• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新型納米凝膠包被生物炭基固定化酶研究

    2016-07-15 01:21:02胡朝華張又弛萬順剛
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2016年13期
    關鍵詞:油酸催化活性

    胡朝華,張 蕾,張又弛,萬順剛

    (1.福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術研究中心,福建福州 350002;2.中國科學院城市環(huán)境研究所,福建廈門 361021)

    ?

    新型納米凝膠包被生物炭基固定化酶研究

    胡朝華1,2,張 蕾1,張又弛2,萬順剛2

    (1.福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術研究中心,福建福州 350002;2.中國科學院城市環(huán)境研究所,福建廈門 361021)

    摘要[目的]探討一種新型的脂肪酶固定化載體。[方法]采用酶底物類似物油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭表面,首次制備出一種新型高效的納米凝膠包被生物炭基質(zhì)作為脂肪酶酶固定化載體。[結(jié)果]通過油/水界面的活化效應激活脂肪酶分子的催化活性位點,并通過凝膠的溶脹/退溶脹作用增強脂肪酶的固定化效果,所制備的新型固定化脂肪酶的催化活性和催化穩(wěn)定性都得到了充分提高。[結(jié)論]新型固定化脂肪酶為酶固定化技術研究提供了材料。

    關鍵詞納米凝膠;油酸;固定化酶;催化活性

    生物酶法是一種可用于轉(zhuǎn)化生物柴油的環(huán)保高效型資源化技術。生物酶法是以脂肪酶為催化劑,在非水溶液體系中催化動植物油脂(脂肪酸甘油三酯)與短鏈醇合成脂肪酸單烷基酯(即生物柴油),這種催化合成方法具有原料預處理簡單、醇用量少、能耗低、產(chǎn)物分離回收方便以及環(huán)境友好等優(yōu)點。然而,游離的脂肪酶往往催化活性和使用壽命不足,從而限制了其在催化制備生物柴油中的應用。目前,許多策略如脂肪酶分子修飾和酶固定化技術已被用于改善脂肪酶在非水溶液體系中的催化活性和穩(wěn)定性。酶固定化技術由于能提高脂肪酶的催化性和重復使用效率,明顯降低酶催化工藝的成本,因而已成為制備生物柴油的關鍵技術之一。

    脂肪酶固定化載體和固定方法是影響固定化酶活性的2個重要因素[1-3]。然而,傳統(tǒng)的脂肪酶固定化材料,包括已商業(yè)化的固定化脂肪酶Novozym435所采用的大孔丙烯酸樹脂,往往采用惰性的無機或有機材料,這些酶固定載體及其固定化過程缺乏可調(diào)控性。與傳統(tǒng)的惰性載體相比,智能化高分子材料(如溫度敏感型水凝膠)是一類理想的酶固定載體,其在增加酶負載量、保持酶分子構(gòu)象和催化活性、提高固定化酶再利用性等方面具有重要的應用價值。生物炭是一種低成本、多功能的環(huán)保材料,已被廣泛用于溫室氣體減排、退化土壤改良、重金屬和有機污染物的環(huán)境修復等領域,但有關生物炭載體用于固定化脂肪酶的研究鮮見報道。鑒于此,筆者采用生物炭和溫敏性高分子凝膠,研制了一種新型高效的納米凝膠包被生物炭基質(zhì)作為脂肪酶酶固定載體,并初步研究了其催化特性,旨在為酶固定化技術的進一步研究與應用提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料脂肪酶、棕櫚酸對硝基苯酯購自Sigma公司;N-異丙基丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及油酸鈉購自百靈威試劑公司;曲拉通X-100、過硫酸鈉、對硝基苯酚購自上海國藥集團;其他試劑均為分析純。

    1.2方法

    1.2.1油酸分子修飾的納米凝膠合成。參考Sahiner等[4]的方法,分別稱取一定量的N-異丙基丙烯酰胺、 N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及油酸鈉,完全溶于去離子水中,加入曲拉通X-100作為乳化劑。通惰性氣體,70 ℃下攪拌加熱20~30 min后,加入過硫酸鈉水溶液,繼續(xù)攪拌熱聚合反應3 h。將反應液體轉(zhuǎn)移至透析袋,在水中透析至少48 h,轉(zhuǎn)移透析液至離心管,-50 ℃冷凍凍干,所得產(chǎn)物即為油酸修飾的納米凝膠顆粒。

