• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人FOXA1蛋白的原核表達(dá)、純化及蛋白互作分析*1

    2016-07-18 09:29:35譚擁軍陳竹林陳團(tuán)輝
    關(guān)鍵詞:原核表達(dá)

    譚擁軍,陳竹林,陳團(tuán)輝,向 勤

    (湖南大學(xué) 生物學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

    ?

    人FOXA1蛋白的原核表達(dá)、純化及蛋白互作分析*1

    譚擁軍?,陳竹林,陳團(tuán)輝,向勤

    (湖南大學(xué) 生物學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙410082)

    摘要:構(gòu)建FOXA1的原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)并純化后獲得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,為尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ).提取人乳腺癌細(xì)胞MCF7的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,設(shè)計(jì)引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此為模板擴(kuò)增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分別并克隆進(jìn)帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒.雙酶切及測(cè)序鑒定正確后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Rosetta DE3,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Glutathione Sepharose 4B親和純化,通過(guò)SDS-PAGE電泳及Western blot確定FOXA1蛋白的表達(dá).與MCF7細(xì)胞裂解液孵育,進(jìn)行GST-Pull down試驗(yàn),檢測(cè)純化蛋白與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功構(gòu)建pGEX-4T-1-FOXA1-C和 pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表達(dá)載體;在大腸桿菌中誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá);經(jīng)Glutathione Sepharose 4B純化后,獲得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C與N端蛋白片段GST-FOXA1-N;證實(shí)GST-FOXA1-C能與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.

    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子FOXA1;原核表達(dá);相互作用蛋白

    轉(zhuǎn)錄因子FOXA1屬于叉頭框(Forkhead Box, Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族的FOXA亞家族[1].FOX基因廣泛地分布于從酵母到人的各種真核生物中,構(gòu)成一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族.其中在哺乳動(dòng)物中就擁有40個(gè)以上成員,分別參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)[2]. FOXA1是該家族最早被克隆的成員[3].

    FOXA1蛋白介導(dǎo)許多蛋白的相互作用,調(diào)節(jié)發(fā)育、代謝和腫瘤的發(fā)生.FOXA1的功能區(qū)域由 DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)構(gòu)成.作為先鋒轉(zhuǎn)錄因子,F(xiàn)OXA1的羧基端能與核心組蛋白H3,H4相互作用[4]加強(qiáng)了FOXA1蛋白與核小體的結(jié)合能力.有研究表明轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可以招募TLE3/GRG3結(jié)合到染色質(zhì)上[5].而FOXA1 DNA結(jié)合區(qū)可以干擾轉(zhuǎn)錄因子NKX2.1與DNA的結(jié)合功能從而抑制NKX2.1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成,抑制腦肺和甲狀腺的發(fā)育[6].此外,F(xiàn)OXA1的DNA結(jié)合區(qū)還介導(dǎo)FOXA1與雄激素受體(AR)的相互作用[7],而在乳腺癌細(xì)胞株中,雌激素的應(yīng)答在一定程度上依賴于FOXA1的表達(dá)[8-9].

    為了進(jìn)一步研究FOXA1在細(xì)胞中扮演的角色,本研究通過(guò)基因工程技術(shù)體外構(gòu)建表達(dá)載體,誘導(dǎo)可溶性融合蛋白 GST-FOXA1-C和GST-FOXA1-N 的高效表達(dá)并親和純化.利用 GST-Pull down技術(shù),在乳腺癌細(xì)胞MCF7中證實(shí)GST-FOXA1-C可與已知的FOXA1結(jié)合蛋白TLE3發(fā)生相互作用,證明純化蛋白結(jié)構(gòu)正確且能與其互作蛋白發(fā)生互作,為進(jìn)一步尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ).

    1材料與方法

    1.1菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞系

    大腸桿菌DH5α感受(北京鼎國(guó)),大腸桿菌BL21 Rosetta(DE3)感受態(tài)(廣州百恩維),質(zhì)粒pGEX-4T-1由本實(shí)驗(yàn)室保存,乳腺癌細(xì)胞MCF7為本實(shí)驗(yàn)室凍存.

