紫茉莉乙醇提取物對(duì)二斑葉螨生物酶活性的影響

趙赫南, 雷　廷, 李　冰, 曹永昶, 任　航, 韓俊艷

(沈陽(yáng)大學(xué) 城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng)　110044)

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紫茉莉乙醇提取物對(duì)二斑葉螨生物酶活性的影響

趙赫南, 雷廷, 李冰, 曹永昶, 任航, 韓俊艷

(沈陽(yáng)大學(xué) 城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng)110044)

摘要:為探討紫茉莉乙醇提取物殺二斑葉螨作用機(jī)制,研究了紫茉莉乙醇提取物(MEE)對(duì)幾種生物酶活性的影響.以MEE最大可耐受劑量1.2 mg/mL采用觸殺法處理雌成螨,分別在處理后4、8、12、16、20、24 h后測(cè)定酶活性變化.處理組螨的蛋白酶活性、酯酶活性及Na+, K+-ATP酶活性均呈持續(xù)下降狀態(tài),谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性呈先上升后下降狀態(tài),在24 h內(nèi)活性均高于對(duì)照組.試驗(yàn)結(jié)果表明,MEE對(duì)二斑葉螨的幾種酶活性產(chǎn)生影響,提示其殺螨作用機(jī)制與這些酶有關(guān).

關(guān)鍵詞:生物農(nóng)藥; 殺螨劑; 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶; Na+, K+-ATP酶; 蛋白酶

二斑葉螨(Tetranychus urticae)是一種危害嚴(yán)重的農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng),在我國(guó)各地均有存在.傳統(tǒng)上對(duì)二斑葉螨的控制依賴于化學(xué)農(nóng)藥,但二斑葉螨對(duì)化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性,這與其繁殖能力強(qiáng)、世代周期短有關(guān)[1].近年來(lái),植物殺螨劑的研究得到關(guān)注,一些植物含有黃酮類、生物堿類等次生代謝物質(zhì),這些次生代謝物質(zhì)可用來(lái)防御病蟲(chóng)害抑制種群增長(zhǎng),次生代謝物質(zhì)一般作用較為緩慢,害蟲(chóng)對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性,而且次生代謝物質(zhì)對(duì)環(huán)境污染往往較輕,因而開(kāi)發(fā)植物殺螨劑具有很好的前景[2].

紫茉莉(Mirabilis jalapaL.)又名胭脂花、粉子頭,是一種生態(tài)適應(yīng)廣、生長(zhǎng)速度快、繁殖力強(qiáng)的植物,在我國(guó)多地有栽培[3].筆者在前面的篩選研究中發(fā)現(xiàn)紫茉莉乙醇提取物(Mirabilis jalapaLethanolextracts,MEE)對(duì)二斑葉螨雌成螨具有殺螨活性[4].為探討殺螨作用機(jī)制,本文研究了MEE對(duì)二斑葉螨幾種生物酶活性的影響.

1材料與方法

1.1材料

MEE的制備.試驗(yàn)所用紫茉莉植物采于沈陽(yáng)大學(xué)及其周邊綠地,經(jīng)洗凈、陰干、粉碎、過(guò)80目篩,制成粉末.取粉末20g,按1∶10加入無(wú)水乙醇浸泡提取,每3d一次,共提取3次,合并浸提液,過(guò)濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取物,經(jīng)真空干燥,將提取物用乙醇配制成10mg/mL的供試藥液,備用.

二斑葉螨.來(lái)自沈陽(yáng)大學(xué)遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,在智能人工氣候箱中飼養(yǎng).飼養(yǎng)條件:光照為16h(L)∶8h(D),溫度為(25±1) ℃、相對(duì)濕度為60%～65%,.

1.2方法

(1) 雌成螨最大耐受量測(cè)定.將雙面膠帶粘貼于載玻片一端,用毛筆挑取雌成螨,將其背部粘在雙面膠帶上,每片粘雌成螨30只.將供試MEE用水分別稀釋成2.0、1.6、1.2、0.8mg/mL,分別相當(dāng)于50%、40%、30%與20%LD50劑量.將附有雌成螨的載玻片浸入待測(cè)藥液或空白對(duì)照溶液(體積分?jǐn)?shù)1%乙醇水溶液),5s后取出,用吸水紙條小心吸去多余藥液[1].24h后檢查結(jié)果,以最大不出現(xiàn)死亡質(zhì)量濃度為最大耐受劑量.

(2) 酶源制備.以成螨觸殺毒力測(cè)定得到最大耐受量(1.2mg/mL),采用觸殺法處理雌成螨,分別在處理后4、8、12、16、20、24h后取活螨150只,用水沖洗,經(jīng)濾紙吸干,轉(zhuǎn)移至組織勻漿器,加0.04mol/LpH值為7.0的磷酸緩沖液1.5mL,勻漿,勻漿液離心10min,取上清液,稀釋至1/20,即為工作酶液.采用Bradford法測(cè)定蛋白含量[1].

