微生物轉化法制備雙脫甲氧基姜黃素糖苷化產(chǎn)物及其對HepG2腫瘤細胞的抑制作用

李銳，劉芳，李蕓香，賈坤，張秀梅，徐偉，蘇國龍，黃維維，羅靜雯

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039) 2(四川大學 華西藥學院，四川 成都，610041)

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微生物轉化法制備雙脫甲氧基姜黃素糖苷化產(chǎn)物及其對HepG2腫瘤細胞的抑制作用

李銳1*，劉芳1，李蕓香1，賈坤1，張秀梅1，徐偉1，蘇國龍1，黃維維1，羅靜雯2

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039) 2(四川大學 華西藥學院，四川 成都，610041)

摘要雙脫甲氧基姜黃素是一種具有極強抗氧化活性和抗腫瘤活性的天然酚類成分，但是極差的水溶性和穩(wěn)定性制約了其在食品、醫(yī)藥領域的廣泛應用。通過微生物轉化進行結構改造，引入親水性的葡萄糖苷鍵基團是有效解決其水溶性的手段。該研究利用不同微生物體系對雙脫甲氧基姜黃素進行微生物轉化，發(fā)現(xiàn)華根霉Rhizopus chinensis IFFI 3043能夠?qū)㈦p脫甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin，BDMC)轉化為雙脫甲氧基姜黃素-O-葡萄糖苷(BDMC-O-glucoside)，且轉化效率達到63%。研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合(high performance liquid chromatography-mass spectormeter,HPLC-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等檢測手段，確認了BDMC-O-glucoside轉化產(chǎn)物的化學結構，完成了其轉化過程的動態(tài)曲線分析，并通過MTT細胞毒活性法發(fā)現(xiàn)BDMC-O-glucoside對HepG2腫瘤細胞的抑制作用顯著強于BDMC。

關鍵詞雙脫甲氧基姜黃素；華根霉；生物轉化；糖苷化；抗腫瘤

姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖，主產(chǎn)于中國、印度、日本等國家，其提取物主要用于食品添加劑及天然色素生產(chǎn)[1-2]。姜黃素(curcumin)、脫甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、雙脫甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, BDMC)為代表的姜黃素類化合物是姜黃的主要活性成分[3-4]。有研究報道表明，姜黃素類化合物具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥作用以及抗阿爾茨默癥等生理活性[5-8]，雙脫甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, BDMC)在化學結構上缺少2個甲氧基基團(結構式見圖1)，使其在抗氧化和抑制腫瘤細胞生長方面的活性甚至優(yōu)于其他兩種姜黃素[9-11]，且該類化合物無毒副作用，是一種在食品、醫(yī)藥領域極具開發(fā)潛力的天然酚類活性成分。

由于雙脫甲氧基姜黃素水溶性差、結構不穩(wěn)定，使其在食品和醫(yī)藥工業(yè)領域的應用受到極大的限制。其在酸性和中性pH環(huán)境中幾乎不溶，只溶于丙酮、甲醇等少數(shù)有機溶劑，且久置或光照容易分解。因此，保持雙脫甲氧基姜黃素原有生物活性的基礎上，獲得該類成份新的衍生物與類似物，改變其物理、化學性質(zhì)成為近期研究的熱點。其中，天然產(chǎn)物的糖苷化，是一種改變其水溶性的有效手段[12]。但是尚未有通過化學合成將葡萄糖苷鍵與其結合的報道，因為姜黃素類化合物的結構特殊，其獨特的1,7-二芳基庚酸骨架存在烯醇互變體，在化學合成反應中極不穩(wěn)定，容易發(fā)生結構變化。

圖1　雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)的化學結構Fig.1　Chemical structure of bisdemethoxycurcumin (BDMC)

本文利用不同微生物體系對雙脫甲氧基姜黃素進行微生物轉化研究，發(fā)現(xiàn)華根霉(Rhizopuschinensis) IFFI 3043能夠有效地將葡萄糖苷鍵鏈接在雙脫甲氧基姜黃素的羥基基團(-OH)上，形成糖苷化產(chǎn)物，且轉化效率達到63%。我們利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合(high performance liquid chromatograpty-mass spectormeter,HPLC-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等檢測手段，確認了糖苷化轉化產(chǎn)物的結構，完成了轉化過程動態(tài)曲線分析，并通過MTT細胞毒活性法研究了其對HepG2腫瘤細胞的抑制作用。

