施馬倫貝格病毒核蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

秦 敏，郝俊虎，祝 賀，鄒豐才，楊云慶，楊 素，葉玲玲，張永寧，周曉黎，艾 軍（.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 600；.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧夏銀川 7000；.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，云南昆明 608；.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東珠海 90；.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 0009）

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施馬倫貝格病毒核蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

秦 敏1，郝俊虎2，祝 賀3，鄒豐才1，楊云慶3，楊 素4，葉玲玲3，張永寧5，周曉黎3，艾 軍3
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧夏銀川 750002；3.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，云南昆明 650228；4.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東珠海 519015；5.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029）

摘 要：參照NCBI公布的施馬倫貝格病毒（SBV）的N基因開放閱讀框序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)含特異性酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增SBV N基因，將其克隆于昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacHTB，然后以該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N，將該重組穿梭質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf 9昆蟲細(xì)胞，得到表達(dá)SBV重組N蛋白的桿狀病毒。通過SDS-PAGE和Western blot對(duì)重組N蛋白進(jìn)行鑒定，表明該蛋白得到表達(dá)。本研究為以SBV核蛋白為基礎(chǔ)的相關(guān)檢測(cè)方法的建立提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：施馬倫貝格病毒；核蛋白；桿狀病毒；昆蟲細(xì)胞；表達(dá)

施馬倫貝格?。⊿B）是一種新發(fā)動(dòng)物傳染病，病原為施馬倫貝格病毒（SBV），屬于布尼亞病毒科、正布尼亞病毒屬。正布尼亞病毒直徑為80～120 nm，其基因組分為大（L）、中（M）、小（S）3 個(gè)RNA節(jié)段，長(zhǎng)度分別為6.5 kb、4.5 kb、1 kb，其總分子質(zhì)量約為（6～7）×106ku。S節(jié)段編碼為核衣殼蛋白（N）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）；M節(jié)段編碼為多聚糖蛋白，可被宿主蛋白酶切割成Gn、Gc蛋白；L節(jié)段編碼為病毒RNA依賴的RNA聚合酶L蛋白。其中N蛋白由702個(gè)核苷酸編碼，分子質(zhì)量約為25.6 ku［1-2］。

2011年11月，SBV首次從德國(guó)的病奶牛（發(fā)熱，奶量減少）中被分離到。2012年12月初，荷蘭發(fā)現(xiàn)新生羔羊出現(xiàn)先天性畸形，并從羔羊的腦組織中檢測(cè)和分離出SBV。截至2014年5月，德國(guó)、荷蘭、比利時(shí)、瑞士、英國(guó)、法國(guó)、盧森堡和意大利等國(guó)家陸續(xù)檢測(cè)出SBV陽性樣品，而在歐洲以外的國(guó)家和地區(qū)未見報(bào)道。

SBV可引起牛、山羊、綿羊、野牛等動(dòng)物發(fā)病，主要通過庫(kù)蠓傳播，也可通過胎盤垂直傳播。SB主要的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、乏力、產(chǎn)死胎和畸形胎、產(chǎn)奶量下降、新生幼畜先天缺陷等，嚴(yán)重影響牲畜生產(chǎn)性能，危害畜牧業(yè)發(fā)展［3］。歐洲是我國(guó)種畜引進(jìn)及畜產(chǎn)品進(jìn)口的主要來源地區(qū)之一，基于SBV可能對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)帶來的風(fēng)險(xiǎn)，研究該病毒的檢測(cè)方法具有重要意義。本研究通過將SBV N基因重組于昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，并將其在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)蛋白的獲得可為該病毒檢測(cè)方法的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞

SBV-N質(zhì)粒（攜帶SBV N基因的重組質(zhì)粒）、針對(duì)SBV N蛋白的單抗1F2、兩種SBV N純化蛋白（帶組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白His-SBV-N，蛋白分子量約30KD及帶麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的融合蛋白MBP-SBV-N，蛋白分子量約70KD）由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所張永寧博士惠贈(zèng)；pFastBacHTB質(zhì)粒、Bacmid-GFP（可表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌）、Top10 E.coli和DH10Bac E.coli菌種及Sf 9細(xì)胞由云南出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家級(jí)蟲媒病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

小量凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自AxyGEN公司；Primer STAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶BamH I和Pst I、T4連接酶，LA Taq酶、DNA Marker（DL2000、DL10000）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker IV購(gòu)自天根生化科技有限公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas公司；胎牛血清（FBS）、Grace's 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、Cellfectin II轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；EDTA、SDS、β-巰基乙醇等購(gòu)自上海生物工程公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯（LB）和營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自中國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；山羊抗小鼠IgG/辣根酶（HRP）標(biāo)記購(gòu)自Southern Biotech公司；DAB顯色試劑購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)SBV（GenBank登錄號(hào)：HE649914.1）堿基序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于N基因的擴(kuò)增和鑒定，SBVF：5'-TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3'；SBVR：5'-ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'；下劃線分別為BamⅠ和PstⅠ限制性酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為722 bp。參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊(cè)，合成用于鑒定DH10Bac桿粒的通用引物（M13），M13 Forward：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13 Reverse：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。引物由寶生物公司合成。

