糖尿病對(duì)直結(jié)腸癌小鼠生存的影響

劉虹，龔志軍，卿篤桔，李恩就，黎飛江門市中心醫(yī)院胃腸外科，廣東江門　529000

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糖尿病對(duì)直結(jié)腸癌小鼠生存的影響

劉虹，龔志軍，卿篤桔，李恩就，黎飛
江門市中心醫(yī)院胃腸外科，廣東江門529000

［摘要］目的探討糖尿病對(duì)直結(jié)腸癌小鼠生存及預(yù)后的影響。 方法BALB/c小鼠60只，觀察時(shí)間2013年3月—2013 年4月，共4周，小鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為A組：結(jié)直腸癌組，B組：糖尿病結(jié)直腸癌組，C組：對(duì)照組。B組小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立高血糖模型。體外培養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成單細(xì)胞懸液。并將此細(xì)胞懸液注入A、B組小鼠皮下，C組小鼠在皮下注入生理鹽水。觀察各組小鼠的生存時(shí)間、體重差、并發(fā)癥（腸梗阻、腸粘連、血性腹水等）的發(fā)生率及時(shí)間。建模成功4周后處死存活的小鼠，取靜脈血測(cè)定肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶以明確肝腎功能，解剖、大體觀察皮下腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)，病理學(xué)檢查是否有肝臟轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量。結(jié)果處死前稱重，A、B組小鼠體質(zhì)量分別為 （15.38±3.39）g和 （14.65± 2.59）g，與造模前相比明顯減輕（A：19.23±0.25 g，B：21.15±0.33 g），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但A、B組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組小鼠的肝腎功能與造模前相比無明顯變化。A、B組注射部位皮下腫瘤體積比造模前明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且B組體積大于A組。結(jié)論糖尿病能促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，增加并發(fā)癥的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，并可能提高死亡率。

［關(guān)鍵詞］糖尿??；結(jié)直腸癌；小鼠；并發(fā)癥；預(yù)后

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是結(jié)腸癌（colon cancer）和直腸癌（rectal cancer）的統(tǒng)稱，在我國(guó)的發(fā)病率逐年增加［1-2］。結(jié)直腸癌是發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌的消化道腫瘤［3］，但到目前為止，對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明了。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CRC的發(fā)病與糖尿病（diabetes mellitus，DM）關(guān)系密切［4］。DM患者中惡性腫瘤的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群各年齡段的最高發(fā)病率，其中又以消化道腫瘤為多見，結(jié)直腸癌患者的5年生存率在50%～60%［5］。如何延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間、提高生存質(zhì)量并改善預(yù)后是臨床面臨的主要問題。本實(shí)驗(yàn)中我們建立DM及CRC小鼠，以了解DM對(duì)CRC患者生存和預(yù)后的影響。

1資料與方法

1.1材料與試劑

細(xì)胞與主要試劑：小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26，DMEM培養(yǎng)液，吡格列酮（pioglitazone），二甲基亞砜（DMSO），四氧嘧啶，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：6～8周齡的雌性BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量 16～20 g，隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為A組：CRC組，B組：DM CRC組，C組：對(duì)照組。觀察時(shí)間2013年3月-2013年4月，共4周，小鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1 DM造模 B組小鼠采用腹腔注射四氧嘧啶建立高血糖模型。小鼠禁食12 h后，生理鹽水配置提及分?jǐn)?shù)為10%的四氧嘧啶注射液，以250 mg/kg腹腔內(nèi)注射。72 h后取尾靜脈血，2000 r/min離心5min，上層血清用葡萄糖氧化酶法測(cè)定小鼠血糖，若血糖值在11.1 mmol/L ～30.0 mmol/L之間為造模成功。

1.2.2 CRC造模 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，0.25%的胰酶消化傳代，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成濃度為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。將此細(xì)胞懸液直接注射入A、B組小鼠左側(cè)頸背部皮下，建立小鼠結(jié)腸癌CT26模型。8d后注射部位皮下出現(xiàn)小包塊，直徑2～3 mm，視為造模成功。C組小鼠采用相同的方法在左頸部皮下注入生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1大體觀察 接種后觀察各組小鼠有無死亡、并發(fā)癥（腸梗阻、腹泄等）出現(xiàn)的例數(shù)和時(shí)間，并每周測(cè)量體質(zhì)量。

1.3.2血清學(xué)監(jiān)測(cè) 處死前取尾靜脈血，酶聯(lián)免疫分析法測(cè)量尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以監(jiān)測(cè)小鼠肝腎功能。

