頂孢霉孢子懸浮液對小麥和黃瓜種子萌發(fā)及六種作物幼苗生長的影響

郝雨,楊順義,張新虎,沈慧敏,岳秀利,羅玲艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心,甘肅 蘭州　730070)

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頂孢霉孢子懸浮液對小麥和黃瓜種子萌發(fā)及六種作物幼苗生長的影響

郝雨,楊順義,張新虎,沈慧敏,岳秀利,羅玲艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心,甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 研究頂孢霉Ahy1對作物的安全性及生理指標(biāo)的影響.【方法】 采用室內(nèi)生測和生理生化分析法，測定了頂孢霉(Ahy1)孢子懸浮液對小麥和黃瓜種子萌發(fā)、體內(nèi)酶活性以及對6種作物幼苗生長的影響.【結(jié)果】 在25 ℃，相對濕度75%條件下，不同濃度的懸浮液對小麥和黃瓜種子萌發(fā)及根長生長表現(xiàn)出高抑和低促作用；對小麥種子中4種酶的活性均有不同程度的促進作用；對黃瓜種子中SOD、POD表現(xiàn)為促進作用，相對抑制率分別為-82.51%和-35.96%，對CAT有明顯的抑制作用，對Pro含量影響不明顯.對菜豆、小麥、玉米、辣椒、茄子、黃瓜6種供試作物株高平均抑制率分別為-18.62%、-8.12%、-11.11%、-8.56%、-6.61%和-1.71%；對菜豆、小麥幼苗鮮質(zhì)量的相對抑制率分別為-21.10%、-14.29%，對辣椒、菜豆、茄子和小麥干質(zhì)量抑制率分別為-16.41%、-15.59%、-15.10%和-9.50%，表現(xiàn)促生作用，但對黃瓜和玉米的干質(zhì)量表現(xiàn)抑制作用.【結(jié)論】 Ahy1菌株不同濃度孢子懸浮液處理供試作物21 d后，均未見任何發(fā)病癥狀，植株生長正常，對供試作物生長沒有明顯可見影響.

關(guān)鍵詞：頂孢霉孢子懸浮液；幼苗株高；鮮質(zhì)量；干質(zhì)量；種子萌發(fā)率；根長生長；生理指標(biāo)

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中濫施化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境與食品安全問題的日趨勢嚴重，非化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害的研究開始得到人們的重視.微生物殺蟲劑具有易被降解，對人畜和益蟲無害，昆蟲對其不易產(chǎn)生抗性，且具有高特異性等優(yōu)點[1]，如蟲生真菌制劑，已有試驗測試了某些蟲生真菌對脊椎動物的影響，只發(fā)現(xiàn)了較小的過敏反應(yīng)[2-3].真菌殺蟲劑具有對環(huán)境友好、殺蟲方式獨特、害蟲不易產(chǎn)生抗性、使用范圍廣、容易大量生產(chǎn)等特點，是最安全、效果最佳的生物農(nóng)藥[4-6].研究我國豐富的殺蟲真菌微生物資源，開發(fā)適宜于甘肅省干旱條件下生產(chǎn)和應(yīng)用的真菌微生物殺蟲劑，對保護生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義.

頂孢霉(A.hansfordii)是一種蟲生真菌[7-8]，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥系從蚜蟲上分離獲得一株頂孢霉菌株Ahy1，并對獲得的Ahy1菌株在生防素毒力、組織病理學(xué)培養(yǎng)和加工工藝方面做了一些研究[9-10]，如：宋麗雯[9]研究證實頂孢霉菌株Ahy1對桃蚜、苜蓿斑蚜、豆無網(wǎng)長管蚜、粘蟲和菜青蟲均有較強的侵染力，尤其對桃蚜的毒力最強，最終累計死亡率為84.07%.其胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的分泌規(guī)律及活力與毒力之間存在顯著的相關(guān)性；李莉等[10]初步研究了營養(yǎng)物質(zhì)、碳氮比、不同培養(yǎng)時間與Ahy1生長發(fā)育的關(guān)系；張莉等[11]研究了Ahy1菌株的加工工藝，為該菌的工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；王琰等[12]研究了Ahy1對小菜蛾的毒力及體內(nèi)保護酶活力的影響.

目前，有關(guān)該菌株是否會侵染農(nóng)作物，對作物的安全性及生理指標(biāo)的影響未見有報道.本研究通過測定頂孢霉菌株Ahy1對幾種作物的致病性及生理指標(biāo)的影響，明確該菌株對黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子及辣椒等農(nóng)作物的安全性，以期為開發(fā)對害蟲侵染力高、對作物安全的頂孢霉Ahy1菌株微生物殺蟲劑奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試作物黃瓜(‘綠寶’)、玉米(‘鄭單958’)、菜豆(‘無筋架豆王’)、小麥(‘中植3號’)、茄子(‘蘭雜2號’)、辣椒(‘九寸紅’)，上述作物種子均由甘肅省綠星種子公司提供.