1材料與方法

1.1試劑與材料

硅膠G (柱色譜用200～300目)為青島海洋化工廠產(chǎn)品。所用試劑乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、甲醇等均為成都科龍試劑產(chǎn)品，分析純。雙脫姜黃素(BDMC)由實驗室分離獲得，純度經(jīng)HPLC檢測達到95%以上。

1.2微生物培養(yǎng)及生物轉化試驗

微生物培養(yǎng)：所有菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，4 ℃下保存于固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基的配制：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，置燒杯中加水1.0 L煮沸30 min，濾除馬鈴薯塊，將葡萄糖20 g加入濾液中，攪拌至完全溶解，再補足濾液至1 L。固體斜面培養(yǎng)基另加2.5%瓊脂。以上培養(yǎng)基分裝后封口，于121 ℃, 1.06 kg/cm2條件下濕熱滅菌30 min。

生物轉化試驗：將菌株接種于300 mL三角瓶中，每瓶盛100 mL液體培養(yǎng)基，25 ℃下于180 r/min搖床上避光培養(yǎng)24 h。吸取其中7 mL菌液置于1 000 mL三角瓶中，每瓶盛400 mL液體培養(yǎng)基，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，當菌絲生長旺盛時，按照每瓶12 mg劑量，加入BDMC底物。對照組：在實驗過程中，設立菌液空白對照組，對照組不加入DMC底物，于180 r/min搖床上25 ℃避光條件下，按照實驗組相同方法進行平行培養(yǎng)。同時設立底物對照組，即未接種微生物的空白培養(yǎng)基中加入相同量的BDMC底物，平行操作后進行分析。

1.3菌種篩選

本實驗對5株真菌(見表1)進行BDMC的生物轉化預試，經(jīng)HPLC分析，若檢測到BDMC經(jīng)生物轉化后被大量消耗，則證明該真菌對BDMC的生物轉化能力較強，以此篩選轉化能力最強的菌株。

表1　五種不同微生物菌株對BDMC的生物轉化預實驗

Note: +++,BDMC大量被轉化; +, BDMC少量被轉化; -, BDMC無法被轉化。

1.4HPLC分析及LC/MS分析

HPLC分析方法：使用Agilent系列1200高效液相色譜儀，配有DAD檢測器。色譜柱：YMC-Pack-ODS-A C18reversed column (250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm) 及Agilent Zorbax SB-C18保護柱 (12.5 mm×4.6 mm i.d., 5 μm)。流動相：乙腈(A)-水溶液(B)，洗脫程序：0～15 min：20%～40% A；8～10 min：40%～54% A；10～24 min：54% A； 24～37 min：54%～95% A。柱溫：30 ℃ ；流速：1.0 mL/min；檢測波長為425 nm。

LC/MS分析方法：LCQ Advantage型離子阱質(zhì)譜儀(Thermo, USA)通過電噴霧離子源(ESI)與Aglient 1200液相色譜儀相連。HPLC流出液經(jīng)分流后進入離子源進行分析。霧化氣為高純氮氣(N2)，碰撞氣為超高純氦氣(He)。質(zhì)譜條件為：鞘氣，45 u；助氣，10 u；進樣毛細管溫度，325 ℃；毛細管電壓，-4 V；透鏡電壓，-45 V。負離子模式檢測，質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1 000。

1.5NMR結構鑒定

1H NMR、13C NMR及2D-NMR采用Bruker Avance III (1H: 400 MHz;13C: 100 MHz)型核磁共振儀測定。

1.6MTT細胞毒活性法

采用MTT法測定轉化產(chǎn)物對HepG2細胞增殖的抑制作用。在DEME低糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng)腫瘤細胞，收集對數(shù)期細胞，按5×104/mL接種于96孔板。將不同濃度的轉化產(chǎn)物溶液(0.5% DMSO為溶媒)準確加入到細胞培養(yǎng)基中，37 ℃,5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于每孔加入20 μL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再想每孔中加入150 μL DMSO溶解結晶物，搖床振蕩10 min后于全自動酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長的OD值。按公式(1)計算細胞存活率：

(1)

