豬流行性腹瀉病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

勞秀杰，王靜靜，鄭東霞，邵春艷，何海建，王曉潔，王志亮，王曉杜，宋厚輝（.浙江農林大學動物科技學院，浙江杭州 00；.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 660；.金華職業(yè)技術學院農業(yè)與生物工程學院，浙江金華 007）

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豬流行性腹瀉病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

勞秀杰1，王靜靜2，鄭東霞2，邵春艷1，何海建3，王曉潔1，王志亮2，王曉杜1，宋厚輝1
（1.浙江農林大學動物科技學院，浙江杭州 311300；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.金華職業(yè)技術學院農業(yè)與生物工程學院，浙江金華 321007）

摘 要：根據GenBank報道的N基因高度保守核苷酸序列，設計并合成一對引物。上下游引物與GenBank中登錄的153株豬流行性腹瀉病毒（PEDV）N基因全長序列匹配度分別是100%和97%。以本實驗室分離流行毒株為模板，利用SYBR Green I熒光染料法進行RT-PCR擴增，獲得擴增產物構建重組質粒作為陽性對照，建立檢測豬流行性腹瀉病毒核酸的方法。同一樣品進行3次重復試驗，變異系數(shù)＜0.9%。通過對臨床樣品進行檢測和測序驗證，核酸檢測結果中的陽性樣品準確率為100%。本研究所建立的熒光定量PCR檢測方法具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點，可用于臨床PEDV的檢測及分子流行病學調查。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；N基因；實時熒光定量RT-PCR；檢測

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起豬的一種高度接觸性腸道傳染病，其特征為嘔吐、腹瀉、脫水［1］。本病主要發(fā)生在當年12月至次年2月，夏季也可發(fā)生，可以感染各年齡階段的豬，其中哺乳仔豬最易感，發(fā)病率可達100%，平均死亡率可達50%。PED最早報道發(fā)生于英國和比利時，隨后在中國、加拿大、匈牙利、德國、日本及韓國等國家流行，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失［2］。PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，編碼4個蛋白，分別為纖突蛋白（Spike，S）、小膜蛋白（Envelope，E）、膜蛋白（Membrane，M）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）。由于蛋白在PEDV病毒中數(shù)目最多，且高度保守，因此可以用此基因建立PEDV分子生物學診斷方法［3-7］。自2010年以來，PED在國內流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失。為了能及時發(fā)現(xiàn)該病毒，避免不必要的經濟損失，本研究根據PEDV高度保守的N基因核苷酸序列，設計合成了一對特異性熒光定量PCR引物并建立了一種可快速、靈敏、特異地檢測PEDV的熒光定量PCR方法。

1　材料與方法

1.1生物材料

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）均由本實驗室保存。

1.2主要試劑

2×SYBR.premix、ExTaq GC、Rox reference Dye II、DNA Maker DL2000、反轉錄試劑盒、質粒小提試劑盒購自Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒購自生工公司；Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；零背景快速連接試劑盒購自TIANGEN公司。

1.3引物設計

根據GenBank登錄的PEDV的N基因核苷酸序列分別在（723-1286 bp）和（1001-1180 bp），用Primer 5.0軟件設計了常規(guī)PCR引物和熒光定量PCR引物。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1和表2。

表1　常規(guī)PCR引物

表2　熒光定量PCR引物

1.4熒光定量PCR檢測體系的建立

1.4.1病毒RNA提取。收集感染了72 h PEDV的Vero細胞沉淀，加入Trizol試劑中，振蕩混勻；然后4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液轉移至空的1.5 mL離心管。加入200 μL氯仿，振蕩15 s，室溫靜置3 min，4℃，1 2000 r/min離心10 min，吸取上清液轉移至空的1.5 mL離心管。加入等體積的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min ；4℃，1 2000 r/min離心10 min，吸取上清液轉移至空的1.5 mL離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后，室溫靜置10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入用DEPC水配制的70 %乙醇洗滌沉淀1次，4℃，12000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥后溶于適量的RNase free水中，用紫外分光光度計測定濃度及純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2cDNA 反轉錄。根據AMV反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，所得cDNA置-20℃保存。

1.4.3常規(guī)PCR擴增。反應體系為：25 mmol/ L MgSO42μL，10× buffer 2.5μL，2 mmol/L dNTP 2.5μL，KOD plus 酶1μL，PEDV cDNA 2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 14μL。反應條件為：94℃3 min，1個循環(huán)；98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，30個循環(huán)；68℃ 5 min，1個循環(huán)。