    1.2.2納米凝膠包被生物炭基載體的制備。從閩南地區(qū)收集生物質(zhì)廢棄物,水洗干燥后粉碎過20目篩,在馬弗爐中以10 ℃/min的升溫速率加熱到675 ℃,限氧熱裂解4 h,裂解產(chǎn)物(即生物炭)作為酶固定化基質(zhì)。將所得生物炭浸漬于“1.2.1”所得納米凝膠懸液中,充分混合后,使納米凝膠附著/包被在生物炭的表面,過濾收集沉淀,所得沉淀物真空干燥,即獲得油酸修飾的納米凝膠包被生物炭基載體。

    1.2.3固定化酶的制備。將脂肪酶溶于磷酸緩沖液(pH 7,50.0 mmol/L),充分溶解后,離心去除雜質(zhì),收集酶上清液,與所制備的納米凝膠包被生物炭基載體混合,25 ℃下攪拌混勻后,250 r/min振蕩3 h,使油酸分子修飾的納米凝膠網(wǎng)絡溶脹,通過油/水界面活化效應增強脂肪酶分子的催化活性。為了進一步提高活化脂肪酶在載體上的固定化效果,加入戊二醛(終濃度為1%),35 ℃下磁力攪拌80 min,使載體上已活化的脂肪酶分子之間相互交聯(lián)并定向固定下來。通過高速離心并反復用磷酸緩沖液洗滌后,收集沉淀物,-50 ℃冷凍干燥,即獲得油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶。

    1.2.4酶活測定。稱取一定量棕櫚酸對硝基苯酯溶解到異丙醇溶劑中,制備16.5 mmol/L棕櫚酸對硝基苯酯的工作液。取上述溶液1.0 mL于圓底燒瓶中,加入9.0 mL磷酸緩沖液,再投入0.2 mL曲拉通X-100和10 mg阿拉伯膠?;靹蚝螅?0~50 ℃的恒溫水浴搖床中保育30 min,加入不同量的脂肪酶,恒溫振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后,分取反應液并用預冷的去離子水稀釋,高速離心使殘留的蛋白酶及其載體完全沉積。收集上清液,在410 nm波長處比色分析對硝基苯酚的濃度。脂肪酶的催化水解活性用單位體積的酶活性單位(U/mL)來評估,1個酶活性單位定義為在上述條件下單位時間內(nèi)產(chǎn)生1 μmol/L對硝基苯酚所需的酶量。

    2結(jié)果與分析

    2.1凝膠包被生物炭固定化酶載體的形貌結(jié)構(gòu)通過分子表面修飾,研制出一種納米凝膠表面包被的生物炭基固定化載體。油酸分子修飾的凝膠顆粒粒徑主要分布在300~900 nm(圖1a)。將所制備的納米凝膠顆粒包被于生物炭表面后,納米凝膠顆粒可均勻分散在生物炭表面(圖1b)。通常,油酸分子可作為底物類似物激活脂肪酶分子的活性構(gòu)象修飾,因此,將油酸修飾的凝膠顆粒包被生物炭并用于固定化酶,可充分提高固定化酶的催化活性及其穩(wěn)定性。

    注:a.納米凝膠;b.凝膠包被生物炭。Note:a.Nanogel; b.Encapsulated biochar of gel.圖1 納米凝膠及其包被生物炭的掃描電鏡形貌Fig.1 Scanning electron microscopy of nanogel and its encapsulated biochar

    注:NH-MBC.凝膠包被酶固定化載體;MBC.未包被酶固定化載體。Note:NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.圖2 納米凝膠包被酶固定化載體與未包被載體的熱失重曲線Fig.2 Thermo-gravimetric curves of immobilized vector of nanogel encapsulated lipase and noncapsulated vector

    注:NH-MBC.凝膠包被酶固定化載體;MBC.未包被酶固定化載體。Note:NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.圖3 納米凝膠包被酶固定化載體與未包被載體的紅外圖譜Fig.3 Infrared spectrograms of immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme and noncapsulated vector

    2.2凝膠包被生物炭固定化酶載體的熱穩(wěn)定性 熱重分析儀和傅里葉紅外光譜儀的測試結(jié)果表明,納米凝膠包被處理增強了生物炭基固定化載體的熱穩(wěn)定性,同時并未改變酶固定化載體的表面功能基團。由圖2可知,與對照未包被的酶固定化載體相比,納米凝膠包被的固定化載體在熱失重規(guī)律上基本一致,熱失重初期由于載體內(nèi)部所含自由水和結(jié)合水釋放導致緩慢失重,然后基質(zhì)分解逐漸失重。由圖3可知,與未包被的酶固定化載體相比,納米凝膠包被的炭基載體在1 600~1 560 cm-1和1 120~1 090 cm-1兩位移處均有羧基和氨基峰的偏移,說明納米凝膠包被處理未影響固定化載體表面官能基團的分布。