1.1.2供試菌株頂孢霉(A.hansfordii)菌株Ahy1由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院農(nóng)藥實驗室提供，經(jīng)純化保存于4 ℃冰箱中，每2月轉(zhuǎn)接1次.

1.2試驗方法

1.2.1頂孢霉菌株孢子懸浮液的制備用PDA平板培養(yǎng)頂孢霉菌株，挑取適量菌落放入SDAY培養(yǎng)液[11]，置于恒溫振蕩儀中，轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度25 ℃振蕩培養(yǎng)72 h[13].然后，用紗布過濾制孢子懸浮液，并用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×107個孢子/mL.

1.2.2頂孢霉菌株對黃瓜和小麥種子萌發(fā)、根長及生化指標(biāo)的影響采用濾紙萌發(fā)法培養(yǎng)[14-15].黃瓜和小麥種子用75%的酒精消毒5 min，經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，50 ℃溫水浸泡48 h，然后用濾紙吸干，挑選健康而飽滿的種子置于鋪有2層定性濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，將頂孢霉孢子懸浮液稀釋為5×106、1×106、5×105、2×105、1×105、2×104、1×104個孢子/mL 6個濃度，每個處理分別取10 mL加入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，然后分別放入10粒黃瓜和小麥種子，以蒸餾水為對照，重復(fù)3次.將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ℃，濕度60%～70%.待對照種子全部萌發(fā)時，分別檢查各處理種子萌發(fā)數(shù)和種子根長，分別計算種子萌發(fā)率，測量根長度.

待對照組黃瓜和小麥種子全部萌發(fā)時，收集上述經(jīng)檢查過的萌發(fā)種子(包括其芽和根)，用蒸餾水沖洗兩次，測定生化指標(biāo).可溶性蛋白(Pro)含量測定采用考馬斯亮藍法[16]；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]；過氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[16]；過氧化氫酶(CAT)活性測定采用分光光度法[16].

1.2.3頂孢霉菌株對供試作物幼苗生長的影響選取健康、籽粒飽滿的黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子、辣椒種子，溫湯浸種催芽后，播種于塑料花盆(直徑14 cm,高度11 cm)內(nèi)，小麥每盆播種20粒種子，其他5種作物每盆播種10粒種子；待苗高10 cm后，剔除長勢較弱的幼苗，小麥每盆留10株，其他5種作物每盆留5株.采用噴霧法[17]，將孢子濃度為1×107個/mL的頂孢霉懸浮液稀釋為5×106、1×106、5×105、2×105、1×105個孢子/mL后分別噴施黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子和辣椒幼苗，以清水為對照，重復(fù)3次.噴施后將花盆置于光照培養(yǎng)箱中25 ℃、相對濕度75%，光照/黑暗(L/D)處理12 h/12 h.分別在處理7、14、21 d時，每個處理分別選取5株幼苗測株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，計算相對抑制率(%)，并觀察植物的發(fā)病情況(是否有病斑、病斑大小、病斑顏色)及植物葉片生長情況.

1.2.4數(shù)據(jù)分析所有試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS(7.05)軟件，Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗.

2結(jié)果與分析

2.1頂孢霉菌株對黃瓜和小麥種子各生理、生化指標(biāo)的影響

2.1.1頂孢霉菌株對黃瓜和小麥種子萌發(fā)及根生長的影響由表1可知，Ahy1孢子懸浮液在高濃度下對黃瓜種子萌發(fā)和根長生長有輕微的抑制作用，隨濃度降低抑制作用減弱.Ahy1孢子懸浮液在5×106、1×106、2×105個孢子/mL濃度下，對黃瓜種子萌發(fā)相對抑制率分別為25.56%、11.11%、7.41%，對黃瓜根長的相對抑制率分別為32.29%、20.18%和18.39%.Ahy1孢子懸浮液在2×104、1×104個孢子/mL濃度下，對黃瓜種子萌發(fā)相對抑制率分別為-8.64%、-11.11%，對黃瓜根長的相對抑制率分別為-0.90%、-8.07%，表現(xiàn)為促生作用.

Ahy1孢子懸浮液6個濃度下對小麥種子萌發(fā)的影響不明顯，在5×106、1×105個孢子/mL濃度下相對萌發(fā)抑制率為7.00%和6.00%，其他4個濃度與對照差異不顯著.對小麥根長生長表現(xiàn)出高濃度的抑制作用和低濃度的促生作用，在5×106、1×106、2×105個孢子/mL濃度下，對根長的相對抑制率分別為38.30%、31.92%和6.74%，表現(xiàn)抑制作用；在2×104、1×104個孢子/mL濃度下，小麥根長的相對抑制率分別為-2.48%和-8.87%，表現(xiàn)為促生作用.