(3) 蛋白酶(proteinase)活性測(cè)定.取工作酶液0.05mL,37 ℃水浴3～5min,加1mL酪蛋白溶液,混勻,37 ℃水浴中15min,加體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸3mL,離心,取上清液1mL,加0.5mol/L碳酸鈉5mL,Follin-酚試劑1mL,顯色15min,于波長(zhǎng)680nm處測(cè)光密度值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酶活力[5].

(4) 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)活性測(cè)定.依據(jù)Clark等方法測(cè)定[6].

(5)Na+,K+-ATP酶活性測(cè)定.采用鉬藍(lán)測(cè)磷法測(cè)定[7].

(6) 酯酶(Esterase)活性測(cè)定.依據(jù)酯酶可催化α-醋酸萘酯水解成α-萘酚反應(yīng)原理測(cè)定[8].

(7) 數(shù)據(jù)處理.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SSPS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Tukeytest進(jìn)行組間比較.

2結(jié)果

2.1確定最大耐受量

為尋找二斑葉螨對(duì)MEE的最大耐受量,測(cè)定了不同劑量MEE對(duì)二斑葉螨的致死率,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,在劑量小于30%LD50,24h的觸殺率為0,30%LD50可以認(rèn)為是最大耐受劑量.本文在后面的酶學(xué)試驗(yàn)中,采用30%LD50劑量處理二斑葉螨,用于生物酶源制備.

表1　　　　不同劑量紫茉莉乙醇提取物

2.2MEE對(duì)蛋白酶活性的影響

蛋白酶是生物體內(nèi)的主要消化酶系,它的活性直接影響生物體對(duì)食物的吸收和利用.試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1,用MEE提取物處理二斑葉螨后,蛋白酶活性變化呈下降趨勢(shì),在處理12h后處理組與對(duì)照組有顯著差異.上述結(jié)果表明MEE影響到二斑葉螨的消化功能,可能導(dǎo)致二斑葉螨因消化不良而死亡.

圖1　　　　紫茉莉乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨

2.3MEE對(duì)GST活性的影響

GST廣泛存在于昆蟲(chóng)組織內(nèi),是催化毒物及其代謝物與還原型谷胱甘肽(GSH)軛合反應(yīng)的酶,GST活性變化往往表明蟲(chóng)體受到毒物的作用,因而GST常被用作組織損傷的敏感指標(biāo)[9].本研究中,MEE處理初期引起GST活性升高,到第12h達(dá)到最大值,表明螨的解毒能力加強(qiáng);隨著時(shí)間的延長(zhǎng),GST活性下降,這可能是由于毒性作用的累積,螨的解毒機(jī)能下降的結(jié)果(圖2).

圖2　　　　紫茉莉乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨

Na+,K+-ATP酶是一種離子泵,可以將細(xì)胞興奮后內(nèi)流的Na+排出,使膜電位恢復(fù)到靜息狀態(tài).抑制該酶活性,會(huì)使Na+外排受抑制,胞內(nèi)Na+含量升高,神經(jīng)細(xì)胞處于持續(xù)的興奮狀態(tài),最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡,Na+,K+-ATP酶是擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)位點(diǎn)之一[10].本研究中,MEE持續(xù)抑制了Na+,K+-ATP酶的活性,表明其對(duì)螨具有毒性作用(圖3).

圖3　　　　紫茉莉乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨Na+,

2.5MEE對(duì)酯酶活性的影響

害蟲(chóng)酯酶通過(guò)分解或與有毒物質(zhì)螯合,可使外源性毒物無(wú)法達(dá)到靶標(biāo)部位,從而對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生解毒作用或抗性,通過(guò)抑制酯酶的活性可以增加殺蟲(chóng)劑的毒力,胡椒基丁醚與磷酸三苯酯即通過(guò)雌機(jī)制發(fā)揮作用[11].本研究中,MEE導(dǎo)致酯酶活性下降,在8h以后與對(duì)照組比較具有顯著差別(p<0.05),提示抑制酯酶活性也參與了MEE的殺螨作用機(jī)制(圖4).

圖4　　　　紫茉莉乙醇提取物對(duì)二斑葉螨雌成螨

3討論

紫茉莉?yàn)閭鹘y(tǒng)中草藥,中醫(yī)認(rèn)為紫茉莉性寒、味甘,可用于赤白帶下、關(guān)節(jié)腫痛、癰瘡腫毒、熱淋、白濁、水腫等癥,根、葉、種子和花均可入藥;現(xiàn)代藥理研究證明紫茉莉有抗癌、抑菌、降血糖及利尿等作用[3].