    2.3凝膠包被生物炭固定化酶載體的組成分析由表1可知,納米凝膠包被載體在酶固定處理前后,載體組分尤其是碳和氧含量存在明顯差異。在脂肪酶固定前,納米凝膠包被載體中含氮量比未包被載體增加了1.76倍,包被與未包被載體的含碳量、含氧量和含氫量的變異系數(shù)在3%~7%范圍內(nèi)。而固定化酶之后,2種固定化載體的含氮量都明顯增加,包被載體的含氮量比未包被載體增加了70.6%,其中碳、氧含量的變異系數(shù)達6%~25%。

    表1脂肪酶固定前后的未包被載體和納米凝膠包被載體的元素組成

    Table 1Element components of noncapsulated vector(MBC) and nanogel encapsulated vector(NH/MBC)

    %

    注:NH-MBC.凝膠包被酶固定化載體;MBC.未包被酶固定化載體。

    Note:NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.

    2.4納米凝膠包被生物炭固定化酶的催化性能生物炭表面經(jīng)納米凝膠包被修飾后,明顯提高了固定化脂肪酶的水解催化活性。由圖4可知,在不同催化反應溫度條件下,采用油酸修飾的納米膠包被生物炭固定脂肪酶的催化酯水解反應活性均明顯高于非包被的生物炭基固定化脂肪酶。在該試驗條件下(催化溫度40 ℃),比非包被的生物炭基固定化脂肪酶相比,同等量的納米凝膠包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解活性最高增加了45.3倍。

    3結(jié)論

    該研究首次報道了一種油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶,新型固定化脂肪酶具有以下特點:①采用油酸分子修飾功能化載體的內(nèi)外表面,通過油/水界面的活化效應增強脂肪酶分子活性構(gòu)象與催化活性;②結(jié)合可控釋水分子的溫敏性高分子凝膠網(wǎng)絡,保護脂肪酶活性并實現(xiàn)酶固定化過程的調(diào)控,提高脂肪酶的固定化效果和催化活性;③以生物質(zhì)炭作為固定化基質(zhì),其生物質(zhì)原料可再生,制備過程環(huán)保、經(jīng)濟;④新型固定化脂肪酶具有穩(wěn)定的酶催化活性,并可重復利用,其制備方法簡單、條件溫和、成本低廉。

    圖4 催化反應溫度對納米凝膠包被生物炭基固定化酶(MC675/NOH/Lipase)與非包被生物炭基固定化酶(MC675/Lipase)的酶催化活性比較Fig.4 Enzyme catalytic activity comparison of catalytic reaction temperature to lipase immobilized with nanogel encapsulated biochar(MC675/NOH/Lipase) and lipase immobilized with noncapsulated biochar (MC675/Lipase)

    參考文獻

    [2] GAO S,WANG Y,DIAO X,et al.Effect of pore diameter and cross-linking method on the immobilization efficiencyof Candida rugosa lipase in SBA-15[J].Bioresource technology,2010,101:3830-3837.

    [3] KUO C H,PENG L T,KAN S C,et al.Lipase-immobilized biocatalytic membranes for biodiesel production[J].Bioresource technology 2013,145:229-232.

    [4] SAHINER N,ALB A M,GRAVES R,et al.Core-shell nanohydrogel structures as tunable delivery systems[J].Polymer,2007,48:704-711.

    基金項目福建省自然科學基金重點項目(2013Y0082,2013N0039);浙江省寧波市自然科學基金項目(2013A610184);福建省廈門市科技計劃項目(3502Z20142019)。

    作者簡介胡朝華(1978- ),男,福建莆田人,博士,從事環(huán)境功能材料與資源化技術研究。

    收稿日期2016-03-30

    中圖分類號TQ 426.1

    文獻標識碼A

    文章編號0517-6611(2016)13-014-03

    Study on the Lipase Immobilized with Novel Nanogel Encapsulated Biochar

    HU Chao-hua1,2, ZHANG Lei1, ZHANG You-chi2et al

    (1. National Center of Engineering Research on Sugarcane, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002; 2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen, Fujian 361021)

    Abstract[Objective] To discuss a novel lipase immobilized carrier. [Method] Novel nanogels modified with oleic acid were synthesized and encapsulated on the surface of biochar, which was used firstly as a kind of vectors to immobilize enzyme such as lipase. [Result] The catalytic activity and stability of the resulting immobilized lipase were improved adequately through activating the catalytic sites by oil/water interface effect, as well as immobilization approach using the swelling/deswelling properties of nanogels on biochar surfaces. [Conclusion] The novel immobilized lipase provides materials for the research on enzyme immobilization technology.

