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    新型納米凝膠包被生物炭基固定化酶研究

    2016-07-15 01:21:02胡朝華張又弛萬順剛
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2016年13期
    關鍵詞:油酸催化活性

    胡朝華,張 蕾,張又弛,萬順剛

    (1.福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術研究中心,福建福州 350002;2.中國科學院城市環(huán)境研究所,福建廈門 361021)

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    新型納米凝膠包被生物炭基固定化酶研究

    胡朝華1,2,張 蕾1,張又弛2,萬順剛2

    (1.福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術研究中心,福建福州 350002;2.中國科學院城市環(huán)境研究所,福建廈門 361021)

    摘要[目的]探討一種新型的脂肪酶固定化載體。[方法]采用酶底物類似物油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭表面,首次制備出一種新型高效的納米凝膠包被生物炭基質(zhì)作為脂肪酶酶固定化載體。[結(jié)果]通過油/水界面的活化效應激活脂肪酶分子的催化活性位點,并通過凝膠的溶脹/退溶脹作用增強脂肪酶的固定化效果,所制備的新型固定化脂肪酶的催化活性和催化穩(wěn)定性都得到了充分提高。[結(jié)論]新型固定化脂肪酶為酶固定化技術研究提供了材料。

    關鍵詞納米凝膠;油酸;固定化酶;催化活性

    生物酶法是一種可用于轉(zhuǎn)化生物柴油的環(huán)保高效型資源化技術。生物酶法是以脂肪酶為催化劑,在非水溶液體系中催化動植物油脂(脂肪酸甘油三酯)與短鏈醇合成脂肪酸單烷基酯(即生物柴油),這種催化合成方法具有原料預處理簡單、醇用量少、能耗低、產(chǎn)物分離回收方便以及環(huán)境友好等優(yōu)點。然而,游離的脂肪酶往往催化活性和使用壽命不足,從而限制了其在催化制備生物柴油中的應用。目前,許多策略如脂肪酶分子修飾和酶固定化技術已被用于改善脂肪酶在非水溶液體系中的催化活性和穩(wěn)定性。酶固定化技術由于能提高脂肪酶的催化性和重復使用效率,明顯降低酶催化工藝的成本,因而已成為制備生物柴油的關鍵技術之一。

    脂肪酶固定化載體和固定方法是影響固定化酶活性的2個重要因素[1-3]。然而,傳統(tǒng)的脂肪酶固定化材料,包括已商業(yè)化的固定化脂肪酶Novozym435所采用的大孔丙烯酸樹脂,往往采用惰性的無機或有機材料,這些酶固定載體及其固定化過程缺乏可調(diào)控性。與傳統(tǒng)的惰性載體相比,智能化高分子材料(如溫度敏感型水凝膠)是一類理想的酶固定載體,其在增加酶負載量、保持酶分子構(gòu)象和催化活性、提高固定化酶再利用性等方面具有重要的應用價值。生物炭是一種低成本、多功能的環(huán)保材料,已被廣泛用于溫室氣體減排、退化土壤改良、重金屬和有機污染物的環(huán)境修復等領域,但有關生物炭載體用于固定化脂肪酶的研究鮮見報道。鑒于此,筆者采用生物炭和溫敏性高分子凝膠,研制了一種新型高效的納米凝膠包被生物炭基質(zhì)作為脂肪酶酶固定載體,并初步研究了其催化特性,旨在為酶固定化技術的進一步研究與應用提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料脂肪酶、棕櫚酸對硝基苯酯購自Sigma公司;N-異丙基丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及油酸鈉購自百靈威試劑公司;曲拉通X-100、過硫酸鈉、對硝基苯酚購自上海國藥集團;其他試劑均為分析純。

    1.2方法

    1.2.1油酸分子修飾的納米凝膠合成。參考Sahiner等[4]的方法,分別稱取一定量的N-異丙基丙烯酰胺、 N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及油酸鈉,完全溶于去離子水中,加入曲拉通X-100作為乳化劑。通惰性氣體,70 ℃下攪拌加熱20~30 min后,加入過硫酸鈉水溶液,繼續(xù)攪拌熱聚合反應3 h。將反應液體轉(zhuǎn)移至透析袋,在水中透析至少48 h,轉(zhuǎn)移透析液至離心管,-50 ℃冷凍凍干,所得產(chǎn)物即為油酸修飾的納米凝膠顆粒。