1.4.4標準模板的制備。按照膠回收試劑盒說明書割膠回收1.4.3擴增的目的片段，并將其與零背景載體連接，隨后轉化到大腸埃希菌Escherichia coli 感受態(tài)細胞DH5α，搖菌提取質粒，經鑒定正確后測定OD260值，將其濃度換算成拷貝/μL，放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 熒光定量PCR擴增。已優(yōu)化的熒光定量PCR反應體系20 μL，其中2×SYBR Green I premix 10 μL，輔助染料0.4 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板1μL，ddH2O 7.8μL。采用三步法擴增反應條件：第一步95℃ 30 s，1個循環(huán)；第二步95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；第三步95℃ 1 min，60℃ 30 s，95℃ 30 s，1個循環(huán)。

1.4.6標準曲線和溶解曲線的建立。以10倍梯度稀釋的陽性標準模板，模板濃度為1×109～1×100copy/μL，進行熒光定量PCR擴增，并設置陰性對照。利用熒光定量PCR儀隨機附帶的軟件分析標準曲線和溶解曲線。

1.4.7靈敏度試驗。以10倍梯度稀釋標準模板，模板濃度為1×109～1×100copy/μL，進行熒光定量PCR擴增，計算出熒光定量PCR檢測模板的最低拷貝數(shù)，設置陰性對照。

1.4.8重復性試驗。對同一陽性標準質粒設三個重復管，用建立的熒光定量PCR方法檢測其重復性，計算其組內變異系數(shù)。

1.4.9特異性試驗。用PEDV熒光定量PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型基因組，確定該方法的特異性。

1.4.10臨床樣品檢測。將采集的多個豬場病豬的肛門棉試子進行處理，提取RNA，用建立的熒光定量PCR方法檢測，同時設陽性和陰性對照。

2　結果

2.1標準品的制備

用特異性引物對PEDV進行PCR擴增，所得目的片段564 bp且無非特異性條帶（圖1），將陽性質粒的測序結果在美國國家生物技術信息中心（NCBI）網站上進行BLAST，同源性達99%。

2.2標準曲線和溶解曲線的建立

用10倍梯度稀釋的陽性標準模板進行熒光定量PCR擴增，模板濃度分別為1×109～1×100copy/μL，用熒光定量PCR儀附帶的軟件分析即得到標準曲線（圖2）和溶解曲線（圖3）。標準曲線R2=1.000，斜率為-3.200，截距為36.58， Eff=105.4%。溶解曲線峰型銳利，熔解溫度一致Tm值為81.7℃，沒有引物二聚體和非特異性產物等其它峰值出現(xiàn)。

圖1　PEDV N基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖2　熒光定量PCR標準曲線

圖3　熒光定量PCR擴增產物的溶解曲線

2.3靈敏度試驗

將質粒標準模板稀釋10個不同濃度，分別是 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL，進行熒光定量PCR擴增，結果顯示檢測有效值至1×100copy/ μL（圖4），比常規(guī)PCR （1×102copy/μL）的靈敏度高100倍（圖5）。

圖4　熒光定量PCR靈敏度分析

圖5　PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.4特異性試驗

分別以TGEV、PRRSV、CSFV和PCV2的核酸作為模板，用PEDV熒光定量PCR檢測，并設陽性對照和陰性對照，結果顯示只有PEDV陽性模板產生熒光信號（圖6），表明設計的熒光定量PCR檢測引物有良好的特異性。

2.5重復性試驗

圖6　熒光定量PCR的特異性分析

選取1×106，1×105，1×104copy/μL的三個標準模板進行擴增，每個標準模板做三個重復進行組內和組間重復性試驗，結果顯示組內重復性試驗的3個標準品的變異系數(shù)低于0.9%（表3）；組間重復性試驗的3個標準品的變異系數(shù)低于0.9%（表4），表明PEDV熒光定量PCR檢測方法有較好的重復性。

表3　熒光定量PCR組內重復性分析

表4　熒光定量PCR組間重復性分析

2.6臨床樣品檢測

采取3個不同豬場疑似PEDV感染的病豬肛門拭子共計18份，收集細胞毒提取核酸進行檢測，結果顯示14份樣品呈現(xiàn)陽性，擴增曲線、溶解曲線見圖7、圖8。擴增所獲得的序列進行測序驗證，結果表明所獲得序列全部為PEDV病毒核酸序列。陽性樣品準確率為100%，表明該樣品存在PEDV核酸。

