口蝦蛄卵黃蛋白原（Vg）基因的初步研究

劉海映，張　娜，閆紅偉，劉　奇，邢　坤，陳　雷，隋宥珍，林　原，李成久，郭良勇

（1.大連海洋大學遼寧省海洋牧場工程技術研究中心，遼寧大連116023；2.大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；3.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連116023；4.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021；5.遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧大連116015）

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口蝦蛄卵黃蛋白原（Vg）基因的初步研究

劉海映1、2，張娜1、2，閆紅偉3，劉奇1、2，邢坤1、2，陳雷1、2，隋宥珍4，林原5，李成久5，郭良勇5

（1.大連海洋大學遼寧省海洋牧場工程技術研究中心，遼寧大連116023；2.大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；3.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連116023；4.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021；5.遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧大連116015）

摘要：為研究口蝦蛄Oratosquilla oratoria卵黃蛋白原 （vitellogenin，Vg）基因，利用cDNA末端快速擴增（RACE）技術克隆口蝦蛄Vg基因cDNA全長序列 （GenBank登陸號：KR422400），并應用相對實時熒光定量PCR技術檢測雌雄口蝦蛄不同組織、不同發(fā)育時期卵巢Vg mRNA的表達量。結果表明：口蝦蛄Vg基因全長7727 bp，其中5′端非編碼區(qū)為36 bp，開放閱讀框 （ORF）為7521 bp，3′端非編碼區(qū)為170 bp，共編碼2506個氨基酸；預測的氨基酸序列中存在1個長度為20個氨基酸的信號肽，1個類似于枯草蛋白酶的內切蛋白酶識別位點 （RSKR），3個潛在的N-連接糖基化位點，1個在無脊椎和脊椎動物卵黃蛋白原中都比較保守的KALGNVG基序；對其結構域分析表明，口蝦蛄Vg蛋白含有4種保守結構域，分別為卵黃蛋白原N端結構域 （Vitellogenin_N）、血管性血友病因子 （vWFD）和兩種未知功能結構域 （domain of unknown function）DUF1943與DUF1081；經(jīng)NCBIBLASTP同源性比較，口蝦蛄Vg氨基酸序列與其他甲殼類的相似性為46％～52％；系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，口蝦蛄Vg單獨聚為一支；實時定量PCR結果顯示，口蝦蛄Vg基因在性腺和肝胰腺中均有表達，在肌肉中均不表達，卵巢中Vg mRNA的表達量顯著高于其他組織 （P＜0.05），且口蝦蛄Vg mRNA的相對表達量隨著卵巢的發(fā)育不斷增加 （P＜0.05），在成熟期時達到最高值，隨后顯著下降，Vg mRNA表達量在卵巢中的變化規(guī)律可以作為了解口蝦蛄性腺發(fā)育的有效指標。本研究結果為口蝦蛄Vg蛋白的功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：口蝦蛄；卵黃蛋白原 （Vg）；分子克??；熒光定量PCR；表達模式

卵黃蛋白原 （vitellogenin，Vg）是存在于非哺乳類卵生動物成熟雌性個體中的一種蛋白，是幾乎所有卵生動物卵黃蛋白 （Vitellin，Vn）的前體。Vg在卵黃發(fā)生期迅速積累，在卵子形成、胚胎發(fā)育和幼蟲階段都發(fā)揮十分重要的作用。在卵生動物中，Vg不僅為成熟的卵母細胞發(fā)育成胚胎提供糖類、脂肪、蛋白質和其他營養(yǎng)物質［1］，還能作為載體結合并攜帶金屬離子 （Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+）以及類胡蘿卜素、甲狀腺素、視黃醇、核黃素進入卵母細胞［2-5］。Vg雖特異地存在于卵生成熟雌性動物體內，但由于雄性及幼體動物體內也含有Vg基因 （通常不表達），當環(huán)境中含有的具雌激素效應的內分泌干擾物 （EDCs）達到一定劑量時，Vg基因也會在雄性和幼體動物中進行表達。在環(huán)境毒理學上，魚類和水生無脊椎動物的Vg基因可以作為一種良好的生物指示物來監(jiān)測環(huán)境雌激素的污染［6］。此外，關于Vg蛋白免疫學功能的研究在近些年也已成為研究熱點。文昌魚Branchiostoma lanceolatum的Vg可以抑制大腸桿菌的生長，抑制率可達90％以上［7］。埃及伊蚊Aedes aegypti的Vg可以特異性激活有效抗菌因子的大量表達，從而抵御病原體的侵入［8］。綜上，Vg既是卵生動物胚胎發(fā)育的重要營養(yǎng)物質，也是重要的環(huán)境標志物，還跟機體免疫防御密切相關，因此，對于Vg蛋白結構、表達模式和生物學功能等方面的研究，是開展對水產(chǎn)動物人工繁育、病害防治和資源保護等工作的重要理論基礎。