    1.2.2納米凝膠包被生物炭基載體的制備。從閩南地區(qū)收集生物質(zhì)廢棄物,水洗干燥后粉碎過20目篩,在馬弗爐中以10 ℃/min的升溫速率加熱到675 ℃,限氧熱裂解4 h,裂解產(chǎn)物(即生物炭)作為酶固定化基質(zhì)。將所得生物炭浸漬于“1.2.1”所得納米凝膠懸液中,充分混合后,使納米凝膠附著/包被在生物炭的表面,過濾收集沉淀,所得沉淀物真空干燥,即獲得油酸修飾的納米凝膠包被生物炭基載體。

    1.2.3固定化酶的制備。將脂肪酶溶于磷酸緩沖液(pH 7,50.0 mmol/L),充分溶解后,離心去除雜質(zhì),收集酶上清液,與所制備的納米凝膠包被生物炭基載體混合,25 ℃下攪拌混勻后,250 r/min振蕩3 h,使油酸分子修飾的納米凝膠網(wǎng)絡溶脹,通過油/水界面活化效應增強脂肪酶分子的催化活性。為了進一步提高活化脂肪酶在載體上的固定化效果,加入戊二醛(終濃度為1%),35 ℃下磁力攪拌80 min,使載體上已活化的脂肪酶分子之間相互交聯(lián)并定向固定下來。通過高速離心并反復用磷酸緩沖液洗滌后,收集沉淀物,-50 ℃冷凍干燥,即獲得油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶。

    1.2.4酶活測定。稱取一定量棕櫚酸對硝基苯酯溶解到異丙醇溶劑中,制備16.5 mmol/L棕櫚酸對硝基苯酯的工作液。取上述溶液1.0 mL于圓底燒瓶中,加入9.0 mL磷酸緩沖液,再投入0.2 mL曲拉通X-100和10 mg阿拉伯膠?;靹蚝螅?0~50 ℃的恒溫水浴搖床中保育30 min,加入不同量的脂肪酶,恒溫振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后,分取反應液并用預冷的去離子水稀釋,高速離心使殘留的蛋白酶及其載體完全沉積。收集上清液,在410 nm波長處比色分析對硝基苯酚的濃度。脂肪酶的催化水解活性用單位體積的酶活性單位(U/mL)來評估,1個酶活性單位定義為在上述條件下單位時間內(nèi)產(chǎn)生1 μmol/L對硝基苯酚所需的酶量。

    2結(jié)果與分析

    2.1凝膠包被生物炭固定化酶載體的形貌結(jié)構(gòu)通過分子表面修飾,研制出一種納米凝膠表面包被的生物炭基固定化載體。油酸分子修飾的凝膠顆粒粒徑主要分布在300~900 nm(圖1a)。將所制備的納米凝膠顆粒包被于生物炭表面后,納米凝膠顆粒可均勻分散在生物炭表面(圖1b)。通常,油酸分子可作為底物類似物激活脂肪酶分子的活性構(gòu)象修飾,因此,將油酸修飾的凝膠顆粒包被生物炭并用于固定化酶,可充分提高固定化酶的催化活性及其穩(wěn)定性。

    注:a.納米凝膠;b.凝膠包被生物炭。Note:a.Nanogel; b.Encapsulated biochar of gel.圖1 納米凝膠及其包被生物炭的掃描電鏡形貌Fig.1 Scanning electron microscopy of nanogel and its encapsulated biochar

    注:NH-MBC.凝膠包被酶固定化載體;MBC.未包被酶固定化載體。Note:NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.圖2 納米凝膠包被酶固定化載體與未包被載體的熱失重曲線Fig.2 Thermo-gravimetric curves of immobilized vector of nanogel encapsulated lipase and noncapsulated vector

    注:NH-MBC.凝膠包被酶固定化載體;MBC.未包被酶固定化載體。Note:NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.圖3 納米凝膠包被酶固定化載體與未包被載體的紅外圖譜Fig.3 Infrared spectrograms of immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme and noncapsulated vector

    2.2凝膠包被生物炭固定化酶載體的熱穩(wěn)定性 熱重分析儀和傅里葉紅外光譜儀的測試結(jié)果表明,納米凝膠包被處理增強了生物炭基固定化載體的熱穩(wěn)定性,同時并未改變酶固定化載體的表面功能基團。由圖2可知,與對照未包被的酶固定化載體相比,納米凝膠包被的固定化載體在熱失重規(guī)律上基本一致,熱失重初期由于載體內(nèi)部所含自由水和結(jié)合水釋放導致緩慢失重,然后基質(zhì)分解逐漸失重。由圖3可知,與未包被的酶固定化載體相比,納米凝膠包被的炭基載體在1 600~1 560 cm-1和1 120~1 090 cm-1兩位移處均有羧基和氨基峰的偏移,說明納米凝膠包被處理未影響固定化載體表面官能基團的分布。