1.3.3病理學(xué)觀察造模成功4周后處死存活小鼠，剖腹觀察腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)情況，完整取出腫瘤后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)直徑 （a，cm）及其垂直徑（b，cm），計(jì)算腫瘤體積（V，cm3），V=1/2×ab2。再與肝臟組織一起，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，乙醇梯度脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，5 um厚連續(xù)切片。60℃烤箱中放置4 h后于37℃過夜。脫蠟后蒸餾水沖洗3遍，蘇木精-伊紅染色，觀察局部腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)以及有無肝轉(zhuǎn)移。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況

觀察期內(nèi)3組小鼠均無死亡，但A、B組小鼠的活動(dòng)明顯減少和遲緩，進(jìn)食和精神狀態(tài)差，C組小鼠活動(dòng)正常。A、B組小鼠皮下包塊逐漸增大，于第三周時(shí)出現(xiàn)排便減少，有時(shí)有稀便。處死后稱重，A、B組小鼠體質(zhì)量分別為（15.38±3.39）g和（14.65±2.59）g，與造模前相比明顯減輕A：（19.23±0.25）g、B：（21.15±0.33）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但A、B組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　造模前后3組小鼠的體質(zhì)量變化表（±s）

表1　造模前后3組小鼠的體質(zhì)量變化表（±s）

注：與造模前相比*P＜0.05。

組別（n=20）　造模前　　造模后A B C 19.23±0.25 21.15±0.33 20.77±0.31 15.38±3.39* 14.65±2.59* 21.24±0.46

2.2血清學(xué)監(jiān)測(cè)

3組小鼠的肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶與造模前接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3病理學(xué)觀察

C組小鼠注射局部和肝臟均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。A、B組小鼠皮下注射部位均可見明顯的腫塊，邊緣不清楚，與周圍組織連結(jié)緊密，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，其中A組腫瘤體積為 （2.518±0.102）cm3，B組腫瘤體積為 （3.478± 0.159）cm3，均與造模成功時(shí)V=（0.013±0.026）cm3有明顯增大（P＜0.05），且兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，A組小鼠有14只在肝臟發(fā)現(xiàn)占位病變，B組18只小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟占位，均為多發(fā)，病理檢查均證實(shí)為小鼠結(jié)腸腺癌，兩組例數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　造模前后3組小鼠的腫瘤體積變化表（cm3，n=60）

3討論

近年來CRC的發(fā)病率逐漸增高，常規(guī)治療效果并不理想，05年其全球死亡人數(shù)位于第四位，僅次于肺癌、胃癌和肝癌［6-7］。最近的研究表明，DM患者發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)比非DM患者增加了30%，另有研究認(rèn)為與其他人相比，DM患者患CRC的風(fēng)險(xiǎn)高60%，且此患病率與DM病程的長(zhǎng)短密切相關(guān)［8-9］。其原因有學(xué)者認(rèn)為可能與兩種疾病有相同的致病因素（如高蛋白、高脂肪、高熱卡、低纖維素、少運(yùn)動(dòng)等）有關(guān)，也有人認(rèn)為與DM患者體內(nèi)存在胰島素抵抗引起的內(nèi)源性高胰島素血癥、高血糖、氧化應(yīng)激與炎癥以及性激素水平異常有關(guān)［10-11］。也有研究認(rèn)為胰島素及其結(jié)構(gòu)類似物IGF-Ⅰ可能對(duì)CRC的發(fā)生起促進(jìn)作用，并增加患腫瘤的老年男性的死亡風(fēng)險(xiǎn)［12-13］。長(zhǎng)期的高血糖和高胰島素狀態(tài)均不同程度的促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，且胰島素直接進(jìn)入肝臟，故DM患者也較容易發(fā)生肝癌和胰腺癌。本研究中動(dòng)物的CRC采用人工方法造模而成，與DM的各種影響無關(guān)。DM人群患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)較高，分期一般較晚，治療效果差，預(yù)后多不良。有分析認(rèn)為，合并DM的腫瘤患者與無DM腫瘤患者相比，全因死亡率增高，DM組患者的思維風(fēng)險(xiǎn)是非DM組的3.58倍［14-15］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在未化療的結(jié)腸癌患者中，DM與非DM患者的結(jié)腸癌相關(guān)的死亡風(fēng)險(xiǎn)相似［16］。我們的前期研究也認(rèn)為，DM對(duì)結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的影響僅限于接受過術(shù)后化療的患者［17］。這可能與疾病的病程、嚴(yán)重程度及基礎(chǔ)狀態(tài)有關(guān)。DM對(duì)患者一般情況、免疫水平、化療反應(yīng)以及疾病恢復(fù)能力造成負(fù)面影響，從而引起CRC患者抗腫瘤治療的不足。本研究中，DM與非DM小鼠均來自體重相近的健康小鼠，腫瘤造模的時(shí)間一致，疾病的嚴(yán)重程度接近，且我們對(duì)造模過程中外界環(huán)境因素進(jìn)行了比較嚴(yán)格的控制，各項(xiàng)操作均在無菌間進(jìn)行，喂養(yǎng)時(shí)保證充足的光照以及相對(duì)平穩(wěn)的溫度和濕度。排除了可能因素的干擾，更能說明DM本身對(duì)CRC病程和預(yù)后的影響。