在大多數(shù)的魚類、兩棲類、昆蟲、甲殼動物和少數(shù)軟體動物中都開展了Vg基因的相關研究，對Vg基因的結構和生物學功能也有了比較深入的了解和認識?？谖r蛄 Oratosquilla oratoria俗稱蝦爬子、螳螂蝦等，隸屬于節(jié)肢動物門Arthropoda、甲殼綱Crustacea、軟甲亞綱Eumalacostraca、口足目Stomatopoda、蝦蛄科Squillidae、口蝦蛄屬Oratosquilla，為口足類中的優(yōu)勢種群，是中國沿海重要的漁業(yè)品種。由于人為濫捕和海區(qū)環(huán)境被破壞等原因，口蝦蛄資源量急劇減少，為了對其進行人工繁育和資源保護，開展口蝦蛄生殖生理學等方面的研究顯得尤為重要。目前，有關口蝦蛄Vg基因的研究尚未見報道，本研究中采用cDNA末端快速擴增（RACE）技術首次成功克隆了口蝦蛄Vg cDNA全長序列，并對Vg基因的表達模式進行了分析，以期為其人工繁育、資源保護等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用口蝦蛄采自大連近岸海域，體長為8.5～16.0 cm，雌、雄各30尾，在實驗室控溫循環(huán)水槽中暫養(yǎng)一周，水溫為25℃，鹽度為30，24 h充氣，每天投喂新鮮菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum一次。

動物總RNA快速抽提試劑盒、去RNA酶離心管等均購自生工生物工程 （上海）股份有限公司；3′-Full RACECore Setwith PrimeScriptTMRTase試劑盒、5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒、Prime-ScriptTMⅡ High Fidelity RT-PCR試劑盒、Prime-ScriptTMRT reagent試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus）、感受態(tài)大腸桿菌Escherichia coli DH5α均購自寶生物工程 （大連）有限公司（TaKaRa）；pEASY-T1 Simple Cloning試劑盒、pEASY-Blunt Simple Cloning試劑盒、Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司 （TransGen Biotech）；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質粒DNA小量試劑盒均購自愛思進生物技術有限公司 （AXYGEN Biotech）。試驗用引物及DNA測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司和英濰捷基 （上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 將口蝦蛄麻醉后于冰上解剖，取雌、雄口蝦蛄的性腺、肝胰腺、肌肉組織 （各組織取自3尾口蝦蛄）及4個不同發(fā)育時期 （參照Sohier等［9］的分期方法，Ⅰ為未發(fā)育期，Ⅱ為卵黃發(fā)生期，Ⅲ為成熟期，Ⅳ為消退期）的卵巢組織約50 mg（各發(fā)育階段的卵巢組織取自3尾口蝦蛄），并迅速置于液氮中，于超低溫冰箱（-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 按照動物總RNA快速抽提試劑盒說明書進行總RNA提取。采用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并通過K2800核酸蛋白分析儀 （凱奧中國）檢測總 RNA的純度及其濃度，然后置于冰箱（-80℃）中保存?zhèn)溆?。取總RNA 10μL（濃度為330 ng/μL），按照Full RACE Core Set with Prime-ScriptTMRTase試劑盒和PrimeScriptTMⅡHigh Fidelity RT-PCR試劑盒說明書分別進行反轉錄，反轉錄產(chǎn)物于-20℃下保存，分別用于后續(xù)Vg基因cDNA兩端序列和中間序列的克隆。按照 PrimeScriptTMRT reagent試劑盒說明書進行反轉錄獲得熒光定量PCR用cDNA。