    2.3凝膠包被生物炭固定化酶載體的組成分析由表1可知,納米凝膠包被載體在酶固定處理前后,載體組分尤其是碳和氧含量存在明顯差異。在脂肪酶固定前,納米凝膠包被載體中含氮量比未包被載體增加了1.76倍,包被與未包被載體的含碳量、含氧量和含氫量的變異系數(shù)在3%~7%范圍內(nèi)。而固定化酶之后,2種固定化載體的含氮量都明顯增加,包被載體的含氮量比未包被載體增加了70.6%,其中碳、氧含量的變異系數(shù)達6%~25%。

    表1脂肪酶固定前后的未包被載體和納米凝膠包被載體的元素組成

    Table 1Element components of noncapsulated vector(MBC) and nanogel encapsulated vector(NH/MBC)

    %

    注:NH-MBC.凝膠包被酶固定化載體;MBC.未包被酶固定化載體。

    Note:NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.

    2.4納米凝膠包被生物炭固定化酶的催化性能生物炭表面經(jīng)納米凝膠包被修飾后,明顯提高了固定化脂肪酶的水解催化活性。由圖4可知,在不同催化反應溫度條件下,采用油酸修飾的納米膠包被生物炭固定脂肪酶的催化酯水解反應活性均明顯高于非包被的生物炭基固定化脂肪酶。在該試驗條件下(催化溫度40 ℃),比非包被的生物炭基固定化脂肪酶相比,同等量的納米凝膠包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解活性最高增加了45.3倍。

    3結(jié)論

    該研究首次報道了一種油酸分子修飾的納米凝膠包被生物炭基固定化脂肪酶,新型固定化脂肪酶具有以下特點:①采用油酸分子修飾功能化載體的內(nèi)外表面,通過油/水界面的活化效應增強脂肪酶分子活性構(gòu)象與催化活性;②結(jié)合可控釋水分子的溫敏性高分子凝膠網(wǎng)絡,保護脂肪酶活性并實現(xiàn)酶固定化過程的調(diào)控,提高脂肪酶的固定化效果和催化活性;③以生物質(zhì)炭作為固定化基質(zhì),其生物質(zhì)原料可再生,制備過程環(huán)保、經(jīng)濟;④新型固定化脂肪酶具有穩(wěn)定的酶催化活性,并可重復利用,其制備方法簡單、條件溫和、成本低廉。

    圖4 催化反應溫度對納米凝膠包被生物炭基固定化酶(MC675/NOH/Lipase)與非包被生物炭基固定化酶(MC675/Lipase)的酶催化活性比較Fig.4 Enzyme catalytic activity comparison of catalytic reaction temperature to lipase immobilized with nanogel encapsulated biochar(MC675/NOH/Lipase) and lipase immobilized with noncapsulated biochar (MC675/Lipase)

    參考文獻

    [2] GAO S,WANG Y,DIAO X,et al.Effect of pore diameter and cross-linking method on the immobilization efficiencyof Candida rugosa lipase in SBA-15[J].Bioresource technology,2010,101:3830-3837.

    [3] KUO C H,PENG L T,KAN S C,et al.Lipase-immobilized biocatalytic membranes for biodiesel production[J].Bioresource technology 2013,145:229-232.

    [4] SAHINER N,ALB A M,GRAVES R,et al.Core-shell nanohydrogel structures as tunable delivery systems[J].Polymer,2007,48:704-711.

    基金項目福建省自然科學基金重點項目(2013Y0082,2013N0039);浙江省寧波市自然科學基金項目(2013A610184);福建省廈門市科技計劃項目(3502Z20142019)。

    作者簡介胡朝華(1978- ),男,福建莆田人,博士,從事環(huán)境功能材料與資源化技術研究。

    收稿日期2016-03-30

    中圖分類號TQ 426.1

    文獻標識碼A

    文章編號0517-6611(2016)13-014-03

    Study on the Lipase Immobilized with Novel Nanogel Encapsulated Biochar

    HU Chao-hua1,2, ZHANG Lei1, ZHANG You-chi2et al

    (1. National Center of Engineering Research on Sugarcane, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002; 2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen, Fujian 361021)

    Abstract[Objective] To discuss a novel lipase immobilized carrier. [Method] Novel nanogels modified with oleic acid were synthesized and encapsulated on the surface of biochar, which was used firstly as a kind of vectors to immobilize enzyme such as lipase. [Result] The catalytic activity and stability of the resulting immobilized lipase were improved adequately through activating the catalytic sites by oil/water interface effect, as well as immobilization approach using the swelling/deswelling properties of nanogels on biochar surfaces. [Conclusion] The novel immobilized lipase provides materials for the research on enzyme immobilization technology.

    Key wordsNanogels; Oleic acid; Immobilized lipase; Catalytic activity

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