    Key wordsNanogels; Oleic acid; Immobilized lipase; Catalytic activity

    猜你喜歡
    油酸催化活性
    花生中的翹楚――高油酸花生
    HPLC-ELSD法測定麗水薏苡仁中甘油三油酸酯的含量
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    油酸2-乙基己酯的催化合成及性能
    稀土La摻雜的Ti/nanoTiO2膜電極的制備及電催化活性
    環(huán)化聚丙烯腈/TiO2納米復合材料的制備及可見光催化活性
    Fe3+摻雜三維分級納米Bi2WO6的合成及其光催化活性增強機理
    BiFeO3空間選擇性光化學還原Ag及光催化活性
    LaCoO3催化劑的制備及其在甲烷催化燃燒反應中的催化活性
    油酸酰胺去除藍藻水華的野外圍隔原位試驗
    cao死你这个sao货| 久久国产亚洲av麻豆专区| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲专区中文字幕在线| 大香蕉久久网| 久9热在线精品视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线观看www视频免费| 成年动漫av网址| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜老司机福利片| 在线观看舔阴道视频| 欧美 日韩 精品 国产| 人妻一区二区av| 1024视频免费在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产激情欧美一区二区| 精品久久久精品久久久| 久久久国产欧美日韩av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 午夜久久久在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 久久亚洲精品不卡| 丝袜人妻中文字幕| www.熟女人妻精品国产| 亚洲三区欧美一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成人黄色视频免费在线看| 久久人妻av系列| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人系列免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 少妇的丰满在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 乱人伦中国视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩一级在线毛片| 久久精品国产综合久久久| 嫩草影视91久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 性少妇av在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 日日爽夜夜爽网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| av免费在线观看网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲综合色网址| 免费日韩欧美在线观看| av视频免费观看在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 91大片在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日本黄色日本黄色录像| 99热国产这里只有精品6| 国产激情欧美一区二区| 嫩草影视91久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 美国免费a级毛片| 精品亚洲成a人片在线观看| 99国产综合亚洲精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 看黄色毛片网站| 老熟女久久久| 国产成人精品无人区| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品亚洲一级av第二区| 在线天堂中文资源库| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| e午夜精品久久久久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜亚洲福利在线播放| svipshipincom国产片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 91精品三级在线观看| 久久久国产成人免费| 欧美最黄视频在线播放免费 | 99re在线观看精品视频| 一夜夜www| 老司机福利观看| 曰老女人黄片| 欧美激情 高清一区二区三区| 中文欧美无线码| xxx96com| av中文乱码字幕在线| 免费高清在线观看日韩| 首页视频小说图片口味搜索| 成年人午夜在线观看视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 制服诱惑二区| 精品久久久精品久久久| 国产av精品麻豆| 色婷婷av一区二区三区视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲久久久国产精品| 免费观看a级毛片全部| 一区二区三区国产精品乱码| 国产xxxxx性猛交| 人成视频在线观看免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一二三四在线观看免费中文在| a级片在线免费高清观看视频| 成人手机av| 国产激情欧美一区二区| 国产精品久久久av美女十八| av网站免费在线观看视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产伦人伦偷精品视频| 久久人妻av系列| 纯流量卡能插随身wifi吗| 黄色视频,在线免费观看| 91麻豆av在线| 女同久久另类99精品国产91| 五月开心婷婷网| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久中文看片网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美乱色亚洲激情| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 老司机午夜十八禁免费视频| av免费在线观看网站| 深夜精品福利| 久久久国产成人精品二区 | 欧美黑人精品巨大| 精品熟女少妇八av免费久了| 成年人午夜在线观看视频| 国产91精品成人一区二区三区| tocl精华| 不卡av一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 美国免费a级毛片| 久热这里只有精品99| 国产av又大| 在线国产一区二区在线| 久久久精品免费免费高清| 两性夫妻黄色片| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久狼人影院| 日本一区二区免费在线视频| 九色亚洲精品在线播放| 美女高潮到喷水免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 曰老女人黄片| 91成年电影在线观看| 人妻久久中文字幕网| 在线观看免费视频日本深夜| 91成年电影在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 好男人电影高清在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 欧美精品av麻豆av| 精品亚洲成a人片在线观看| 夜夜爽天天搞| 黑人操中国人逼视频| 国产不卡一卡二| 一区二区三区精品91| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利乱码中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 亚洲一区中文字幕在线| 久久久久久久午夜电影 | 国产乱人伦免费视频| 久久中文看片网| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久草成人影院| 一区二区三区激情视频| 男女免费视频国产| 99国产精品99久久久久| 久久天堂一区二区三区四区| 国产97色在线日韩免费| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费高清在线观看日韩| 