1.4目的基因的擴(kuò)增

以SBV-N質(zhì)粒為模板、SBVF/SBVR為引物，對(duì)SBV N基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增得到目的片段。

1.5克隆載體pMD18T-SBV-N的構(gòu)建與鑒定

將擴(kuò)增得到的目的片段與pMD18-T Vector于16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂板，倒置平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取形態(tài)良好的單菌落，進(jìn)行PCR并測(cè)序鑒定。

1.6質(zhì)粒pMD18T-SBV-N與pFastBacHTB的提取

將凍存的含有pMD18T-SBV-N質(zhì)粒的Top10 E.coli與含表達(dá)載體pFastBacHTB的Top10 E.coli復(fù)蘇后擴(kuò)大培養(yǎng)，采用AxyGEN公司的小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，于-20℃保存。

1.7重組供體質(zhì)粒pFastBacHTB-SBV-N的構(gòu)建與鑒定

將pMD18T-SBV-N與pFASTbacHTB質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamⅠ和PstⅠ于37℃進(jìn)行雙酶切，酶切后分別回收，酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂板，倒置平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取形態(tài)良好的單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，陽性菌提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、測(cè)序鑒定。

1.8重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N的構(gòu)建與鑒定

重組供體質(zhì)粒pFastBacHTB-SBV-N轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet）、慶大霉素（Gen）的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)良好的單菌落，用SBVF/ SBVR引物與M13引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.9重組穿梭質(zhì)粒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

參照 Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionSystem使用說明手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N和Bacmid-GFP在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Sf9昆蟲細(xì)胞，其中Bacmid-GFP轉(zhuǎn)染作為陽性對(duì)照。28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況于96～120 h左右收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心10 min，上清液即為重組桿狀病毒液。經(jīng)傳代得到第二代病毒，用于Western blot分析，結(jié)果為陽性時(shí)可以將其分裝，凍存作種毒。

1.10重組蛋白的SDS-PAGE鑒定和Western blot分析

1.10.1SDS-PAGE鑒定。使用Bio-Rad mini電泳儀，參照Bio-Rad mini電泳儀操作手冊(cè)說明書，對(duì)重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。同時(shí)做兩塊凝膠，一塊用于染色分析，另一塊用于Western blot分析。電泳結(jié)束后，剝離出的凝膠先用蒸餾水沖洗，再用考馬斯亮蘭染色液浸泡凝膠，放在搖床上室溫染色1h。染色完成后，用考馬斯亮蘭脫色液脫色至背景無色透明，自然光下觀察電泳結(jié)果，參照蛋白質(zhì)Maker和陰性對(duì)照判斷目的蛋白是否已經(jīng)表達(dá)，照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.10.2Western blot分析。用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀將SDS-PAGE凝膠電泳的各蛋白條帶轉(zhuǎn)移至固相載體硝酸纖維素膜上，以抗SBV核蛋白的單克隆抗體1F2（1：1 000稀釋）為一抗、羊抗鼠IgG-HRP（1：3 000稀釋）為二抗進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)一步分析表達(dá)產(chǎn)物。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1目的基因的擴(kuò)增

用引物SBVF/SBVR對(duì)SBV-N質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，在722 bp處出現(xiàn)單一條帶（圖1），大小與理論值相符。

圖1　重組質(zhì)粒SBV-N的PCR擴(kuò)增

2.2克隆載體pMD18T-SBV-N的鑒定

重組質(zhì)粒pMD18T-SBN-N用引物SBVF/SBVR進(jìn)行PCR初步鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為722 bp（圖2），與理論值相符。

圖2　重組質(zhì)粒pMD18T-SBV-N的PCR擴(kuò)增

2.3重組供體質(zhì)粒pFastBacHTB-SBV-N的鑒定

重組質(zhì)粒pFastBacHTB-SBV-N經(jīng)BamⅠ和PstⅠ雙酶切，切出722 bp的SBV N目的基因條帶（圖3），大小與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入的外源目的片段大小及核酸序列是正確的，證明已成功構(gòu)建了重組供體質(zhì)粒pFastBacHTB-SBV-N。

2.4重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N的PCR鑒定

pFastBacHTB-SBV-N轉(zhuǎn)入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)Gen、Kan、Tet 3種抗生素平皿篩選后，提取其DNA，用引物SBVF/SBVR進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為722 bp（圖4）；用M13正向和反向引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物為3 152 bp（圖5），結(jié)果證明轉(zhuǎn)座成功，獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N。

