人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

苑家鑫　　鄒　澄　　田　華　　李麗波　　崔紅霞▲

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床藥理教研室，黑龍江齊齊哈爾　161006；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，云南昆明　650500

人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

苑家鑫1鄒澄2田華1李麗波1崔紅霞1▲

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床藥理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，云南昆明650500

目的探討人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。 方法培養(yǎng)B16黑色素瘤細(xì)胞，同時對其進(jìn)行藥物處理，采用四唑鹽比色（MTT）法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。采用劃痕試驗(yàn)觀察細(xì)胞的愈合情況，評價其轉(zhuǎn)移能力；Transwe11小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲情況。 結(jié)果細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的人參皂苷Rh2 0、25、50、100 μmo1/L對B16黑色素瘤細(xì)胞生存率的影響比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；隨著劑量濃度的增加，經(jīng)人參皂苷Rh2處理的B16黑色素瘤細(xì)胞穿越小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；細(xì)胞遷移的距離隨人參皂苷Rh2劑量濃度的增加而縮短。結(jié)論人參皂苷Rh2能顯著抑制B16黑色素瘤細(xì)胞遷移及抑制細(xì)胞穿越小室，具有抑制細(xì)胞B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲及非定向遷移的作用；隨人參皂苷Rh2劑量增加，其抑制作用增強(qiáng)。

人參皂苷Rh2；B16黑色素瘤細(xì)胞；侵襲；轉(zhuǎn)移

［Abstract］Objective To study the invasion and metastasis abi1ity of Rh2 ginsenosides on B16 me1anoma ce11.Methods B16 me1anoma ce11s was cu1tured and treated with drug.Ce11 vita1ity was detected by tetrazo1ium sa1t（MTT）method.Hea1ing condition of ce11 was observed by scratch test and transfer abi1ity was estimated.Invasion was observed by Transwe11 matrige1 invasion assay.Results Ce11 surviva1 experiment showed that the surviva1 rate of different concentrations of ginseng saponin Rh 20，25，50，100 μmo1/L to B16 me1anoma ce11s had no statistica11y significant difference（P＞0.05）.With the increase of dose concentration，the ginseng of ginsenoside Rh2，B16 me1anoma ce11s through the chamber ce11s was significant1y reduced with the dose effect re1ationship（P＜0.05）；The ce11 migration distance was shorten a1ong with the increasing of Rh2 ginsenosides dose concentration.Conclusion Rh2 ginsenosides can inhibit the migration of B16 me1anoma ce11 and through sma11 room，p1ay the effect of inhibition of invasion and directiona1 migration of B16 me1anoma ce11；With the increasing of Rh2 ginsenosides dose；the inhibitory effect is enhancing.

［Key words］Rh2 ginsenosides；B16 me1anoma ce11s；Attacks；Transfer

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤十分明顯且重要的生物學(xué)特征。大部分的癌癥患者不是因原發(fā)性癌死亡，而是由于后期腫瘤的轉(zhuǎn)移及對靶器官或其他臟器的侵襲。腫瘤的轉(zhuǎn)移啟于腫瘤的惡性侵襲，是多因素、多基因相互共同作用的一個多階段過程，而侵襲是貫穿腫瘤轉(zhuǎn)移的至關(guān)重要環(huán)節(jié)。已有文獻(xiàn)顯示，在初期腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⒛け砻娴氖荏w作為載體，相結(jié)合于基底膜、膠原蛋白、纖粘連蛋白、基質(zhì)成分層粘連蛋白，最后通過多樣化的蛋白酶來對上述物質(zhì)進(jìn)行降解，最后腫瘤細(xì)胞利用自身特有的定向運(yùn)動穿越破損的基質(zhì)或基底膜，最終實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移［1-4］。另外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性基因組的不穩(wěn)定特性也提高了其獲得轉(zhuǎn)移的能力。人參來源于五加科植物人參 （Panax ginseng C.A.Mey）的干燥根，其已有兩千多年的應(yīng)用歷史。人參的化學(xué)成分復(fù)雜，皂苷類為人參的主要活性成分。其中的人參皂苷Rh2是目前研究腫瘤領(lǐng)域較為熱門的一類，其能很好地抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡與分化，控制病情的發(fā)展［5］。近年來，針對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的報道，在基礎(chǔ)和臨床的各個領(lǐng)域均有相應(yīng)不同程度的進(jìn)展和突破。然而，目前關(guān)于人參皂苷Rh2抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的研究，國內(nèi)外較少報道。為此，筆者利用人參皂苷Rh2研究其對B16黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的影響，為進(jìn)一步闡明人參皂苷Rh2作用于腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制提供新的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