    1.2主要試劑

    限制性內(nèi)切酶BamHI,XhoI,T4 DNA連接酶均購(gòu)自Fermentas公司,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Promega公司,DNA高保真聚合酶購(gòu)于TOYOBO公司,PCR 引物由上海生工生物公司合成,Glutathione Sepharose 4B購(gòu)于GE,GST抗體購(gòu)于碧云天,V5抗體購(gòu)于Millpore公司.

    1.3重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-FOXA1-N,pGEX-4T-1-FOXA1-C的構(gòu)建及其鑒定

    根據(jù)NCBI檢索到的人源FOXA1的cDNA序列以及空載體PGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)確定FOXA1的上下游引物如表1所示.上游引物為CCC GGA TCC ATG TTA GGA ACT GTG AAG,下劃線為BamH I 酶切位點(diǎn),下游引物為CGC TCT AGA GGA AGT GTT TAG GAC GGG,下劃線為EcoR I 酶切位點(diǎn).以人的乳腺癌細(xì)胞MCF7提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為94 ℃ 2 min ;98 ℃ 10 s,68 ℃ 90 s,68 ℃ 10 min,32個(gè)循環(huán).將 PCR產(chǎn)物克隆入pGEX-4T-1質(zhì)粒中,雙酶切鑒定后送上海生工測(cè)序.以測(cè)序正確的pGEX-4T-1-FOXA1為模板,F(xiàn)OXA1-C上游引物GCG CGA ATT CAA CCA CCC GTT CTC CAT CAA,F(xiàn)OXA1-C下游引物GCG CCT CGA GTC ATT GGT AGT ACG CCG GCT CCA G;FOXA1-N上游引物GCG CGA ATT CAT GTC CTA GGC CAA CCC GG,F(xiàn)OXA1-N下游引物GCG CCT CGA GCT AGG CGT GCG GGT AGC TGC GC.分別克隆FOXA1的C端(第397到第461個(gè)氨基酸)、N端(第66到第218個(gè)氨基酸).

    表1 質(zhì)??寺∫?/p>

    1.4GST-FOXA1-C,GST-FOXA1-N融合蛋白的純化及其鑒定

    將測(cè)序正確的pGEX-4T-1-FOXA1-N,pGEX-4T-1-FOXA1-C轉(zhuǎn)化入BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性單克隆,加入含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃,培養(yǎng)至OD值在0.6~1.0之間,加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG,32 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌液,溶菌酶酶解30 min,超聲破碎,取上清加入GST-beads室溫孵育30 min后,加入Elution Buffer洗脫,收集洗脫后的蛋白,考染和免疫印跡鑒定.

    1.5GST pull down

    MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)至60%~90%時(shí),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染帶V5標(biāo)簽的TLE3真核表達(dá)質(zhì)粒,48 h后收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,加入500 μL IP裂解液冰上裂解1 h,13 000 r/min,4 ℃,離心15 min,收集上清,即為總的細(xì)胞裂解液.向收集的細(xì)胞裂解液中加入20 μL GST-beads,4 ℃,孵育2 h,離心收集上清,一分為二,分別加入20 μL GST-beads和純化后的GST-FOXA1-C,GST-FOXA1-N蛋白,4 ℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h,4 000 r/min離心收集珠子,用預(yù)冷的GST Lysis Buffer漂洗3次,加入Elution Buffer洗脫,收集洗脫后的蛋白,進(jìn)行考染和免疫印跡鑒定.

    2結(jié)論

    2.1人FOXA1基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增

    MCF7細(xì)胞 RNA的提取按照Total RNA KitI試劑盒(Omega,USA)進(jìn)行,運(yùn)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen,USA)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.通過(guò)NCBI查詢?nèi)薋OXA1的cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增人的FOXA1全長(zhǎng)(圖1)所示,通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)的FOXA1 cDNA大小為1 400 bp左右,與NCBI查詢的大小基本一致.