圖4　重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N的PCR擴(kuò)增

2.5重組蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

提取轉(zhuǎn)座桿粒DNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Sf 9昆蟲細(xì)胞，同時(shí)以表達(dá)綠色熒光蛋白的Bacmid-GFP作為轉(zhuǎn)染時(shí)的陽性對(duì)照，28℃培養(yǎng)48 h左右，在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞病變，與正常細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞變大、變圓（圖6a和6b）。轉(zhuǎn)染Bacmid-GFP的昆蟲細(xì)胞在24 h后可觀察到熒光蛋白（圖6c），轉(zhuǎn)染120 h后，表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞達(dá)80%以上（圖6d）。根據(jù)熒光蛋白的表達(dá)情況，可估計(jì)最佳的病毒收獲時(shí)間。

圖5　重組質(zhì)粒Bacmid-SBV-N的PCR鑒定

圖6　重組蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞上表達(dá)（顯微鏡觀察倍數(shù)：10×16）

2.6重組蛋白的表達(dá)鑒定

將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N和陽性對(duì)照Bacmid-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的sf 9昆蟲細(xì)胞，于28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96～120 h左右，收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為種毒。對(duì)經(jīng)傳代得到的第二代病毒（Vbacmid-SBV-N）進(jìn)行SBV核蛋白的表達(dá)鑒定。SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果均表明，重組蛋白成功表達(dá)，蛋白分子量約為29.6KD（圖7a、圖7b）。

圖7　重組蛋白的表達(dá)鑒定

3　討論

SBV是一種新發(fā)動(dòng)物蟲媒病毒，傳播速度快［4］。自2011年首次在德國(guó)被發(fā)現(xiàn)后，已引起全球動(dòng)物疫病防控部門的高度重視，許多國(guó)家已開展了SBV檢測(cè)方法的技術(shù)儲(chǔ)備研究。其中涉及SBV病毒核酸檢測(cè)方法的，有德國(guó)FLI 實(shí)驗(yàn)室推薦的熒光PCR檢測(cè)方法、中國(guó)檢科院建立的LAMP檢測(cè)方法等；涉及SBV血清抗體檢測(cè)的，有中和試驗(yàn)、間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。在血清抗體檢測(cè)方法的研究中，尚未見將在昆蟲表達(dá)的SBV核蛋白用于其ELISA檢測(cè)。

SBV的N蛋白是布尼亞病毒科病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于被病毒感染的動(dòng)物組織和細(xì)胞中［5］。目前，N蛋白已成為SBV分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)的理想靶抗原［1，6-7］。在我國(guó)，中國(guó)檢科院動(dòng)物檢疫研究所先后利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了SBV N蛋白，分別制備了組氨酸標(biāo)記和麥芽糖標(biāo)記的融合SBV N蛋白［8-9］。

本研究基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)于原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)——表達(dá)外源蛋白時(shí)具有完備的翻譯后加工修飾能力，開展了SBV核蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。在表達(dá)SBV蛋白的過程中，為了控制轉(zhuǎn)染過程中因試劑、操作等因素造成的誤差，在轉(zhuǎn)染時(shí)，以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的Bacmid-GFP作為陽性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后通過觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)來驗(yàn)證轉(zhuǎn)染過程的可靠性；在表達(dá)蛋白的電泳、免疫印跡試驗(yàn)中，以中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所張永寧博士惠贈(zèng)的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的SBV N蛋白作為參照［9］，進(jìn)行表達(dá)蛋白的鑒定。通過鑒定，本研究獲得了昆蟲細(xì)胞表達(dá)的SBV N蛋白，今后還將進(jìn)行表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性、特異性、敏感性研究，以期獲得的表達(dá)蛋白能作為SBV ELISA檢測(cè)方法建立中包被抗原的候選物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

中圖分類號(hào)：S852.65+9.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）01-0076-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2013IK050），國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD12B03）

通訊作者：郝俊虎，艾軍

Expression of NP Gene of Schmallenberg Virus in Insect Cells

Qin Min1，Hao Junhu2，Zhu He3，Zou Fengcai1，Yang Yunqing3，Yang Su4，Ye Lingling3，Zhang Yongning5，Zhou Xiaoli3，Ai Jun3
（1.Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650228；2. Ningxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yinchuan，Ningxia 750002；3.Technology Center of Yunnan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Kunming，Yunnan 650228；4.Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai，Guangdong 519015；5.Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029）

Abstract：According to the published genome sequences of Schmallenberg virus in NCBI database，a pair of specifi c primers were designed to amplify the nucleoprotein （NP）of SBV gene by PCR. The amplifi ed fragment was inserted into the baculovirus expression vector pFastBacHTB. After sequencing and analysis，the recombinant plasmid was transformed into E.coli DH10Bac. Recombinant baculovirus was achieved by transfection of the Sf9 cell with Bacmid-N. The recombinant virus was confi rmed via SDS-PAGE and western blotting，showing that N protein was expressed in infected insect cells. The expression of Schmallenberg virus N protein provided the material base to develop SBV nucleoprotein-based assays.

Key words：Schmallenberg virus；N Gene；baculovirus；insect cell；expression