B16黑色素瘤細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；人參皂苷Rh2由本課題組分離提取得到，純度大于99%，溶解于DMSO中；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶、BCA試劑、結(jié)晶紫染色液均購自南京寶靈科生物技術(shù)有限公司；四唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；Matrige1購自BD公司。

細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺（Hea1force，中國，型號：TSJH-1212）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國，型號：Forma310）；倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本，型號：IX70-81FZ）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) B16黑色素瘤細(xì)胞用含有10%滅活胎牛血清+1%青霉素+1%鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液在5%CO237℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到95%時以0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，取生長期良好的細(xì)胞。

1.2.2藥物處理 稱取0.0156 g人參皂苷Rh2（人參皂苷Rh2分子式：C36H62O8，分子量：622.87）溶解于50 μL二甲基亞砜（DMSO）中，制成0.5 mo1/L濃度的母液，于-20℃下分裝凍存?zhèn)溆?，臨用前稀釋。

1.2.3細(xì)胞活力的檢測 采用MTT法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。取符合要求的細(xì)胞以每孔3 000個的密度接種于96孔板中，制成細(xì)胞懸液。24 h后加入不同濃度的人參皂苷Rh2（0、25、50、100 μmo1/L），放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT，37℃下孵育4 h后停止，棄取上清加入150 μL DMSO，震蕩10 min，于酶標(biāo)儀下（λ=490 nm）測定各孔的吸光度。

1.2.4劃痕試驗(yàn)取對數(shù)期生長良好的B16黑色素瘤細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶給予消化，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔8×104個接種于64孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞達(dá)到單層融合時，以10 μL移液槍槍頭在培養(yǎng)板上垂直劃線，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，換新鮮的無血清培養(yǎng)液，加入不同劑量（0、25、50、100 μmo1/L）的人參皂苷Rh2，24 h常規(guī)培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的愈合情況，評價其轉(zhuǎn)移能力。

1.2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)制基質(zhì)膜：在Transwe11光滑面聚碳酸脂膜上均勻鋪20 μg Matrige1（10 μL），超凈臺風(fēng)干。細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，計數(shù)，配制含不同濃度人參皂苷Rh2（0、25、50、100 μmo1/L）的無血清細(xì)胞液，并使其終濃度為10×104個/mL，取100 μL分別置于上層小室，取100 μL培養(yǎng)液（含10%FBS）接種于下室，等待12 h后，棄上室培養(yǎng)液，PBS沖洗5次，90%的甲醛固定約10 min，拭去微孔濾膜上室部位未穿越的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色0.5 h，棄染色液，蒸餾水洗滌后自然干燥，光鏡下取相同視野進(jìn)行拍照，并利用10%醋酸脫色，酶標(biāo)儀測定結(jié)果（λ=570 nm），觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較給予單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞存活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的人參皂苷Rh2 0、25、50、100 μmo1/L對B16黑色素瘤細(xì)胞生存率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示該劑量對細(xì)胞本身無毒作用，可進(jìn)一步進(jìn)行B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的研究。見圖1。

圖1　四唑鹽比色法實(shí)驗(yàn)測定人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞存活率的影響

2.2人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲的影響

隨著劑量濃度的增加，經(jīng)人參皂苷Rh2處理的B16黑色素瘤細(xì)胞穿越小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。見圖2～3。