1.2.3 口蝦蛄Vg cDNA全長序列的克隆 從原有已構建的口蝦蛄肝胰腺轉錄組測序文庫中篩選出和其他卵生動物Vg基因同源的序列片段7220 bp，采用Primer 5.0軟件設計 3′RACE特異性引物（Vg3-1）并合成 （表1）。根據(jù)3′-Full RACE試劑盒說明書，以雌性口蝦蛄卵巢cDNA為模板擴增Vg cDNA的3′端序列。Outer PCR和Inner PCR反應條件 （Outer反應體系為25μL，Inner反應體系為50μL）：94℃下預變性3 min；94℃下變性30 s，56℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，Outer PCR反應共進行25個循環(huán)，Inner PCR反應共進行30個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。Inner PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收DNA后，與pEASY-T1載體連接，轉化到 E.coli DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，于37℃下孵育1 h后涂板于LB/Amp+固體培養(yǎng)基上，再于37℃下過夜培養(yǎng)，隨機挑取陽性單克隆菌落于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，在37℃、160 r/min搖床上培養(yǎng)12 h，取3個平行菌液各5 m L，提取質粒后送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，將所得3′端cDNA序列于NCBI中用BLASTP軟件進行同源性分析。

同理設計5′RACE特異性引物 （Vg5-1）并合成（表1）。根據(jù)5′-Full RACE試劑盒說明書擴增Vg cDNA的5′端序列，反應條件同上。根據(jù)已得的Vg 3′端序列和5′端序列結合口蝦蛄轉錄組文庫，利用 Primer 5.0軟件設計中間序列特異性引物（GSP-F、GSP-R）并合成 （表1）。根據(jù)Prime-ScriptTMⅡHigh Fidelity RT-PCR試劑盒說明書擴增Vg cDNA的中間序列。PCR反應條件：94℃下預變性2 min；98℃下變性10 s，60℃下退火15 s，68℃下延伸7 min，共進行30個循環(huán)；最后在68℃下再延伸10 min，克隆載體為Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞，其他反應條件同上。將上述所得到的測序結果結合文庫序列進行人工拼接，最終得到口蝦蛄Vg cDNA的全長序列。

表1　試驗用引物Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.4 口蝦蛄Vg cDNA序列的生物信息學分析在NCBI中應用ORF Finder程序尋找開放閱讀框并翻譯成相應的氨基酸序列，運用 ProtParam程序（http：//expasy.org/tools/protparam.html）進行蛋白質理化性質分析，利用SignalP 4.1軟件進行信號肽預測，通過NCBI網(wǎng)站以及ScanProsite軟件（http：//prosite.expasy.org/）兩種方法分別預測蛋白質結構域，使用BLASTP軟件對氨基酸序列進行同源性分析，用MEGA 5.0軟件對甲殼動物Vg氨基酸序列采用NJ（Neighbor-Joining）法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 口蝦蛄Vg mRNA的表達分析 根據(jù)獲得的口蝦蛄Vg cDNA全長序列設計熒光定量檢測引物Vg-F1、Vg-F2和Vg-R1、Vg-R2，以β-actin作內參基因 （表1），試驗按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進行，模板為雌、雄口蝦蛄的性腺、肝胰腺、肌肉3個組織的cDNA。反應體系 （共20μL）：上、下游引物 （10 mol/L）各 1μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ （Tli RNaseH Plus）（2×）10μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，RNase-free H2O 5.6μL，模板cDNA 2μL。PCR反應采用兩步法：95℃下預變性30 s；95℃下變性5 s，60℃下退火和延伸34 s，共進行40個循環(huán)。反應結束后對擴增產(chǎn)物進行溶解曲線分析以確保特異性擴增。設置3次重復，以ROX作為校正熒光，以不加cDNA模板的反應體系作為陰性對照。采取同樣的方法檢測不同發(fā)育時期卵巢Vg基因的表達量，條件同上。采用 ABI 7500 Real-Time PCR儀 （Applied Biosystems，美國）進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT法處理，Vg mRNA相對表達量以平均值±標準差 （mean±S.D.）表示，采用 SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 口蝦蛄Vg基因的結構特征