分別設計對照組(0.5% DMSO溶劑)和空白組，所有實驗結果均測量3次取平均值。

2結果與分析

2.1菌株選擇

由表1可知，華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043對BDMC的轉化能力最強，通過HPLC檢測到大量BDMC底物被消耗；而釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeACCC 2168對BDMC少量轉化；另外3種菌株：鏈格孢AlternariaalternateAS 3.4578、總狀共頭霉SyncephalastrumracemosumAS 3.264、藍色梨頭霉AbsidiacoeruleaBainier AS 3.3389對BDMC不產(chǎn)生轉化作用。綜合考慮轉化率與提取率等因素，選擇華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043對BDMC進行轉化實驗。

2.2華根霉素RhizopuschinensisIFFI 3043對BDMC的放大生物轉化

按照1.2小節(jié)方法進行放大實驗，向培養(yǎng)的R.chinensis菌液中，每瓶中加入12 mg BDMC的丙酮溶液，共計加入1200 mg底物。繼續(xù)共培養(yǎng)3 d，濾除菌絲，濾液以乙酸乙酯萃取5次，有機相合并濃縮，蒸干獲得5.5 g浸膏備用。

2.3轉化產(chǎn)物的HPLC-MS定性分析

將加入BDMC底物轉化前的菌液和轉化48 h后菌液以乙酸乙酯萃取后，制備檢測樣品，采用HPLC-MS分析獲得BDMC轉化前后的HPLC圖譜(如圖2所示)。BDMC經(jīng)轉化48 h后基本被完全消耗，425 nm檢測波長下在18 min左右檢測到產(chǎn)物1的峰信號，為極性比BDMC更大的轉化產(chǎn)物。

通過對產(chǎn)物1進行ESIMS分析可知，其MS1出現(xiàn)m/z469的[M-H]-分子離子峰，其MS2出現(xiàn)m/z307的雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)的特征離子峰[8]，推測其為丟失162 Da (六碳糖)中性離子產(chǎn)生，而MS2出現(xiàn)的碎片離子m/z187和m/z119均為BDMC

的特征離子峰，此外，UV檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物1的最大紫外吸收波長為414 nm，為姜黃素類化合物的特征吸收范圍。綜合以上檢測結果推導，初步確定轉化產(chǎn)物產(chǎn)物1為雙脫甲氧基姜黃素-O-葡萄糖苷，即BDMC-O-glucoside。

圖2　(A) 轉化前BDMC的HPLC圖譜；(B) 轉化48 h后剩余BDMC和產(chǎn)物1的HPLC圖譜Fig.2　(A) The HPLC chromatograms of BDMC before biotransformation; (B) The HPLC chromatograms of biotransformed product 1 and remnant BDMC after 48 h biotransformation

(A) BDMC-O-glucoside的化學結構及LC/MS裂解途徑; (B) BDMC-O-glucoside的[M-H]- 離子峰及MS2 裂解圖譜; (C) BDMC-O-glucoside的UVmax圖譜圖3　HPLC-DAD-ESI/MS法鑒定轉化產(chǎn)物1(BDMC-O-glucoside)的結構Fig.3　Identification of the biotransformed product 1 (BDMC-O-glucoside) by HPLC/DAD/ESI-MS

2.4轉化產(chǎn)物的分離與NMR結構鑒定

2.2項下浸膏(5.5 g)經(jīng)硅膠柱G色譜分離，以三氯甲烷-(甲醇)(100∶1, 50∶1 和10∶1,v/v)分別進行梯度洗脫。洗脫的餾分經(jīng)薄層色譜檢查，成分相似的餾分合并得到10個部分。餾分8經(jīng)制備液相色譜進一步純化，以甲醇-水(50∶50,v/v)等度洗脫，分離得到轉化產(chǎn)物共計626 mg。