圖2　Transwell實(shí)驗(yàn)觀察人參皂苷Rh2對細(xì)胞侵襲能力的影響

圖3　不同濃度下吸光度值測定結(jié)果

2.3人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

細(xì)胞遷移的距離隨人參皂苷Rh2劑量濃度的增加而縮短，提示人參皂苷Rh2具有抑制細(xì)胞非定向遷移的作用。見圖4。

圖4　劃痕試驗(yàn)觀察人參皂苷Rh2對細(xì)胞非定向遷移力的影響

3　討論

抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是治療及改善腫瘤患者預(yù)后的主要措施。當(dāng)今具有抗腫瘤作用的天然植物化合物，已逐步成為國內(nèi)外關(guān)于該領(lǐng)域研究的關(guān)注點(diǎn)。

黑色素瘤B16細(xì)胞株是生長在C57BL/6小鼠耳根部皮膚的自發(fā)性腫瘤，有報道指出，人參皂苷Rh2能有效瓦解黑色素瘤B16細(xì)胞，阻止黑色素瘤擴(kuò)散。還有人參皂苷Rh2能抑制B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移［5-6］。陶麗華等［7］通過研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2組的C57BL/6N小鼠肺部結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)下降明顯，B16黑色素瘤細(xì)胞對人工基底膜的侵襲能力也顯著降低。同時陶麗華等［8］對人參皂苷Rh2進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2能誘導(dǎo)B16細(xì)胞的分化，使癌細(xì)胞的增殖阻斷在G1期，對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的分化有誘導(dǎo)凋亡的作用。由于人參皂苷Rh2的抗癌機(jī)制與傳統(tǒng)藥物不同，它不具有細(xì)胞毒性，不直接殺傷癌細(xì)胞，也不會傷害正常細(xì)胞，而是通過對癌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)抑制癌細(xì)胞增殖、改變癌細(xì)胞功能，隨著人參皂苷Rh2濃度的升高，黑色素瘤B16細(xì)胞存活率逐步下降［9-11］?？梢姡藚⒃碥誖h2對于瓦解黑色素瘤B16細(xì)胞效果顯著。

本研究劃痕試驗(yàn)中觀察人參皂苷Rh2對細(xì)胞非定向遷移力的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移的距離隨人參皂苷Rh2劑量濃度的增加而縮短，提示人參皂苷Rh2具有抑制細(xì)胞非定向遷移的作用。Transwe11小室實(shí)驗(yàn)觀察人參皂苷Rh2對細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，隨著劑量濃度的增加，經(jīng)人參皂苷Rh2處理的B16黑色素瘤細(xì)胞穿越小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。已有研究顯示，黑色素瘤與基底膜的黏附作用受與層粘連蛋白（LN）受體a6、B4等的影響［12-15］。還有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2可通過改變細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止血管生成和癌細(xì)胞的侵襲，具有誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用［16-23］。

綜上所述，人參皂苷Rh2具有抑制B16黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，能顯著抑制B16黑色素瘤細(xì)胞遷移及抑制細(xì)胞穿越小室，并隨人參皂苷Rh2劑量增加，其抑制作用增強(qiáng)。

［1］王華，周濱，郭星，等.人參皂苷Rh2對肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和細(xì)胞骨架的影響［J］.中國病理生理雜志，2014，27（6）：1226-1229.

［2］程汝濱，葛宇清，黃真，等.人參皂苷Rh2抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能研究進(jìn)展［J］.中南藥學(xué)，2013，11（3）：211-213.

［3］張春晶，于海濤，侯金才，等.S型與R型人參皂苷Rh2對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中國中藥雜志，2014，36（12）：1670-1674.

［4］王立民.人參皂苷Rh2對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2015，（9）：1715-1719.

［5］姜衛(wèi)衛(wèi)，劉嘉.人參皂苷Rb1、Rg3、Rh2抗腫瘤作用與機(jī)制概況 ［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2013，（7）：1634-1637.

［6］夏菁.人參皂苷Rh2（S）通過抑制HDAC誘導(dǎo)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［D］.重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2014.

［7］陶麗華，劉紅巖，韓銳.20（R）-人參皂昔Rh2抗B16一BL6黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2006，33（11）：1505-1506.

［8］陶麗華，高峰，劉紅巖，等.20（R）-人參皂苷Rh2抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究［J］.人參研究，2012，23（4）：203.