采用5′RACE和3′RACE分別獲得489 bp的5′端片段以及550 bp的3′端片段，并得到中間序列6830 bp（圖1、圖2）。利用BioEdit軟件拼接得到7727 bp Vg基因cDNA全長序列 （GenBank登錄號：KR422400），經(jīng)ExPASy軟件分析得到包含36 bp的 5′端非編碼區(qū) （5′untranslated region，5′UTR）、7521 bp的開放閱讀框 （open reading frame，ORF）、170 bp的3′端非編碼區(qū) （3′untranslated region，3′UTR）、起始密碼子ATG、終止密碼子TAA和轉錄終止信號aataaa（圖3）?？谖r蛄Vg的開放閱讀框共編碼2506個氨基酸，用Prot-Param工具分析得到Vg成熟蛋白的相對分子質量為285 770，理論等電點p I為5.42。SignalP 4.1 Prediction在線預測結果顯示，口蝦蛄Vg蛋白含有一個長度為20個氨基酸的信號肽 （切割位點在Gla20和Asp21之間）。口蝦蛄Vg氨基酸序列中含有：1個類似于枯草蛋白酶的內切蛋白酶識別位點R-X-R/K-R（氨基酸序列位置為 728～731，RSKR），3個潛在的N-連接糖基化位點 （氨基酸序列位置分別為660、1837和2284），1個在無脊椎和脊椎動物卵黃蛋白原中都比較保守的KALGNVG基序 （氨基酸序列位置為484～490）。用Jpred 4在線預測口蝦蛄Vg蛋白質的二級結構，得出該蛋白由α-螺旋38.71％、延伸鏈21.71％、β-轉角8.26％、無規(guī)則卷曲31.32％組成。通過TMPRED在線軟件分析表明，口蝦蛄Vg為跨膜蛋白，含有兩種跨膜結構，分別為膜內到膜外結構 （6～20）和膜外到膜內結構 （2441～2458）。NCBI結構域預測分析結果顯示，口蝦蛄Vg蛋白含有4種結構域 （圖3），其中2種與已知功能結構域相似，分別為卵黃蛋白原N端結構域 （Vitellogenin_N，也被認為是脂蛋白氨基末端區(qū)域）和血管性血友病因子 （von Willebrand factor）D型結構域 （vWFD），其余2種分別為由β折疊形成的未知功能結構域 （domain of unknown function）DUF1943和與家蠶載脂蛋白 （apolipophorin）同源的未知功能結構域DUF1081。

注：A為5′RACE擴增產(chǎn)物電泳結果；B為3′RACE擴增產(chǎn)物電泳結果；C為中間片段擴增產(chǎn)物電泳結果。M為DL2000或DL10000 DNA Marker；1、2、3為目的產(chǎn)物Note：A，5′RACE amplified fragment；B，3′RACE amp lified fragment；C，Vg amplified fragment.M，DL2000 DNA Marker or DL10000 DNA Marker；1，2，3，PCR products of target fragments圖1　口蝦蛄Vg cDNA各部分擴增產(chǎn)物電泳結果Fig.1 Amplified fragments of Vg cDNA in mantis shrim p Oratosquilla oratoria

圖2　口蝦蛄卵黃蛋白原序列的克隆策略Fig.2 Clone strategy and schematic view of Vg inmantis shrim p Oratosquilla oratoria