    M1:DNA Maker;M2:DNA Maker;

    2.2重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-FOXA1-N,pGEX-4T-1-FOXA1-C的構(gòu)建

    再以此為模板擴(kuò)增FOXA1-C/FOXA1-N,大小分別為196 kb,459 kb,與預(yù)期大小一致.將PCR克隆獲得的片段克隆至表達(dá)載體PGEX-4T-1,進(jìn)行雙酶切鑒定如圖2所示.我們已經(jīng)討論了FOXA1的結(jié)構(gòu)域蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮了重要作用,為了進(jìn)一步研究其在生物體內(nèi)的功能,所以克隆出人FOXA1的羧基端和氨基 端蛋白,為后續(xù)試驗(yàn)奠定材料基礎(chǔ).

    (a):M1:DNA Maker; M2:DNA Maker; 1:GST-FOXA1-C;2:GST-FOXA1-C單酶切;3:GST-FOXA1-C雙酶切.(b):M1:DNAMaker; M2:DNA Maker; 1:GST-FOXA1-N; 2:GST-FOXA1-N單酶切; 3:GST-FOXA1-N雙酶切

    圖2重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

    Fig.2Restriction enzyme digestion

    by PCR GST-FOXA1-C/GST-FOXA1-N

    2.3GST-FOXA-C及GST-FOXA1-N融合蛋白的表達(dá)及鑒定

    將pGEX-4T-1,pGEX-4T-1-FOXA1-N,pGEX-4T-1-FOXA1-C 3個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆大規(guī)模培養(yǎng),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,收集菌液,Western blot法檢測(cè)顯示,GST-FOXA-C及GST-FOXA1-N融合蛋白均能有效表達(dá)(圖3).

    1:Maker;2:GST蛋白; 3:GST-FOXA1-C誘導(dǎo)前;

    2.4GST-FOXA-C與GST-FOXA1-N融合蛋白的純化

    將pGEX-4T-1,pGEX-4T-1-FOXA1-N,pGEX-4T-1-FOXA1-C 3個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆大規(guī)模培養(yǎng),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,收集菌液,酶解,超聲破碎.上清用GST-Sepharose4B親和珠純化后,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示,雖出現(xiàn)不同程度的降解,但均能有效地獲得較高濃度的目的GST-FOXA-C及GST-FOXA1-N融合蛋白(圖4).

    圖4 GST-FOXA1-C和GST-FOXA1-N

    2.5GST-pull down結(jié)果分析

    將帶有GST-FOXA1-C與GST-FOXA1-N融合蛋白的珠子與過(guò)表達(dá)的V5-TLE3蛋白的MCF7細(xì)胞裂解液孵育后,用V5抗體進(jìn)行Western blot 法檢測(cè)(圖5)結(jié)果顯示,GST-FOXA1-C融合蛋白可以與TLE3 蛋白發(fā)生結(jié)合,而GST蛋白和GST-FOXA1-N融合蛋白在同一位置無(wú)此條帶,說(shuō)明FOXA1-C端蛋白結(jié)構(gòu)域能夠有效的與TLE3 蛋白特異地相互作用,具有與FOXA1全長(zhǎng)蛋白部分相似的生物學(xué)功能.

    1:過(guò)表達(dá)V5-TLE3蛋白的MCF7細(xì)胞裂解物(Input);2:GST蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物;3:GST-FOXA1-N融合蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物;4:GST-FOXA1-C融合蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物

    圖5Pull down產(chǎn)物Western blot分析

    Fig.5Pull down analysis of SDS-PAGE

    and Western blot analysis of the product

    2.6Pull down結(jié)果的考馬斯亮藍(lán)分析

    將帶有GST-FOXA1-C融合蛋白的珠子與MCF7細(xì)胞裂解液孵育后,同時(shí)用GST蛋白與MCF7細(xì)胞裂解液孵育的結(jié)果作為對(duì)照,再用洗脫液將Pull down產(chǎn)物洗脫下來(lái),經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn),GST-FOXA1-C融合蛋白能夠拖下許多與FOXA1-C端相結(jié)合的互作蛋白,從而為后面的實(shí)驗(yàn)奠定材料基礎(chǔ)(圖6).