近年來(lái),紫茉莉在植物保護(hù)方面的研究得到重視.彭躍峰等研究了紫茉莉莖提取物及其萃取物對(duì)菜粉蝶幼蟲(chóng)的生物活性,結(jié)果表明,紫茉莉莖氯仿提取物的毒殺與拒食效果最好.紫茉莉莖提取物對(duì)小菜蛾(Plutella xylostellaL.)、斜紋夜蛾(ProdenialituraFabr.)也有較好的抑制作用[12-13].紫茉莉提取物對(duì)一些害蟲(chóng)具有拒食作用,紫茉莉可驅(qū)避和麻醉蚊蟲(chóng),可制成蚊香[14].近年的研究也發(fā)現(xiàn)紫茉莉具有抗植物病害作用[15-16].

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紫茉莉的化學(xué)成分的研究報(bào)道較多. 早期研究認(rèn)為紫茉莉根含有甜菜素、氨基酸、有機(jī)酸、三萜、甾體、脂肪酸、葫蘆巴堿和半乳糖等.近年來(lái)很多活性成分被發(fā)現(xiàn), 鄺嘉樂(lè)從紫茉莉根中分離得到大黃酚、豆甾醇與兩種魚(yú)藤酮類化合物[17],Wang等也在紫茉莉中發(fā)現(xiàn)了類魚(yú)藤酮化合物[18]. 來(lái)國(guó)防等從黃花紫茉莉得到7個(gè)類魚(yú)藤酮化合物, 并發(fā)現(xiàn)了1個(gè)異喹啉生物堿[19]. 類魚(yú)藤酮化合物與其他生物堿類活性成分的發(fā)現(xiàn), 為紫茉莉的殺蟲(chóng)殺螨活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ).

蛋白酶、酯酶以及GST都是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的代謝解毒酶系[20-21],作為一個(gè)有機(jī)的整體,蟲(chóng)體在外源的有毒物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)時(shí),會(huì)調(diào)動(dòng)所有的資源進(jìn)行解毒,從而保護(hù)生命活動(dòng)的正常進(jìn)行,而一些藥物通過(guò)對(duì)解毒酶抑制發(fā)揮殺蟲(chóng)作用,本研究中一些酶活性的下降反映出紫茉莉乙醇提取物的毒性作用.由于蟲(chóng)體對(duì)外源性物質(zhì)的可能發(fā)生適應(yīng)性變化,有些酶活性可能會(huì)升高,本研究中GST酶活性的升高可能反映出蟲(chóng)體的適應(yīng)性變化.

4結(jié)論

本試驗(yàn)研究中,紫茉莉乙醇提取物處理的二斑葉螨蛋白酶、酯酶、GST及Na+,K+-ATP酶活性都發(fā)生了改變,反映出了藥物的毒性與蟲(chóng)體的適應(yīng)性變化,但這些酶活性的變化是藥物對(duì)酶的直接作用,還是由于蟲(chóng)體反應(yīng)而出現(xiàn)的間接作用,尚待進(jìn)一步研究.

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【責(zé)任編輯: 李艷】

EffectofMirabilis jalapaEthanolExtractsonEnzymesofTetranychus urticae

Zhao Henan, Lei Ting, Li Bing, Cao Yongchang, Ren Hang, Han Junyan

(LiaoningKeyLaboratoryofUrbanIntegratedPestManagementandEcologicalSecurity,ShenyangUniversity,Shenyang110044,China)

Abstract:For elucidating the mechanisms of Mirabilis jalapa ethanol extracts (MEE) killing Tetranychus urticae, effects of MEE on enzyme activities of Tetranychus urticae were determined. The maximum tolerable dose of 1.2 mg/mL MEE were used to treat female adult Tetranychus urticae, the enzyme activities were measured after 4, 8, 12, 16, 20 and 24 h, respectively. The enzyme activities of proteinase, Na+, K+-ATPase and esterase decreased in all the checkpoints, and glutathione S-transferase activity increased firstly and decreased latterly. The results demonstrated that MEE affected the enzyme activities of Tetranychus urticae, which may involve in the mechanisms of MEE killing Tetranychus urticae.

Key words:biological pesticide;acaricide; glutathione S-transferase; Na+, K+-ATPase; proteinase

文章編號(hào):2095-5456(2016)03-0198-05

收稿日期:2015-12-17

基金項(xiàng)目:遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014020100).

作者簡(jiǎn)介:趙赫南(1990-),男,遼寧沈陽(yáng)人,沈陽(yáng)大學(xué)碩士研究生; 韓俊艷(1968-),女(蒙古族),內(nèi)蒙古赤峰人,沈陽(yáng)大學(xué)副教授,博士.

中圖分類號(hào):S 482.39

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A