2.2 口蝦蛄Vg氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進化分析

將推導得到的口蝦蛄Vg氨基酸序列運用NCBI在線工具BLASTP軟件進行同源性分析。結果表明，口足目口蝦蛄Vg氨基酸序列與十足目蝦蟹類的一致性為46％ ～52％，與脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda的一致性最大，為52％，與羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii、銹斑蟳 Charybdis feriata的一致性最低，均為46％（表2）。利用 MEGA 5.0軟件的NJ法構建系統(tǒng)進化樹，選擇歐洲大扇貝Pecten maximus Vg氨基酸序列作為外類群。結果表明，口足目與十足目Vg聚為一大簇，其中口蝦蛄Vg單獨為一分支，十足目蝦蟹類Vg聚為另一分支。十足目甲殼動物基本聚為四小簇：大螻蛄蝦與蟹類聚為一簇，鰲蝦類為一簇，長額蝦和真蝦類聚為一簇，對蝦類為一簇 （圖4）。

2.3 口蝦蛄Vg m RNA在不同組織及發(fā)育階段的表達

采用實時熒光定量PCR對口蝦蛄不同組織以及卵巢不同發(fā)育階段的Vg mRNA表達量進行了分析。分別以3個平行樣本反轉錄得到的混合cDNA作為模板，每個時期cDNA樣品分別做3個熒光定量Vg重復和3個β-actin重復，在溶解曲線結果為單峰以及目的基因和擴增曲線圖顯示目的基因和內參基因的擴增效率一致的基礎上，采用2-ΔΔCT法對其相對表達量 （分別以雄性蝦蛄的肝胰腺和Ⅰ期卵巢的Vg mRNA表達量作為參照，將其看作單位1）進行計算。結果表明，雌、雄口蝦蛄性腺和肝胰腺均有Vg mRNA表達，但肌肉中均不表達，卵巢中的Vg mRNA表達量顯著高于其他組織 （P＜0.05）（圖5）。此外，卵巢中Vg mRNA的相對表達量隨著卵巢的發(fā)育不斷增加，在成熟期的表達量是未發(fā)育期的158倍，與其他3個發(fā)育期相比差異均顯著 （P＜0.05）；而產(chǎn)卵后，卵巢處于消退期，Vg mRNA的相對表達量急劇下降，接近卵黃發(fā)生期的表達水平 （圖6）。

3 討論

3.1 口蝦蛄Vg基因的克隆及序列分析

本研究中首次克隆得到了口蝦蛄Vg cDNA全長序列，也是目前唯一進行研究的甲殼動物口足目種類的Vg?？寺〉玫降目谖r蛄Vg cDNA全長為7727 bp，共編碼2506個氨基酸，預測的成熟蛋白相對分子質量為285 770，與已報到的一些其他甲殼動物的肽鏈長度和分子量大小相近［10-11］。

注：預測的信號肽、潛在N-糖基化位點以下劃線標出；起始密碼子 （ATG）、類枯草蛋白內切酶位點RSKR和終止密碼子 （TAA）分別以方框標出；Vitellogenin-N結構域、未知功能結構域DUF1943與DUF1081、vWFD結構域、轉錄終止信號aataaa用陰影標出Note：The putative signal peptide and the potential N-linked glycocylation sites are underlined；the start codon（ATG），consensus cleavage site and stop codon（TAA）are shown in a box；Vitellogenin-N domain，domain ofunknown function DUF1943 and DUF1081，vWFD domain and polyadenylation site（aataaa）are shaded圖3　口蝦蛄Vg cDNA全長序列及其推導的氨基酸序列Fig.3 Full-length cDNA and deduced am ino acid sequence of Vg gene in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

圖4　口蝦蛄與其他甲殼動物Vg的NJ系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Vg in mantis shrimp Oratosquilla oratoria and other crustaceans