轉化產(chǎn)物產(chǎn)物1為黃色粉末，EIMS在m/z469.2處顯示[M]+峰，提示其分子量為469。其分子量比雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)大162 Da，推測分子中有六碳糖取代。經(jīng)1H NMR、13C NMR及2D-NMR數(shù)據(jù)分析，碳譜中顯示出糖的共振峰，其中ε101.1為端基碳信號(glc-1′)。轉化產(chǎn)物1的C-4′較雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)的C-4′向低場位移至ε150.2 (△ε+0.7)，提示有基團在此處取代；此外，2D-NMR分析中顯示出H (glc-1′)與C-4′較強的HBMC遠程相關，提示糖基取代在BDMC結構的4′-位。參考已發(fā)表文獻[4]，將糖基的碳、氫信號與已知化合物結構對比，確定該糖基為葡萄糖，糖苷鍵為β-構型。經(jīng)過鑒定確認轉化產(chǎn)物1結構與LC/MS推測結果完全一致，轉化產(chǎn)物為雙脫甲氧基姜黃素 4′-O-β-D-葡萄糖苷 (BDMC-O-glucoside); 外觀形狀及1H、13C數(shù)據(jù)如下所示：黃色粉末。UV (MeOH)λmax: 414 nm;1H NMR (acetone-d6, 400 MHz): ε(ppm) 7.62 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-1), 7.61 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 6.9-7.41 (8H, m, H-Ar), 6.78 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2), 6.74 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-6), 6.01 (1H, s, H-4), 5.05 (1H, d, J = 7.2 Hz, Glc-H-1), 3.40-4.30 (6H, m, Glc-H);13C NMR (acetone-d6, 100 MHz): ε(ppm) 184.3 (C-3), 183.4 (C-5), 150.2 (C-4′), 149.5 (C-4″), 149.5 (C-3′), 148.4 (C-3″), 141.4 (C-1), 139.8 (C-7), 129.6 (C-1′), 127.1 (C-1″), 123.5 (C-2), 122.5 (C-6), 122.1 (C-6′), 121.2 (C-6″), 116.6 (C-5′), 115.7 (C-5″), 111.8 (C-2′), 110.3 (C-2″), 101.3 (C-4), 101.1 (glc-1′), 77.2 (glc-2′), 77.1 (glc-3′), 73.7 (glc-4′), 70.5 (glc-5′), 61.5 (glc-6′); ESIMS:m/z469.0 [M-H]-，以上數(shù)據(jù)和參照文獻中BDMC數(shù)據(jù)一致[4]。根據(jù)以上推導，確定轉化合物產(chǎn)物1的結構為：雙脫甲氧基姜黃素4′-O-β-D-葡萄糖苷。

2.5轉化過程的動態(tài)分析

由以上研究結果可得出BDMC經(jīng)華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043轉化后的轉化路徑圖，如圖4所示。本研究進一步考察了再48 h之內(nèi)，BDMC及轉化產(chǎn)物BDMC-O-glucoside在培養(yǎng)液中濃度與培養(yǎng)時間的動態(tài)變化關系。在0、2、4、6、8、12、24、48 h不同時間點取樣，樣品經(jīng)萃取處理后進HPLC在420 nm下檢測，在不同時間點以BDMC和BDMC-O-glucoside的峰面積計算得出動態(tài)變化曲線。如圖5所示，在48 h內(nèi)BDMC被華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043快速轉化，BDMC-O-glucoside的產(chǎn)率達到63%(以峰面積計算)，而在24 h和48 h檢測到BDMC-O-glucoside濃度比12 h略有下降，可能是由于轉化產(chǎn)物的濃度增大，在培養(yǎng)液中由于溶解度不夠造成的不均勻分布導致。

圖4　雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)經(jīng)華根霉R. chinensis IFFI 3043生物轉化的轉化產(chǎn)物Fig.4　Biotransformation of BDMC by R. chinensis IFFI 3043, and its product

圖5　BDMC轉化為BDMC-O-glucoside的轉化動態(tài)分析Fig.5　Biotransformation kinetics of BDMC to BDMC-O-glucoside

2.6BDMC-O-glucoside與BDMC的抗腫瘤活性比較

為研究BDMC-O-glucoside對腫瘤細胞的抑制作用，實驗設立BDMC組作為對照。實驗方法同1.6。結果顯示在各個不同濃度的實驗組別中，BDMC-O-glucoside比BDMC對HepG2肝癌細胞都有更好的抑制作用(P<0.05)(見圖6)，當BDMC-O-glucoside的濃度為40 μmol/L時，HepG2細胞存活率僅為18.7%，而BDMC組的HepG2細胞存活率為37.8%。由于葡萄糖苷鍵的存在，轉化產(chǎn)物BDMC-O-glucoside相比原型成分BDMC的極性和水溶性都得到了提高，通過生物轉化引入極性基團-葡萄糖苷鍵可能是其抗腫瘤細胞活性增強的原因。

圖6　BDMC與BDMC-O-glucoside對HepG2肝癌細胞的抑制作用比較研究Fig.6　The comparison of inhibitory effect to HepG2 cells between BDMC and BDMC-O-glucoside