    1:Protein Maker;2:Input:MCF7 cell lysis;3:對(duì)照組GST Pull down 洗脫產(chǎn)物;4:對(duì)照組 GST Pull down 上清;5:實(shí)驗(yàn)組GST-FOXA1-C Pull down洗脫產(chǎn)物;6:實(shí)驗(yàn)組GST-FOXA1-C洗脫上清;7:GST-FOXA1-C蛋白;8:GST蛋白

    圖6GST-FOXA1-C融合蛋白

    Pull down結(jié)果的考馬斯亮藍(lán)分析

    Fig.6GST-FOXA1-C fusion protein Pull down

    analysis of SDS-PAGE of the product

    3討論

    GST Pull down技術(shù)是體外確定兩個(gè)已知蛋白是否相互作用以及篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白的有效方法. 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建GST-FOXA1結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)載體,這種構(gòu)建基因的某一段的結(jié)構(gòu)域蛋白研究其生物功能并不少見(jiàn),有文章報(bào)道過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子FOXO基因的結(jié)構(gòu)域蛋白研究它與目的蛋白的甲基化作用[10].再摸索誘導(dǎo)條件后以比較優(yōu)化的條件誘導(dǎo)出GST-FOXA1-C和GST-FOXA1-N融合蛋白,作為后續(xù)試驗(yàn)的誘餌蛋白.將高表達(dá)V5-TLE3的MCF7細(xì)胞裂解液中與GST-FOXA1-C誘餌蛋白以最佳時(shí)間孵育后,成功捕捉與其已知的結(jié)合蛋白TLE3,證實(shí)實(shí)驗(yàn)制備的融合蛋白具有生物活性.隨后再次在MCF7裂解中以GST-FOXA1-C為誘餌蛋白進(jìn)行GST Pull down,將產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)成功捕捉到相互作用的蛋白.

    FoxA1是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,該轉(zhuǎn)錄因子屬于“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”類蛋白的一個(gè)亞群.Fox家族蛋白功能涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、生物老化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程, 其突變和表達(dá)異常與發(fā)育畸形、代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)[11-12].已有文章得出結(jié)論FOXA1與TLE3在乳腺癌中相互作用,本文通過(guò)進(jìn)行GST Pull down成功驗(yàn)證這一結(jié)論并證實(shí)制備的蛋白具有生物活性.

    TLE基因最早在1968年被發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已知的家族成員共有19個(gè)[13],是典型的轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子家族蛋白.在哺乳動(dòng)物中,它包括TLE(transducin-like enhancer of split)1~4(人類).Gro / TLE蛋白家族不能直接與DNA結(jié)合,而是被各種不同類型的轉(zhuǎn)錄因子所招募[14].有研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可以招TLE3/GRG3結(jié)合到染色質(zhì)上.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用GST-FOXA1-C與TLE3的體外相互作用驗(yàn)證兩者相互作用.

    乳腺癌現(xiàn)已成為人類的一大殺手,越來(lái)越多的研究證明FOXA1在乳腺癌中發(fā)揮了重要的作用,使其有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[15-16].本文成功克隆了人的FOXA1,FOXA1-C,FOXA1-N基因并獲得有活性的人FOXA1-C和FOXA1-N蛋白,為后續(xù)進(jìn)一步尋找FOXA1的互作蛋白和制備抗體奠定了良好的基礎(chǔ).

    參考文獻(xiàn)

    [1]KAESTNER K H, KNOCHEL W,MARTINEZ D E. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors[J]. Genes Dev, 2000,14(2): 142-146.

    [2]HANNENHALLI S, KAESTNER K H. The evolution of fox genes and their role in development and disease[J]. Nat Rev Genet, 2009,10(4): 233-240.

    [3]LAI E.HNF-3A, a hepatocyte-enriched transcription factor of novel structure is regulated transcriptionally[J]. Genes Dev, 1990,4(8):1427-1436.

    [4]CIRILLO L A.Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4[J]. Mol Cell, 2002,9(2): 279-289.

    [5]SEKIYA T,ZARET K S.Repression by Groucho/TLE/Grg proteins: genomic site recruitment generates compacted chromatin in vitro and impairs activator binding in vivo[J]. Mol Cell, 2007,28(2): 291-303.

    [6]MINOO P.Physical and functional interactions between homeodomain NKX2.1 and winged helix/forkhead FOXA1 in lung epithelial cells[J]. Mol Cell Biol, 2007,27(6): 2155-2165.