注：標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異 （P＜0.05），標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異 （P＞0.05），下同Note：Themeans with different letters are significant differences at the 0.05 probability level，and the means with the same letters are not significant differences，et sequentia圖5　雌、雄口蝦蛄不同組織中Vg mRNA的相對表達量Fig.5 Relative expression of Vg m RNA in differen t tissues of female and male mantis shrim p Oratosquilla oratoria

圖6　不同發(fā)育期口蝦蛄卵巢Vg m RNA的相對表達量Fig.6 Relative expression of Vg m RNA in ovary at different developmen tal stages in mantis shrim p Oratosquilla oratoria

表2　口蝦蛄與其他物種Vg氨基酸序列的同源性分析Tab.2 Comparative identity of Vg am ino acid sequence in mantis shrim p Oratosquilla oratoria w ith other species

生物信息學分析表明，口蝦蛄Vg為跨膜蛋白，有利于其膜內外營養(yǎng)物質的運輸，與其在卵黃發(fā)生期作為載體結合并運輸金屬離子、類胡蘿卜素、甲狀腺素、視黃醇、核黃素等生物學功能相關。口蝦蛄Vg氨基酸序列與其他甲殼動物具有很高的相似性，都存在一個非常保守的R-X-K/R-R剪切位點，它是一種類似枯草蛋白酶的內切蛋白酶識別位點，表明在此處口蝦蛄卵黃蛋白能被水解成兩個亞基，與Vg蛋白在機體的運輸、加工和修飾有關［12］。此外，在口蝦蛄 Vg蛋白的N端還發(fā)現(xiàn)一個在脊椎動物和無脊椎動物中都非常保守的KALGNVG序列，這段序列被認為在卵黃發(fā)生期間起著十分重要的作用，可能與卵母細胞的受體識別位點有關［13］。

對Vg蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄Vg氨基酸序列含有4種保守結構域，分別為Vitellogenin_ N、vWFD和兩種未知功能結構域 DUF1943與DUF1081。Vitellogenin_N參與蛋白質與脂質的轉運和金屬的貯存，廣泛存在于卵黃蛋白原、微體甘油三酸酯轉運蛋白和阿樸脂蛋白 B-100中［14］。vWFD結構域富含半胱氨酸，是一個高度結構化的區(qū)域，通過形成二硫鍵在寡聚體聚合過程中起到了重要作用，不僅是血液凝集因子Ⅷ結合到vWF的必需區(qū)域，也是vWF形成正常聚合所必需的［15］。Vitellogenin_N和vWFD保守結構域的存在，可確定Vg是一種脂轉運蛋白，Vg蛋白一般也只包含這兩種保守結構域。但是，在對貝類、甲殼動物的研究中又都發(fā)現(xiàn)了新的未知功能結構域［16-20］，且DUF1943和DUF1081這兩個區(qū)域只存在于甲殼動物及少數(shù)貝類當中，而關于他們的準確功能尚不清楚，說明Vg蛋白還有很多未被我們認知的其他生物學功能。本研究中還發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄Vg氨基酸序列與大部分甲殼動物和貝類相似，都缺乏多聚絲氨酸和卵黃高磷脂蛋白結構域［21-22］。卵黃高磷脂蛋白和多聚絲氨酸結構域是指含有前后排列、串聯(lián)在一起的多個絲氨酸殘基的特殊結構，被認為是昆蟲和大多數(shù)脊椎動物Vg蛋白的顯著特征，可能是酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點，這種特殊的結構域可能參與昆蟲受體介導的卵黃蛋白原進入卵母細胞的內吞過程［23-24］，而對于脊椎動物，它可能作為磷酸和金屬離子的載體與骨的形成有關［25］。本試驗結果表明，多聚絲氨酸和卵黃高磷脂蛋白結構域調控受體介導的方式不是口蝦蛄Vg進入卵母細胞的唯一方式，即口蝦蛄可能存在不同于昆蟲的其他卵黃蛋白原-受體識別結合機制，今后可就卵黃蛋白原受體分離鑒定及Vg蛋白-受體結合的內在機制進行深入地研究。