表1　Ahy1孢子懸浮液對黃瓜和小麥萌發(fā)及根長的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著.

2.1.2頂孢霉菌株對黃瓜和小麥種子各生化指標(biāo)的影響由表2可知，Ahy1孢子懸浮液6個濃度對黃瓜種子中Pro含量影響不明顯(平均相對抑制率為3.14%)，但對SOD、POD影響顯著，其平均相對抑制率分別為-82.51%和-35.96%，表現(xiàn)為促進作用，對CAT有明顯的抑制作用，平均相對抑制率為20.51%；對小麥種子中可溶性蛋白(Pro)、過氧化物酶(POD)、過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)含量有顯著的影響，其平均相對抑制率分別為-2.05%、-18.07%、-23.31%和-34.33%，表現(xiàn)為明顯的促進作用.

表2　Ahy1孢子懸浮液對黃瓜和小麥種子生化指標(biāo)的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著.

2.2頂孢霉菌株對供試作物生長的影響

由圖1可看出，Ahy1菌株不同濃度孢子懸浮液處理黃瓜、玉米、菜豆、小麥、茄子及辣椒的幼苗21 d后，均未見任何發(fā)病癥狀，植株生長正常，與對照無顯著差異.頂孢霉菌株未侵染供試作物，對供試作物生長沒有明顯可見影響.

2.2.1頂孢霉菌株對供試作物株高的影響由表3可知，頂孢霉5×106、1×106、5×105、2×105、1×105個孢子/mL 5個濃度處理6種供試作物7 d后，對株高均有不同程度的促進作用，菜豆、玉米促進作用最明顯，其平均抑制率分別為-18.62%、-11.11%，與對照差異顯著；其次是辣椒、茄子和黃瓜，平均抑制率分別為-8.56%、-6.61%和-1.71%.頂孢霉菌株對供試作物無影響，并表現(xiàn)促生作用.

2.2.2頂孢霉菌株對供試作物鮮質(zhì)量的影響由表4可知，Ahy1不同濃度對6種供試作物的鮮質(zhì)量均有不同程度的影響，處理7 d后，對菜豆、小麥幼苗鮮質(zhì)量有明顯的促進作用，其相對抑制率分別為-21.10%、-14.29%，與對照差異顯著；其次對辣椒、茄子和黃瓜幼苗鮮質(zhì)量有輕微的促進作用，其抑制率分別為-5.71%、-2.00%和-1.10%；對玉米幼苗的鮮質(zhì)量略有抑制作用，相對抑制率為2.65%，與對照差異不顯著.

A：黃瓜Ahy1處理；B：黃瓜清水對照處理；C：玉米Ahy1處理；D：玉米清水對照處理；E：菜豆Ahy1處理；F：菜豆清水對照處理；G：小麥Ahy1處理；H：小麥清水對照處理；I：茄子Ahy1處理；J：茄子清水對照處理；K：辣椒Ahy1處理；L：辣椒清水對照處理.圖1　Ahy1孢子懸浮液對6種作物幼苗生長的影響Fig.1　Effect of Ahy1 spores suspension on seedlings’ growth of six crops

頂孢霉處理/(個孢子·mL-1)黃瓜株高/cm相對抑制率/%玉米株高/cm相對抑制率/%菜豆株高/cm相對抑制率/%CK13.54±0.65a-8.55±2.09a-22.60±3.76b-5×10613.35±1.47a1.429.04±1.57a-5.7326.78±3.65ab-18.501×10614.36±0.85a-6.039.92±1.87a-16.0224.53±1.81ab-8.545×10513.54±1.97a-0.029.96±0.65a-16.4927.88±3.53a-23.362×10514.50±1.77a-7.069.68±1.42a-13.2227.43±3.55a-21.371×10513.12±1.50a3.128.20±0.94a-4.0927.42±2.34a-21.33平均抑制率%-1.71-11.11-18.62頂孢霉處理/(個孢子·mL-1)小麥株高/cm相對抑制率/%茄子株高/cm相對抑制率/%辣菽株高/cm相對抑制率/%CK22.20±3.62a-5.2±0.68ab-3.97±0.47a-5×10625.21±4.91a-13.555.51±0.60ab-4.754.15±0.72a-4.531×10624.45±4.54a-10.145.95±0.49a-13.114.52±0.60a-13.855×10523.69±7.08a-6.714.93±0.80b6.274.30±0.45a-8.312×10523.43±5.63a-5.545.34±0.59ab-1.524.46±0.78a-12.341×10523.23±3.72a-4.644.87±0.73b7.414.12±0.56a-3.78平均抑制率%-8.12-6.61-8.56

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

表4　Ahy1孢子懸浮液對6種作物幼苗鮮質(zhì)量的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2.2.3頂孢霉菌株對供試作物干質(zhì)量的影響由表5可知，Ahy1 5個濃度處理6種供試作物7 d后，對黃瓜和玉米的干質(zhì)量有抑制作用，其抑制率分別為15.10%和6.21%；對辣椒、菜豆、茄子和小麥的干質(zhì)量有促進作用，其抑制率分別為-16.41%、-15.59%、-15.10%和-9.50%；與對照差異不顯著.