    [7]GAO N.The role of hepatocyte nuclear factor-3 alpha (Forkhead Box A1) and androgen receptor in transcriptional regulation of prostatic genes[J].Mol Endocrinol,2003,17(8):1484-1507.

    [8]CARROLL J S.Chromosome-wide mapping of estrogen receptor binding reveals long-range regulation requiring the forkhead protein FOXA1[J]. Cell, 2005:122(1): 33-43.

    [9]LUPIEN M.FOXA1 translates epigenetic signatures into enhancer-driven lineage-specific transcription[J].Cell,2008,132(6):958-70.

    [10]YAMAGATA K.Arginine methylation of FOXO transcription factors inhibits their phosphorylation by Akt[J].Mol Cell, 2008,32(2): 221-231.

    [11]TAN Y,RAYCHAUDHURI P,COSTA R H.Chk2 mediates stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of DNA repair genes[J]. Mol Cell Biol, 2007,27(3):1007-1016.

    [12]LEHMANN O J.Fox's in development and disease[J]. Trends Genet,2003,19(6):339-344.

    [13]CHEN G,COUREY A J.Groucho/TLE family proteins and transcriptional repression[J]. Gene, 2000,249(1/2): 1-16.

    [14]FISHER A L,CAUDY M.Groucho proteins: transcriptional corepressors for specific subsets of DNA-binding transcription factors in vertebrates and invertebrates[J]. Genes Dev,1998,12(13):1931-1940.

    [15]CANCER Genome Atlas N. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours[J]. Nature,2012,490(7418): 61-70.

    [16]LEHMANN B D.Identification of human triple-negative breast cancer subtypes and preclinical models for selection of targeted therapies[J]. J Clin Invest,2011,121(7): 2750-2767.

    Prokaryotic Expression, Purification, and Protein-interaction Analysis of Human FOXA1 Protein

    TAN Yong-jun?,CHEN Zhu-lin,CHEN Tuan-hui,XIANG Qin

    (College of Biology,Hunan Univ,Changsha,Hunan410082,China)

    Abstract:To identify proteins interacting with transcription factor FOXA1,different prokaryotic expression vectors for human FOXA1 protein were constructed and the proteins of FOXA1 C-terminus and FOXA1 N-terminus were purified. They provided a material foundation for future studies of FOXA1-interacted proteins. Total RNAs were extracted from human breast cancer MCF7 cells and reverse transcribed into cDNAs. The full length cDNA of FOXA1 was amplified by PCR, and the C-terminal and N terminal segments were also amplified respectively. The different FOXA1 cDNA fragments were cloned into a prokaryotic expression vector pGEX-4T-1. The correct vectors were confirmed by double restriction enzyme digestion and DNA sequencing and transformed into E. coli BL21 Rosetta DE3. The FOXA1 proteins were purified with Glutathione Sepharose 4B and analyzed through SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. GST Pull-down experiments were performed with lysates of MCF7 cells and FOXA1 proteins to test the interaction between FOXA1 and a known FOXA1-interacted protein TLE3.Prokaryotic expression vectors of pGEX-4T-1-FOXA1-C and pGEX-4T-1-FOXA1-N were constructed successfully. The proteins of FOXA1 C-terminus (GST-FOXA1-C) and FOXA1 N-terminus (GST-FOXA1-N) were purified by Glutathione Sepharose 4B. It was confirmed that the purified GST-FOXA1-C was able to interact with the known FOXA1-interacted protein TLE3 in the Pull-down experiment.