3　討論

圖7　熒光定量PCR檢測臨床樣品擴增曲線

由于PEDV與TGEV在流行病學、臨床癥狀和病理變化等方面很難區(qū)分，所以建立快速、準確的實驗室檢測方法尤為重要［8-9］。目前檢測PEDV的方法有，PCR技術［10-11］、以RT為基礎的環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）技術［12］、ELISA實驗［13］、膠體金免疫層析實驗［14］、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP）實驗［5］等。PCR技術是近年來發(fā)展起來的新技術，較其他幾種檢測方法更簡便、快速、準確。SYBR Green I 實時熒光定量PCR技術主要是在常規(guī)PCR基礎上加入SYBR Green I 熒光物質對核酸進行定性定量檢測，與常規(guī)PCR比較，具有重復性好、靈敏度高、定量準確、工作效率高、成本低廉等優(yōu)點，并可避免由擴增產物交叉污染所導致的假陽性，同時適用于高度變異的基因檢測。

圖8　熒光定量PCR檢測臨床樣品溶解曲線

由于實時熒光定量PCR檢測技術優(yōu)于其他分子生物學檢測技術，因此被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）認可并推薦應用于畜禽疾病的檢測。然而熒光定量PCR檢測結果受很多因素的影響，如：樣品的來源及處理、提取核酸的方式方法、核酸的質量、實驗操作技能、實驗操作環(huán)境、PCR儀器的選擇、反應體系和反應條件等。其中，最重要的影響因素是引物的設計。因此，在引物設計時要考慮到GC含量、退火溫度、長度、保守性以及與流行毒株的匹配度等方面的問題，在引物設計過程中考慮到的問題越全面，實驗結果越準確、可靠。

本研究根據PEDV N基因設計一對可擴增出564 bp目的片段的引物，構建陽性對照，同時用另外一對擴增180bp的引物進行熒光定量RT-PCR。標準曲線線性關系良好，相關系數(shù)為1.0，擴增效率為105.4%。溶解曲線峰型銳利，熔解溫度一致，Tm值為81.7℃，沒有引物二聚體和非特異性產物。靈敏度高，最低檢出線為1×100copy/μL ；特異性強，與其它豬病病毒無交叉反應；耗時短，整個過程只需105 min，且批內批間重復性試驗的變異系數(shù)低于0.9%。以上結果表明建立的SYBR GreeenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法特異、敏感、快速、重復性好，不僅可以快速準確診斷PEDV，還可用于PEDV流行病學調查、疫苗效價評估和致病機理等方面的研究，適合臨床推廣應用。

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（責任編輯：朱迪國）

中圖分類號：S852.65

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）01-0062-05

基金項目：浙江省科技廳項目（2014C32061，2014C02003）；金華市農業(yè)類重點研究項目（2014-2-003）

通訊作者：宋厚輝，王曉杜

Development of Real-time Quantitative RT-PCR Method for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Lao Xiujie1，Wang Jingjing2，Zheng Dongxia2，Shao Chunyan1，He Haijian3，Wang Xiaojie1，Wang Zhiliang2，Wang Xiaodu1，Song Houhui1
（1.College of Animal Science and Technology，Zhejiang A&F University，Hangzhou，Zhejiang 311300；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；3. School of Agricultural and Biological Engineering，JinHua Polytechnic，Jinhua，Zhejiang 321007）

Abstract：A pair of primers was synthesized according to the conservative sequence of PEDV N genes that have been retrieved from GenBank. The forward and reverse primers were aligned with 153 full-length sequences of PEDV N genes，and exhibited identifi es of 100% and 97%，respectively. The fl uorescent dye SYBR Green I was used to develop the real-time RT-PCR method. The N gene of an isolated PEDV was amplifi ed by RT-PCR，subcloned into a plasmid，and then was used as a positive control. The coeffi cient of variation was less than 0.9% in triplicate assays. Based on positive clinical samples，100% agreement was achieved by using this real-time RT-PCR method. This method would be useful in diagnostic analysis against PEDV in epidemiological investigations.

Key words：porcine epidemic diarrhea virus；N gene；real-time fl uorescent quantitative RT-PCR；test