3”結論

本實驗以雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)為目標，通過對不同微生物菌株的篩選，確定了華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043對BDMC有最強的轉化能力；以HPLC檢測建立了底物與轉化產(chǎn)物之間轉化過程的動態(tài)曲線分析；通過LC/MS方法推測轉化產(chǎn)物結構，并通過放大實驗獲得大量轉化產(chǎn)物純品進行NMR測試，最終確認其結構為雙脫甲氧基姜黃素 4′-O-β-D-葡萄糖苷 (BDMC-O-glucoside)；此外，通過MTT法初步證明了BDMC-O-glucoside對HepG2腫瘤細胞的抑制作用比底物BDMC更強。本項目研究結果表明華根霉Rhizopuschinensis對BDMC的轉化以糖苷化反應為主，所獲得轉化產(chǎn)物BDMC-O-glucoside有更大的極性和水溶性，對腫瘤細胞的抑制作用較底物顯著提高，且轉化產(chǎn)率可達到63%(以峰面積計算)，提示BDMC-O-glucoside在功能性食品、醫(yī)藥領域有極大的應用前景。

活性天然產(chǎn)物作為預防和治療疾病的有效手段，近年來已經(jīng)成為醫(yī)藥和食品領域的研究熱點，然而中藥及普通植物中的天然活性成分含量往往偏低，如紫杉醇、人參皂苷等成分在植物中含量僅為萬分之幾或更低[13]，這一特性使得從中藥及普通植物提取物中獲得大量活性天然產(chǎn)物非常困難。此外，天然產(chǎn)物復雜的化學結構使其化學合成及結構修飾的反應難度大、反應過程復雜，成本較高，也不適用于天然產(chǎn)物的合成和結構改造。以微生物轉化技術為先導建立的植物生物轉化法，是利用植物組織或植物中的酶系進行的生物轉化，具有低成本、反應溫和、污染小等特點，并且有較高的選擇性，能夠完成化學合成反應難以完成的反應。生物轉化技術不僅能夠改變中藥的主要活性成分含量、活性物質(zhì)結構，還能夠?qū)τ卸局兴庍M行增效減毒，在天然藥物的創(chuàng)新研發(fā)領域有廣闊的應用空間[14-15]。目前，已經(jīng)對于黃酮類成分、蟾蜍甾烯類成分、萜類化合物及生物堿類成分都已進行了較為系統(tǒng)的生物轉化研究[16-17]。隨著技術的進步，生物轉化技術在食品工業(yè)領域的發(fā)展?jié)摿薮?。本文介紹的基于華根霉素對姜黃素類成分進行生物轉化獲得糖苷化產(chǎn)物的方法對活性天然產(chǎn)物的深入開發(fā)具有極強的指導意義。

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The preparation of bisdemethoxycurcumin-glucoside by microbial transformation method and its inhibitory effect to HepG2 Tumor cells

LI Rui1*, LIU Fan1, LI Yun-xiang1, JIA Kun1, ZHANG Xiu-mei1, XU Wei1,SU Guo-long1, HUANG Wei-wei1, LUO Jing-wen2

1(School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039,China)2(West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ABSTRACTBisdemethoxycurcumin is a nature-derived phenolic compound with potent anti-oxidant and anti-tumor activities. However, the application of bisdemethoxycurcumin in food and medicine industry was restricted by its poor solubility and stability. The introduction of glucoside bond by microbial transformation method to improve the water solubility through structural transformation is an effective way. In this paper, the transformation of bisdemethoxycurcumin by different microbial strains was studied. It was found that bisdemethoxycurcumin could be transformed to bisdemethoxycurcumin-glucoside by Rhizopus chinensis IFFI 3043, and the conversion rate was up to 63%. The chemical structure of bisdemethoxycurcumin-glucoside was confirmed by HPLC-MS and NMR methods. The analysis on dynamic curve of transformation was also completed. It was also discovered that the inhibitory effect of bisdemethoxycurcumin-glucoside on HepG2 tumor cells was stronger than that of bisdemethoxycurcumin by MTT method. The microbial transformation method established in this paper could have great potential in functional food and medicine industry.

Key wordsbisdemethoxycurcumin; Rhizopus chinensis; microbial transformation; glucoside; anti-tumor

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606004

基金項目：國家自然科學基金(81302742);教育部春暉計劃項目(13205638);四川省教育廳重點項目(11ZA005)

收稿日期：2016-01-04，改回日期：2016-02-25

第一作者：博士研究生，副教授(本文通訊作者,E-mail: lirui-elite@163.com)。