    Key words:transcrition factor FOXA1; prokaryotic expression; interaction protein

    文章編號(hào):1674-2974(2016)06-0104-05

    收稿日期:2015-08-16

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472718),National Natural Science Foundation of China(81472718)

    作者簡(jiǎn)介:譚擁軍(1967-),男,湖南長(zhǎng)沙人,湖南大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師 ?通訊聯(lián)系人,E-mail:yjtan@hnu.edu.cn

    中圖分類號(hào):Q786

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    猜你喜歡
    原核表達(dá)
    丹參蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表達(dá)分析
    H7亞型禽流感病毒HA基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性分析
    結(jié)核分枝桿菌Erp蛋白PGLTS的4基序突變體的構(gòu)建
    棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表達(dá)及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
    人FOXA1蛋白的原核表達(dá)、純化及蛋白互作分析
    柑橘CitSERK—LIKE基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
    信號(hào)分子與葉銹菌誘導(dǎo)下小麥病程相關(guān)蛋白1基因的表達(dá)分析
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達(dá)
    ShSAP1的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
    水稻抗白葉枯病基因xa5的原核表達(dá)及蛋白純化
    一区二区三区四区激情视频 | 久久草成人影院| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本与韩国留学比较| 亚洲性久久影院| 亚洲成人久久爱视频| 丝袜美腿在线中文| 热99在线观看视频| 欧美三级亚洲精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 老司机午夜福利在线观看视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 97超视频在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久亚洲国产成人精品v| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| av天堂在线播放| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 香蕉av资源在线| 国产老妇女一区| 看黄色毛片网站| 能在线免费观看的黄片| 国产高清有码在线观看视频| 99久久精品热视频| 亚洲av中文av极速乱| 日本熟妇午夜| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产69精品久久久久777片| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品无大码| 黄色配什么色好看| 亚洲成av人片在线播放无| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产黄色视频一区二区在线观看 | av在线老鸭窝| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 免费搜索国产男女视频| 国产精品三级大全| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 最好的美女福利视频网| 免费av不卡在线播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲av成人av| 久久人人精品亚洲av| 12—13女人毛片做爰片一| 日本黄色视频三级网站网址| 赤兔流量卡办理| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产午夜精品论理片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 俄罗斯特黄特色一大片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品一及| 国产高清激情床上av| 亚洲美女黄片视频| 午夜福利高清视频| 中文字幕av成人在线电影| 一区二区三区高清视频在线| 一级黄色大片毛片| 日本熟妇午夜| a级一级毛片免费在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产成人a区在线观看| 国产69精品久久久久777片| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲av免费高清在线观看| 日本一二三区视频观看| 午夜精品在线福利| 国产亚洲精品久久久com| 一本久久中文字幕| av卡一久久| 一本久久中文字幕| 男人的好看免费观看在线视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 我要搜黄色片| 国产精品精品国产色婷婷| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久久久黄片| 男人舔奶头视频| 伦理电影大哥的女人| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 免费看av在线观看网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 久久99热这里只有精品18| 人人妻人人澡欧美一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 最好的美女福利视频网| 搡老岳熟女国产| 久久国产乱子免费精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久久九九精品二区国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久人人爽人人片av| 国内精品宾馆在线| 乱系列少妇在线播放| 1024手机看黄色片| 精品一区二区三区视频在线| 成人性生交大片免费视频hd| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品久久视频播放| 中国美女看黄片| 99riav亚洲国产免费| 午夜老司机福利剧场| 简卡轻食公司| 久久精品国产亚洲网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 性欧美人与动物交配| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品456在线播放app| 国产视频内射| 国产单亲对白刺激| 精品国内亚洲2022精品成人| 一个人看视频在线观看www免费| 国产黄片美女视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品色激情综合| www.色视频.com| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲内射少妇av| 一进一出好大好爽视频| 亚洲精品色激情综合| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 一个人免费在线观看电影| 亚洲最大成人av| 色播亚洲综合网| 六月丁香七月| 国产精华一区二区三区| 禁无遮挡网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲美女视频黄频| 亚洲18禁久久av| 99九九线精品视频在线观看视频| 91久久精品国产一区二区成人| 观看美女的网站| 乱人视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成年女人看的毛片在线观看| av.