由甲殼動物卵黃蛋白原氨基酸序列得到的系統(tǒng)進化樹顯示，口蝦蛄Vg氨基酸序列與十足目蝦蟹類的Vg為同一簇下的2個分支，十足目蝦蟹類的Vg主要分為蝦類和蟹類兩個亞組。蝦類主要分為3個亞群：枝鰓亞目對蝦總科 （M.ensis、M.japonicus、P.monodon、L.vannamei、P.semisulcatus、F.chinensis、F.merguiensis）、真 蝦 下 目（P.japonica、P.hypsinotus、M.rosenbergii、E.carinicauda）、鰲蝦下目 （C.quadricarinatus、H.americanus）。蟹類中短尾下目 （P.trituberculatus、C.sapidus、S.paramamosain、C.feriatus、E.sinensis）和海蛄蝦下目（U.major）的Vg屬于一個亞組，這些物種Vg的進化關系與甲殼動物最新分類系統(tǒng)一致［26］?？谖r蛄Vg的系統(tǒng)演化與口蝦蛄酚氧化酶 （proPO）［27］、口蝦蛄高血糖激素 （CHH）［28］在甲殼動物中的聚類分析結果一致。

3.2 口蝦蛄Vg基因的表達分析

Vg的合成部位和合成機制一直是卵黃蛋白研究的重點和熱點。Vg的合成途徑有兩種類型：內源性合成和外源性合成。魚類、兩棲類、鳥類等大多數(shù)的脊椎動物為外源性合成方式，一般由肝臟合成，然后通過血液的循環(huán)運送到卵巢，卵母細胞通過細胞內吞等方式將其吞入細胞內，然后裂解為卵黃蛋白。無脊椎動物Vg的合成比較復雜，合成部位也不一致。對于甲殼動物來說合成部位有3種：肝胰腺、脂肪體和卵巢［29-31］。本試驗中分析了口蝦蛄Vg mRNA在不同組織及卵巢不同發(fā)育時期的表達模式。結果表明，雌性口蝦蛄卵巢和肝胰腺均有Vg mRNA表達，且卵巢中的表達量顯著高于肝胰腺，表明口蝦蛄的肝胰腺和卵巢都具有合成卵黃蛋白原的能力，并且主要合成部位可能在卵巢。在甲殼類中，對三疣梭子蟹 Portunus trituberculatus［32］、中華絨螯蟹Eriocheirsinensis［14］、青蟹Carcinusmaena［33］、小龍蝦 Cherax quadricarinatus［34］、墨吉對蝦 Penaeus merguiensis［35］、刀額新對蝦Metapenaeus ensis［36］、日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus［37］等種類的研究結果都與對口蝦蛄的研究結果一致，均在肝胰腺和卵巢中檢測到Vg基因的表達。絕大多數(shù)的研究表明，幼體和雄性中雖然也有卵黃蛋白原基因的存在，但只有雌性個體能表達該基因。有趣的是，本研究中在口蝦蛄精巢中也檢測到了Vg mRNA的表達，關于其原因目前尚不清楚。Unuma等［38］采用免疫組化和免疫印跡的方法檢測到海膽Pseudocentrotus depressus雌、雄個體的性腺中均有Vg基因的表達，并且隨著精巢的發(fā)育，其表達量逐漸減少，由此推斷，卵黃蛋白原可能作為精子發(fā)育的營養(yǎng)物質被利用。而對真海鞘Halocynthia roretzi的研究發(fā)現(xiàn)［39-40］，Vg蛋白的C端所含有的結構域vWFD和CT可能定位在卵黃被 （vitellin coat）與精子中的兩個酶 （HrProacrosin和HrSpermosin）結合，參與精子進入卵子的受精過程。因此，口蝦蛄Vg基因在精巢中的表達可能是作為精子發(fā)生的營養(yǎng)物質或者參與協(xié)助精子的受精過程?？谖r蛄Vg也與卵巢卵黃發(fā)育時期密切相關，卵黃蛋白原mRNA的表達量隨著卵巢的發(fā)育顯著增加，在消退期急劇減少。在卵巢發(fā)育過程中，卵巢需要為卵子的發(fā)生累積營養(yǎng)，卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體，不僅能將所需的金屬離子和其他營養(yǎng)物質運送到卵母細胞，同時卵黃蛋白原能自身水解為卵黃蛋白，在卵母細胞中累積，促使卵母細胞的生長和分化，為胚胎的發(fā)育提供碳水化合物、脂肪、氨基酸、維生素、磷、硫等營養(yǎng)素和功能性物質，所以在發(fā)育過程中卵黃蛋白原表達積極；進入成熟期，卵母細胞中卵黃累積達到最大；當卵巢排卵后，性腺停止發(fā)育，此時新的卵母細胞還沒開始合成，卵黃蛋白原的表達量很低?？谖r蛄卵巢中卵黃蛋白原mRNA相對表達量的變化趨勢與對其他甲殼類的研究結果一致［41］。今后的試驗可就卵黃蛋白原的合成機制進行研究，從而為口蝦蛄的人工繁育和資源保護奠定理論基礎。