国产精品一区二区免费欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美成人免费av一区二区三区 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费在线观看完整版高清| 久久中文字幕一级| 69精品国产乱码久久久| 在线国产一区二区在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 性少妇av在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲avbb在线观看| 亚洲 国产 在线| 69av精品久久久久久| 欧美最黄视频在线播放免费 | 亚洲久久久国产精品| 国产单亲对白刺激| 黄色 视频免费看| 国产亚洲精品久久久久5区| 91大片在线观看| 午夜影院日韩av| 久久性视频一级片| 欧美乱色亚洲激情| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲精品国产色婷婷电影| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 人成视频在线观看免费观看| 国产在视频线精品| 国产精品九九99| 国产激情久久老熟女| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 午夜福利,免费看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲全国av大片| 亚洲黑人精品在线| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久久久午夜电影 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜91福利影院| 宅男免费午夜| 国产精品亚洲av一区麻豆| 激情视频va一区二区三区| а√天堂www在线а√下载 | a级毛片在线看网站| 9191精品国产免费久久| 啦啦啦 在线观看视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费看a级黄色片| 久久性视频一级片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 丝袜美腿诱惑在线| 在线观看免费高清a一片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 三上悠亚av全集在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产乱子伦一区二区三区| 免费少妇av软件| 成人黄色视频免费在线看| 曰老女人黄片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一级毛片精品| 91精品三级在线观看| 国产男女内射视频| 日本欧美视频一区| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久ye,这里只有精品| 大型黄色视频在线免费观看| 免费看十八禁软件| 午夜激情av网站| 成在线人永久免费视频| 真人做人爱边吃奶动态| 99在线人妻在线中文字幕 | 久久久久精品人妻al黑| 亚洲情色 制服丝袜| 美女午夜性视频免费| 日本wwww免费看| 不卡一级毛片| 久久九九热精品免费| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久国产精品大桥未久av| 黄色a级毛片大全视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩欧美在线二视频 | 国产人伦9x9x在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲少妇的诱惑av| 国产麻豆69| 国产精品久久久久久精品古装| 最近最新免费中文字幕在线| 国产乱人伦免费视频| 免费观看人在逋| 中文字幕av电影在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 男女午夜视频在线观看| 久99久视频精品免费| 一区二区三区激情视频| 大香蕉久久成人网| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品国产国语对白av| 日韩三级视频一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线永久观看黄色视频| svipshipincom国产片| 国产精品久久久av美女十八| 中文字幕色久视频| 免费少妇av软件| 国产成人免费观看mmmm| 午夜精品国产一区二区电影| 在线观看日韩欧美| 久久久久久人人人人人| 欧美乱妇无乱码| 麻豆成人av在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 夜夜爽天天搞| 欧美激情久久久久久爽电影 | 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品国产av在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 成年动漫av网址| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品无人区乱码1区二区| 国产亚洲av高清不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 在线av久久热| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av视频免费观看在线观看| a在线观看视频网站| 91精品国产国语对白视频| av欧美777| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产高清视频在线播放一区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 99久久国产精品久久久| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 国产主播在线观看一区二区| 多毛熟女@视频| 99re在线观看精品视频| 欧美中文综合在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 日韩三级视频一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲成人国产一区在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 我的亚洲天堂| 大香蕉久久网| 精品国产国语对白av| 日韩视频一区二区在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费日韩欧美在线观看| 69av精品久久久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品久久视频播放| 亚洲熟女毛片儿| 男人的好看免费观看在线视频 | 天堂√8在线中文| 精品久久久久久久久久免费视频 | 午夜福利在线免费观看网站| 91九色精品人成在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 91在线观看av| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲专区字幕在线| 人成视频在线观看免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看www视频免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产成人精品无人区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 在线看a的网站| 国产精品国产高清国产av | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 热re99久久国产66热| 91成年电影在线观看| 亚洲午夜理论影院| 男女之事视频高清在线观看| 下体分泌物呈黄色| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品永久免费网站| 亚洲,欧美精品.