在线天堂| 两个人的视频大全免费| 两个人的视频大全免费| 久久国产乱子免费精品| 有码 亚洲区| 我要看日韩黄色一级片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩精品青青久久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲精品色激情综合| 成年女人永久免费观看视频| 精品久久国产蜜桃| 最近中文字幕高清免费大全6| 插阴视频在线观看视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品一区www在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 一级av片app| 久久久久久久久久久丰满| 国产综合懂色| 国产成人一区二区在线| 99视频精品全部免费 在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品国产三级普通话版| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品三级大全| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美高清性xxxxhd video| 成人美女网站在线观看视频| 午夜视频国产福利| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av中文av极速乱| avwww免费| 久久久久久伊人网av| 淫秽高清视频在线观看| 六月丁香七月| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 99久久精品热视频| 一级毛片久久久久久久久女| 夜夜爽天天搞| 国产真实乱freesex| 高清毛片免费看| 日韩成人伦理影院| 国产精品亚洲一级av第二区| 日日啪夜夜撸| 成人国产麻豆网| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av卡一久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产在线男女| 99久久九九国产精品国产免费| 国产爱豆传媒在线观看| 午夜影院日韩av| www.色视频.com| 亚洲av第一区精品v没综合| 简卡轻食公司| 成人亚洲精品av一区二区| 观看免费一级毛片| 成人综合一区亚洲| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久人人精品亚洲av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久国产成人免费| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产一区二区在线av高清观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美丝袜亚洲另类| 看黄色毛片网站| 九九在线视频观看精品| 亚洲精品在线观看二区| 国产成年人精品一区二区| 日本免费a在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 91在线观看av| 亚洲中文字幕日韩| 国产高清激情床上av| 国产精品精品国产色婷婷| 毛片女人毛片| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品人妻久久久久久| 全区人妻精品视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本黄大片高清| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av.av天堂| av卡一久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产在线男女| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久亚洲精品不卡| 国产黄色小视频在线观看| 简卡轻食公司| 亚洲天堂国产精品一区在线| 小说图片视频综合网站| av国产免费在线观看| 久久6这里有精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品野战在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲av成人av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲成人av在线免费| 成人三级黄色视频| 97在线视频观看| 天天躁日日操中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播| 日本熟妇午夜| 日韩人妻高清精品专区| 日日撸夜夜添| 日韩欧美免费精品| 韩国av在线不卡| 男女那种视频在线观看| 欧美区成人在线视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 舔av片在线| 午夜爱爱视频在线播放| 中文字幕久久专区| 全区人妻精品视频| 五月玫瑰六月丁香| 色播亚洲综合网| 干丝袜人妻中文字幕| 赤兔流量卡办理| 免费在线观看影片大全网站| 婷婷色综合大香蕉| 两个人视频免费观看高清| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 身体一侧抽搐| 一进一出好大好爽视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成年av动漫网址| 国产毛片a区久久久久| 日韩欧美精品v在线| 国产精品女同一区二区软件| aaaaa片日本免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 全区人妻精品视频| 香蕉av资源在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色av中文字幕| 精品福利观看| 高清日韩中文字幕在线| 最后的刺客免费高清国语| 精品久久久久久久久久久久久| 不卡一级毛片| 色吧在线观看| 性色avwww在线观看| 免费看日本二区| 亚洲欧美日韩东京热| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 偷拍熟女少妇极品色| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国内精品久久久久精免费| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 黑人高潮一二区| 免费观看的影片在线观看| 日韩欧美国产在线观看| .国产精品久久| 亚洲18禁久久av| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 色吧在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 熟女电影av网| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 黄色欧美视频在线观看| 身体一侧抽搐| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久精品国产国产毛片| 成年av动漫网址| 伦理电影大哥的女人| 99久久精品热视频| 免费大片18禁| 国产精品一区www在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 我的老师免费观看完整版| 久久久精品94久久精品| 久久九九热精品免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av二区三区四区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲va在线va天堂va国产| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 婷婷精品国产亚洲av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久午夜福利片| 丝袜喷水一区| 国产极品精品免费视频能看的| 99热只有精品国产| 老司机影院成人| 亚洲成av人片在线播放无| 一区福利在线观看| 亚洲五月天丁香| 国产精品永久免费网站| 九九在线视频观看精品| 亚洲av美国av| 看十八女毛片水多多多| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美zozozo另类| 亚洲国产精品国产精品| 国产老妇女一区| 日韩三级伦理在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 淫妇啪啪啪对白视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美日韩乱码在线| 成年av动漫网址| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲av免费在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美日韩精品成人综合77777| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品一区二区免费欧美| 