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Vitellogenin（Vg）gene in mantis shrim p Oratosquilla oratoria

LIU Hai-ying1，2，ZHANG Na1，2，YAN Hong-wei3，LIU Qi1，2，XING Kun1，2，CHEN Lei1，2，SUIYou-zhen4，LIN Yuan5，LICheng-jiu5，GUO Liang-yong5
（1.Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；3.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；4.InstituteofOcean Fisheries，Zhoushan 316021，China；5.Fisheries Seedlings Authority of Liaoning Province，Dalian 116015，China）

Abstract：In the present study，the full length cDNA of vitellogenin（Vg）gene was cloned in mantis shrimp Oratosquilla oratoria using rapid amplification of cDNA ends（RACE）（GenBank accession No.KR422400），and expression levels of Vg genemRNA in various tissues，especially in ovary within differentovarian development stages，were investigated by qPCR.The results showed that the Vg gene was 7727 bp long，with 36 bp of 5′untranslated region（UTR），170 bp of 3′UTR and 7521 bp of the coding region encoding a size of 2506 amino acids predicted protein.The predicted protein contained a signal peptide（20 amino acids long），three N-glycosylation site，a consensus cleavage site RSKR and a conserved KALGNVG motif thatwas conservative in invertebrates and vertebrate. Moreover，there were 4 conserved domains，Vitellogenin_N，vWFD，DUF1943 and DUF1081，in the predicted protein.The deduced amino acids sequence showed 46％-52％identity with other known decapods Vg by using BLASTP online analysis.Phylogenetic tree rvealed that the Vg formed a clade separated from the decapod species Vg.The qPCR indicated that the Vg mRNA were found in both gonad and hepatopancreas，and had significantly higher expression level of Vg mRNA in ovary than in other tissues（P＜0.05），withoutexpression inmuscle.In the ovary，however，the expression of Vg mRNA was found to be significantly increased from immature stage tomature stage（P＜0.05），then dropped immediately（P＜0.05）.The expression profile in ovary wellwas responding to the annual cycle of vitellogenesis.The findingswill provide basic information for understanding of thewhole function of Vg gene in themantis shrimp.

Key words：Oratosquilla oratoria；vitellogenin（Vg）；molecular cloning；quantitative PCR；expression pattern

中圖分類號：S917.4；S966.1

文獻標志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.003

文章編號：2095-1388（2016）02-0131-09

收稿日期：2015-05-06

基金項目：遼寧省教育廳一般項目 （L2015083）；遼寧省科學技術計劃項目 （2014203016）；農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題（2014-MSENC-KF-14）；大連海洋大學博士啟動基金資助項目 （2014017349）

作者簡介：劉海映 （1957—），男，教授。E-mail：hyliu@dlou.edu.cn

通信作者：閆紅偉 （1985—），女，博士。E-mail：yanhongwei@dlou.edu.cn