［9］Cheong JH，Kim H，Hong MJ，et a1.Stereoisomer-specific anticancer activities of ginsenoside Rg3 and Rh2 in HepG2 ce11s：disparity in cytotoxicity and autophagy-inducing effects due to 20（S）-epimers［J］.Bio1 Pharm Bu11，2015，38（1）：102-108.

［10］Bak MJ，Jeong WS，Kim KB.Detoxifying effect of fermented b1ack ginseng on H2O2-induced oxidative stress in HepG2 ce11s［J］.Int J Mo1 Med，2014，34（6）：1516-1522.

［11］Xia T，Wang JC，Xu W，et a1.20S-Ginsenoside Rh2 induces apoptosis in human LeukaemiaReh ce11s through mitochondria1 signa1ing pathways［J］.Bio1 Pharm Bu11，2014，37（2）：248-254.

［12］Qian M，Yi L，Song-Lin L，et a1.Chemica1 profi1es and anticancer effects of saponin fractions of different po1arity from the 1eaves of Panaxnotoginseng［J］.Chin J Nat Med，2014，12（1）：30-37.

［13］Yi PF，Bi WY，Shen HQ，et a1.Inhibitory effects of su1fated 20（S）-ginsenoside Rh2 on the re1ease of pro-inf1ammatory mediators in LPS-induced RAW 264.7 ce11s［J］. Eur J Pharmaco1，2013，712（1-3）：60-66.

［14］齊曉丹，張春晶，于海濤，等.S型與R型人參皂苷Rh2誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的體外研究［J］.中國醫(yī)藥指南，2011，9（21）：8-10..

［15］游智梅.下調(diào)PGI/AMF基因表達(dá)協(xié)同人參皂苷Rh2對人白血病KG1α作用的體外研究［D］.重慶；重慶醫(yī)科大學(xué)，2014.

［16］張文靜，俞春鶯，吳爐飛，等.二醇組人參皂苷抑制Lewis肺癌生長及NF-кB相關(guān)基因的作用［J］.腫瘤防治研究，2013，40（1）：42-45.

［17］Park HM，Kim SJ，Kim JS，et a1.Reactive oxygen species mediated ginsenoside Rg3-and Rh2-induced apoptosis in hepatoma ce11s through mitochondria1 signa1ing pathways［J］.Food ChemToxico1，2012，50（8）：2736-2741.

［18］Zhang C，Yu H，Hou J.Effects of 20（S）-ginsenoside Rh2 and 20（R）-ginsenoside Rh2 on pro1iferation and apoptosis of human 1ung adenocarcinoma A549 ce11s［J］. ZhongguoZhong Yao ZaZhi，2014，36（12）：1670-1674.

［19］Li B，Zhao J，Wang CZ，et a1.Ginsenoside Rh2 induces apoptosis and paraptosis-1ike ce11 death in co1orecta1 cancer ce11s through activation of p53［J］.Cancer Lett，2014，301（2）：185-192.

［20］張娜，封穎璐.人參皂苷的抗肝癌作用機(jī)制［J］.國際腫瘤學(xué)雜志，2015，42（10）：786-788.

［21］于紅.以提高抗腫瘤靶向性及親和力為目的的人參皂苷衍生物合成［D］.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

［22］高文芹，賈力，趙余慶，等.人參的抗癌作用及其機(jī)制研究進(jìn)展［J］.藥物評價研究，2014，34（1）：53-58.

［23］An IS，An S，Kwon KJ，et a1.Ginsenoside Rh2 mediates changes in themicroRNA expression profi1e of human non-sma11 ce11 1ung cancer A549 ce11s［J］.Onco1Rep，2013，29（2）：523-528.

Invasion and metastasis ability of Rh2 ginsenosides on B16 melanoma cell

YUAN Jiaxin1ZOU Cheng2TIAN Hua1LI LiBo1CUI Hongxia1▲
1.Co11ege of C1inica1 Pharmaco1ogy Teaching and Research Section，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；2.Co11ege of Natura1 Medicine Chemistry Teaching and Research Section，Kunming Medica1 University，Yunnan province，Kunming650500，China

R961.1

A

1673-7210（2016）04（c）-0135-04

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目（H201353）。

2016-01-01本文編輯：趙魯楓）