一区二区三区高清视频在线| 成人漫画全彩无遮挡| 一级av片app| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 高清午夜精品一区二区三区 | 国产黄a三级三级三级人| 久久99热6这里只有精品| 国产高清不卡午夜福利| 天堂动漫精品| 久久久国产成人精品二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 全区人妻精品视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日本黄色片子视频| 黄色日韩在线| 九色成人免费人妻av| 久久精品夜色国产| 尾随美女入室| 久久久久久伊人网av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| a级一级毛片免费在线观看| 日韩欧美精品v在线| 成人午夜高清在线视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产乱人视频| 日韩av在线大香蕉| 国产高清三级在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲七黄色美女视频| 久久久精品大字幕| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美国产日韩亚洲一区| 国内精品美女久久久久久| a级毛片a级免费在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 我的老师免费观看完整版| 日本免费a在线| 99热精品在线国产| 神马国产精品三级电影在线观看| av在线播放精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 香蕉av资源在线| 韩国av在线不卡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久热精品热| 美女内射精品一级片tv| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品无大码| 亚洲精品国产av成人精品 | 精品久久国产蜜桃| 国产精品永久免费网站| 欧美高清性xxxxhd video| 全区人妻精品视频| 国产精品精品国产色婷婷| 观看免费一级毛片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美日本视频| 99热只有精品国产| 夜夜夜夜夜久久久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品粉嫩美女一区| 在现免费观看毛片| 黄色一级大片看看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久午夜福利片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 免费在线观看成人毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中国国产av一级| 亚洲在线自拍视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日本视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 久久韩国三级中文字幕| 国产亚洲精品av在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 美女大奶头视频| 1024手机看黄色片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 成年女人永久免费观看视频| 在线播放国产精品三级| 久久人人精品亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 黄色日韩在线| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲人成网站高清观看| 欧美bdsm另类| 美女高潮的动态| 91久久精品电影网| 久久韩国三级中文字幕| 中文资源天堂在线| 国产一区二区在线av高清观看| 久久人妻av系列| 亚洲国产精品sss在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 丰满乱子伦码专区| 欧美一级a爱片免费观看看| 男女下面进入的视频免费午夜| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 我的老师免费观看完整版| 免费人成视频x8x8入口观看| 色5月婷婷丁香| a级毛片a级免费在线| 国产在线男女| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人a区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 国产v大片淫在线免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费在线观看成人毛片| 中文字幕av成人在线电影| 成人av在线播放网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 男人的好看免费观看在线视频| 免费无遮挡裸体视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 可以在线观看毛片的网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 91久久精品电影网| 午夜亚洲福利在线播放| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品一区av在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费人成在线观看视频色| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲国产精品成人综合色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 成人三级黄色视频| 国内精品宾馆在线| 久久久久国产网址| 99在线人妻在线中文字幕| 男人狂女人下面高潮的视频| 插逼视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲五月天丁香| 在线国产一区二区在线| 国产精品久久久久久精品电影| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99久久九九国产精品国产免费| 波多野结衣高清作品| 国产视频内射| 熟女电影av网| 超碰av人人做人人爽久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品人妻视频免费看| 毛片女人毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品人妻久久久影院| 极品教师在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 性欧美人与动物交配| 亚洲自拍偷在线| 免费看日本二区| 精品久久久久久久久亚洲| 精品日产1卡2卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 中文字幕免费在线视频6| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日本三级黄在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲人成网站在线播| 日日撸夜夜添| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品午夜福利在线看| 99热这里只有是精品50| 五月玫瑰六月丁香| 联通29元200g的流量卡| 亚洲无线在线观看| 中文资源天堂在线| 免费观看人在逋| 黄色配什么色好看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 在线观看66精品国产| 亚洲精品国产av成人精品 | 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 亚洲五月天丁香| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99久久精品国产国产毛片| 1000部很黄的大片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| av天堂在线播放| 久久草成人影院| 久久这里只有精品中国| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美精品国产亚洲| 99精品在免费线老司机午夜| 综合色av麻豆| 亚洲最大成人中文| 一级毛片我不卡| 成人毛片a级毛片在线播放|