋棄。在訴訟中因“沒有查到尸源，不予案件受理”。辦案機(jī)關(guān)將現(xiàn)場收集到的燒骨碎片（見圖2左）送至本實驗室檢驗。取部分焚燒程度較輕的燒骨片按前述方法進(jìn)行DNA檢驗，STR分型結(jié)果見圖2右，經(jīng)與親屬樣本比對，死者確系胡某。

3 討 論

骨骼由骨細(xì)胞、纖維和基質(zhì)三種成分組成，有大量的鈣鹽沉積于細(xì)胞間質(zhì)，其無機(jī)鹽成分占骨干重的65%～75%，以羥基磷灰石形式［Ca10（PO4）6（OH）2］存在。骨骼DNA提取可利用EDTA的脫鈣作用軟化骨組織，結(jié)合蛋白酶K和表面活性劑對細(xì)胞進(jìn)行裂解，釋放深層骨組織中的DNA。骨骼脫鈣后DNA檢測結(jié)果明顯優(yōu)于未脫鈣結(jié)果，表明脫鈣有助于細(xì)胞間的分散，使骨粉變得粘稠細(xì)膩，能夠被裂解液充分消化［3］。由于DNA是水溶性的大分子，單獨(dú)的脫鈣步驟會因棄去脫鈣液導(dǎo)致DNA損失，有研究［4］表明遺棄的脫鈣液中含有大量DNA，DNA 損失高達(dá)50%以上。本方法收集所有脫鈣液和裂解液，多次采用消化、離心、吸取上清液等步驟減少滯留在骨粉中無法吸出的DNA，盡量獲得所有釋放出的DNA分子進(jìn)行純化，再使用Amicon?Ultra-15 10K離心過濾器去除大量水和小分子，濃縮大分子DNA。此方法已在實際案件燒骨檢材中得到有效的應(yīng)用，還可借鑒到諸如尿液、洗手液等大體系液體的DNA提取中。

圖 1 現(xiàn)場提取的燒骨圖（左）死者高某的燒骨STR分型圖譜（右）Fig.1 Burned bones from scene （left） and STR profi ling of the burned bones （right）

圖 2 現(xiàn)場提取的骨骼碎片（左） 和死者胡某的燒骨碎片STR分型結(jié)果（右）Fig.2 The skeleton fragments from scene （left） and STR profi ling of the victim's burned bone fragments （right）

徐國昌等［5］對成人股骨在不同溫度及時間條件下焚燒后DNA的存留狀況進(jìn)行了研究，伴隨溫度升高和時間延長，檢出的基因座數(shù)目逐漸減少，燃燒溫度在400℃的燒骨樣本能擴(kuò)增出100 bp左右的AMEL等基因座。由于STR 基因座片斷長度的不同，不同基因座抗降解能力有所不同，其檢出率存在差異，片段長度短的基因座抗焚燒能力強(qiáng)，因此使用片段更短的miniSTRs、SNPs、InDels等遺傳標(biāo)記有助于獲得更多的DNA信息。在對燒骨STR檢驗中，往往出現(xiàn)因降解導(dǎo)致的等位基因座間不平衡（見圖1）和等位基因座丟失的現(xiàn)象，為保證獲得結(jié)果的可靠性，建議除采用miniSTR擴(kuò)增外，還應(yīng)綜合使用增加DNA模板用量、多次平行擴(kuò)增等方法對等位基因進(jìn)行確認(rèn)。

骨骼表面顏色可以反映出焚燒時的溫度，因受熱順序和時間差異， 同一骨骼表面色澤由黃色-褐色-深褐色-黑色-灰白色-白色依次進(jìn)行變化［6］。一般條件下，100～200℃骨骼表面呈褐色，250～350℃骨骼表面呈深褐色、黑色，400～450℃骨骼表面呈灰白色，700℃以上呈白色［7］。文獻(xiàn)［8-9］研究表明，有機(jī)質(zhì)的燃燒一直持續(xù)到400℃，無機(jī)質(zhì)的重新構(gòu)建開始于600℃，并顯示不同的形狀；1000℃無機(jī)質(zhì)燒結(jié)在一起并持續(xù)到1400℃，1600℃無機(jī)質(zhì)熔化。隨著焚燒溫度的升高，骨細(xì)胞逐漸失去原有的多邊形、不規(guī)則形，皺縮為圓形、卵圓形，直至消失；細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，400℃僅見少量細(xì)胞殘骸，600℃～1000℃觀察不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。通過對成人股骨進(jìn)行干預(yù)性研究［5-10］，表明500℃以上的焚燒骨骼已很難獲得可比對的STR分型結(jié)果。因此骨骼表面呈現(xiàn)黃色、褐色表明DNA檢驗成功率較高，呈現(xiàn)黑色表明可能還有有機(jī)質(zhì)的存在，白色表明燒骨基本由無機(jī)質(zhì)構(gòu)成，這可以為燒骨檢材選取和樣品預(yù)處理方法提供參考依據(jù)。當(dāng)然，骨骼表面顏色只能作為一種參考，在實踐中還要綜合考慮焚燒時間、保存時間、濕度、微生物、pH值、助燃劑、焚燒方法等因素對燒骨DNA檢驗的影響。

對焚燒尸骸的鑒定還要注意其它技術(shù)的綜合使用。案例1中，通過電子顯微鏡技術(shù)觀察骨骼細(xì)微結(jié)構(gòu)而判斷燒骨碎塊為人骨，進(jìn)行了種屬的推斷。此外，法醫(yī)學(xué)對骨骼損傷的分析、法醫(yī)齒科學(xué)、死者體內(nèi)或佩戴的金屬等不易燃燒物品等都可為焚燒尸骸的身源推斷提供依據(jù)。目前DNA技術(shù)在燒骨的個體識別中因DNA損傷、降解、量微等不利因素影響，其應(yīng)用還受到較大限制。隨著DNA修復(fù)、全基因組擴(kuò)增、單分子擴(kuò)增、單分子測序等技術(shù)的發(fā)展，DNA技術(shù)在燒骨的個體識別中將會發(fā)揮更大的作用。

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中圖分類號：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1008-3650（2016）01-0077-03

收稿日期：2015-07-22

作者簡介：凃 政，主任法醫(yī)師，學(xué)士，研究方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。 E-mail： tudou0426@sina.com

A New DNA Extraction Method for Burned Bones

TU Zheng，SHI Yi，ZHANG Guangfeng，LI Wanshui （Institute of Forensic Sciences，Ministry of Public Security，Beijing 100038，China）

ABSTRACT：This paper introduces a new DNA extraction approach for burned skeletal remains. The burned bones were grinded into powder， and then decalcified and digested in a large volume. Amicon?Ultra-15 centrifugal filter device was adopted to concentrate the supernatant after decalcifi cation and digestion in order to increase the DNA recovery effi ciency. Then the concentrated DNA supernatant was purifi ed using silica gel membrane method. Autosomal STR genotyping was performed with commercial STR typing kits. Using this method， we have successfully identifi ed the severely burned bones in two real cases， providing the key evidences for solving these cases.

KEY WORDS：forensic genetics； burned bone； DNA extraction； purifi cation； short tandem repeat（STR）