CRC可有多個(gè)部位分布，近、遠(yuǎn)、直腸在生理上及胚胎起源上均存在不同，發(fā)病機(jī)制不同，臨床表現(xiàn)也各異［17］。DM合并CRC時(shí)亦可能同時(shí)合并有其他疾病從而掩蓋了癥狀，臨床上患者常以非消化系統(tǒng)疾病的癥狀就診，就診時(shí)已有21.43%的患者有腫瘤轉(zhuǎn)移的征象［15］。近年來的研究提示的發(fā)生部位有由遠(yuǎn)端向近端發(fā)展的趨勢(shì)，可能與DM患者常合并便秘有關(guān)［19］。本研究的結(jié)果顯示，DM組動(dòng)物患結(jié)直腸癌后，各項(xiàng)癥狀比非DM組動(dòng)物表現(xiàn)明顯，主要為體重減輕和消化系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)腸梗阻、腹瀉、腹水等并發(fā)癥，肝臟轉(zhuǎn)移也較非DM組（CRC組）早和迅速，轉(zhuǎn)移腫瘤體積大，數(shù)量多，但肝、腎功能尚在正常范圍，推測(cè)與觀察時(shí)間過短有關(guān)。同時(shí)，由于觀察期僅為4周，DM組和非DM組CRC小鼠均未死亡，故尚不能斷定DM對(duì)CRC死亡率有明顯影響。

胰島素是一種較弱的促生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂從而加速細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡。有學(xué)者認(rèn)為降糖藥物可以通過對(duì)胰島素水平的調(diào)節(jié)從而影響腫瘤的發(fā)生，任何增加胰島素水平（內(nèi)源性/外源性）的治療都有可能增加患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)［20］。我們認(rèn)為目前此項(xiàng)理論尚無明確的證據(jù)支持，且腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)與血糖的控制水平呈正相關(guān)。在下一步的研究中，我們將延長(zhǎng)觀察時(shí)間，同時(shí)對(duì)動(dòng)物血清細(xì)胞因子（如胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-c等）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并輔以一定的藥物治療，以進(jìn)一步探尋DM影響CRC預(yù)后的相關(guān)機(jī)制，為臨床預(yù)后判斷提供更為精準(zhǔn)的信息。

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［中圖分類號(hào)］R735

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］2096-1782（2016）02-0055-04

收稿日期：（2015-11-16）

［作者簡(jiǎn)介］劉虹（1980-），女，湖南株洲人，本科，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤治療，lhpetrel@163.com。

The Effects of Diabetes on Straight Colon Cancer Survival and Prognosis of Mice

LIU Hong，GONG Zhijun，QING Duju，LI Enjiu，LIFei
Department of gastrointestinal surgery，Jiangmen Central Hospital，Jiangmen，Guangdong 529000

［Abstract］Objective To explore the effects of diabetes on straight colon cancer survival and prognosis of mice.Methods Sixty mice were randomly divided into 3 groups（each group was 20）.A:Colorectal Cancer Group；B:Diabetes，colorectal cancer group；C:control group.Mice in B group were abdominal injection of alloxan to set up hyperglycemia model.Colon cancer cell lines mice CT26 was cultured in vitro to logarithmic phase，prepared the single cell suspension，and subcutaneous injection to the mice of A and B group.Mice in C group were subcutaneous injection of saline.The survival time，weight and complications（intestinal obstruction，intestinal adhesion，bloody ascites，etc）were observed.Four weeks after the models were successful，mice were executed，and urea nitrogen，creatinine，alanine aminotransferase and aspertate aminotransferase of venous blood were tested to evaluate the function of liver and kidney.Anatomy and gross observation the growth and infiltration of the subcutaneous tumor，pathology check to explicit whether there were liver metastasis and number of metastases.Results All mice were weighed before death，the body mass was［（15.38±3.39）g］and［（14.65±2.59）g］. Compared with before the model［（19.23±0.25）g VS（21.15±0.33）g］，the differences were statistically significant（P＜0.05），and there was no statistical significance between the 2 groups（P＞0.05）.The liver and kidney function of three groups of mice has no obvious change compared with before modeling.The subcutaneous tumor size at the injection site of A and B group was significantly larger than they did before modeling，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.And the volume of group B was greater than the group A.Conclusion Diabetes can promote tumor growth and metastasis of colorectal cancer，increases the incidence of complications and there severity，and may increase mortality.

［Key words］Diabetes；Colorectal cancer；Mice；Complication；Prognosis