| 午夜福利在线免费观看网站| 成人影院久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久精品国产清高在天天线| 国产成人啪精品午夜网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 色尼玛亚洲综合影院| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 老汉色∧v一级毛片| 在线观看日韩欧美| 涩涩av久久男人的天堂| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲第一青青草原| av国产精品久久久久影院| 久久久久久久午夜电影 | 波多野结衣av一区二区av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久人妻av系列| 亚洲av成人av| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲色图av天堂| 国产成人影院久久av| 不卡一级毛片| 日本vs欧美在线观看视频| 天天影视国产精品| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲av美国av| 热re99久久国产66热| 国产亚洲精品久久久久5区| 手机成人av网站| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线观看免费视频网站a站| 久久ye,这里只有精品| 99re6热这里在线精品视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 香蕉国产在线看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99久久精品国产亚洲精品| 国产真人三级小视频在线观看| 高清在线国产一区| 国产午夜精品久久久久久| 黑人操中国人逼视频| 在线看a的网站| 国产亚洲av高清不卡| 一级作爱视频免费观看| tube8黄色片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | av中文乱码字幕在线| 91麻豆av在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产亚洲精品久久久久5区| 九色亚洲精品在线播放| 99香蕉大伊视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 91精品三级在线观看| 黑人操中国人逼视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久香蕉国产精品| 欧美性长视频在线观看| 电影成人av| 欧美日韩黄片免| aaaaa片日本免费| 久久狼人影院| 亚洲精品久久午夜乱码| 色94色欧美一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜精品在线福利| 久久久国产欧美日韩av| 91大片在线观看| videosex国产| 亚洲色图av天堂| 欧美日韩视频精品一区| 色在线成人网| 久久人妻av系列| 一个人免费在线观看的高清视频| 老司机在亚洲福利影院| av福利片在线| 天天影视国产精品| 精品第一国产精品| 人妻一区二区av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| av视频免费观看在线观看| 成人三级做爰电影| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产国语露脸激情在线看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久性视频一级片| 精品亚洲成a人片在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产亚洲精品一区二区www | 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜久久久在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄片大片在线免费观看| 午夜免费成人在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 天天添夜夜摸| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日本wwww免费看| 两个人免费观看高清视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲av电影在线进入| 成年版毛片免费区| bbb黄色大片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国精品久久久久久国模美| 国产成人精品久久二区二区91| 国产一区二区三区视频了| 操美女的视频在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 看黄色毛片网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 99久久人妻综合| 高清在线国产一区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产成人av教育| 日韩欧美一区视频在线观看| 成人精品一区二区免费| 午夜福利在线观看吧| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品欧美亚洲77777| 岛国毛片在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人av激情在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 不卡一级毛片| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线天堂中文资源库| 下体分泌物呈黄色| 三级毛片av免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 咕卡用的链子| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产野战对白在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 日本a在线网址| 999精品在线视频| 一级片'在线观看视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 老司机亚洲免费影院| 一级作爱视频免费观看| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 久久精品亚洲av国产电影网| 搡老岳熟女国产| 国精品久久久久久国模美| 国产精品 国内视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 最新美女视频免费是黄的| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 身体一侧抽搐| 国产激情久久老熟女| 露出奶头的视频| 一区二区三区激情视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品美女久久av网站| a级毛片黄视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品一二三| 国产在视频线精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品一品国产午夜福利视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 高清毛片免费观看视频网站 | 高清视频免费观看一区二区| 女性被躁到高潮视频| 免费观看a级毛片全部| 午夜福利乱码中文字幕| 黑人操中国人逼视频| 久久九九热精品免费| 久久狼人影院| 午夜日韩欧美国产| 桃红色精品国产亚洲av| 国产xxxxx性猛交| 看黄色毛片网站| 91国产中文字幕| 午夜福利欧美成人| 亚洲av片天天在线观看| 久久九九热精品免费| avwww免费| 黑人操中国人逼视频| tocl精华| 黄色女人牲交| 国产精品久久久久成人av| 在线观看日韩欧美| 久久精品国产清高在天天线| 欧美性长视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| avwww免费| xxxhd国产人妻xxx| 久久中文字幕一级| 欧美一级毛片孕妇| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 深夜精品福利| 久久 成人 亚洲| 性色av乱码一区二区三区2|