表5　Ahy1孢子懸浮液對6種作物幼苗干質(zhì)量的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

3討論

本研究結(jié)果表明，在25 ℃，相對濕度75%條件下，Ahy1菌株不同濃度的懸浮液對6種供試作物處理7 d后，對大部分幼苗的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量有不同程度的促生作用，對玉米幼苗的鮮質(zhì)量和黃瓜及玉米幼苗的干質(zhì)量有抑制作用.Ahy1菌株不同濃度孢子懸浮液處理供試作物21 d后，均未見任何發(fā)病癥狀，植株生長正常，對供試作物生長沒有明顯可見影響.

Ahy1孢子懸浮液6個濃度對黃瓜和小麥種子萌發(fā)和根長生長有輕微的抑制作用，隨濃度降低抑制作用減弱，表現(xiàn)為促進作用，即整體上表現(xiàn)出高濃度抑制作用和低濃度促生作用.由于Ahy1菌株對蚜蟲有較高的毒力(對甘藍蚜的LC50為1.650× 106個孢子/mL)[9]，其代謝液中含有多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)中可能含有對植物生長有影響的成分.但從試驗結(jié)果來看，這些前期的影響較為輕微，對作物生長后期的影響有待于進一步驗證.

Ahy1孢子懸浮液6個濃度對小麥種子中可溶性蛋白(Pro)、過氧化物酶(POD)、過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)含量有顯著的影響，其平均相對抑制率分別為-2.05%、-18.07%、-23.31%和-34.33%，表現(xiàn)為促進作用，這些酶是植株保護酶系統(tǒng)的重要組成部分，小麥在此條件下抗逆性增強；對黃瓜種子中SOD、POD表現(xiàn)為促進作用，相對抑制率分別為-82.51%和-35.96%，但對Pro、CAT有抑制作用，這可能是引起黃瓜幼苗干質(zhì)量變化的原因.

頂孢霉菌株Ahy1孢子懸浮液對作物生長后期的影響作用及對黃瓜種子中CAT活性的抑制作用有待于進一步研究驗證.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Effect ofAcremoniumhansfordiispores suspension on germination and growth of several crops seedling

HAO Yu,YANG Shun-yi,ZHANG Xin-hu,SHEN Hui-min,YUE Xiu-li,LUO Ling-yan

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Education Ministry,Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The effects ofAcremoniumhansfordii(Ahy1) spores suspension were studied on seed germination and seedling growth of several crops.【Method】 Indoor biological tests and physiological and biochemical analysis were conducted on cucumbers,corns,beans,wheat,eggplant and peppers.【Result】 Ahy1 spores suspension at six concentrations showed promotion at high concentrations and inhibition at low concentrations on germination and root length of wheat and cucumber.Ahy1 differently promoted protein (Pro) content,activity of peroxidase (POD),superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in wheat seeds.Ahy1 spores suspension increased activity of SOD and POD in cucumber seeds,the inhibition rates were -82.51% and -35.96%.Ahy1 had significant inhibition to CAT activity,and no significant effect to Pro content.The average inhibition rates of Ahy1 to plant height of the six crops were -18.62%,-16.22%,-11.11%,-8.56%,-6.61% and -1.71%;and that were -21.10% and -14.29% to fresh weight of bean and wheat，that were -16.41%,-15.59%,-15.10% and -9.50% to the dry weight of peppers,beans,eggplant and wheat.These results indicated promoting effect of Ahy1,but inhibition to dry weight of cucumbers and corn.【Conclusion】 The tested crops were treated by Ahy1 spores suspension at six concentrations for 21 days,no significant disorders were found on plant growth.

Key words：A.hansfordiispores suspension;seedling height;fresh weight;dry weight;seed germination rate;root growth;physiological indicators

通信作者：張新虎，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)及生物農(nóng)藥的開發(fā)與應(yīng)用.E-mail：ndzxh@gsau.edu.cn

基金項目：甘肅省科技支撐計劃項目(1204NKCA073).

收稿日期：2015-01-21；修回日期：2015-04-01

中圖分類號：S 763.306

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)03-0095-07

第一作者：郝雨(1988-) ，男，碩士研究生，研究方向微生物制劑的開發(fā)與應(yīng)用.E-mail：haoyu3210@sina.com