煙草中溴菌腈農藥殘留檢測方法及消解動態(tài)

周楊全，徐光軍，徐金麗，張紀利，蘇 贊，王 鵬，李明光，鄧東強，胡亞杰*

（1.中國農業(yè)科學院煙草研究所，國家煙草專賣局病蟲害監(jiān)控與綜防重點實驗室，青島 266101；2.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，南寧 530001；3.山東青島煙草有限公司，青島 266000）

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煙草中溴菌腈農藥殘留檢測方法及消解動態(tài)

周楊全1，徐光軍1，徐金麗1，張紀利2，蘇 贊2，王 鵬3，李明光3，鄧東強3，胡亞杰2*

（1.中國農業(yè)科學院煙草研究所，國家煙草專賣局病蟲害監(jiān)控與綜防重點實驗室，青島 266101；2.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，南寧 530001；3.山東青島煙草有限公司，青島 266000）

摘 要：為摸清溴菌腈在煙草中的農藥殘留消解動態(tài)規(guī)律及殘留特征，建立了QuEchERS前處理和氣相色譜-串聯質譜（GCMS/MS）檢測相結合的煙葉中溴菌腈殘留量的分析方法。煙葉經乙腈提取，N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）凈化，氣相色譜-串聯質譜法檢測。結果表明，在 0.01～1.0 mg/kg 3個添加水平下，溴菌腈在鮮煙葉和干煙葉中的平均回收率分別為85.8%～94.5%、83.2%～110.0%，相對標準偏差（RSD）分別為1.4%～10.6%、7.3%～14.1%，定量限（LOQ）均為0.01 mg/kg。利用山東和湖南2年2地的溴菌腈在煙葉中農藥殘留田間試驗樣品進行了深入研究，溴菌腈在煙葉中的半衰期7.8～14.9 d；按照162 g.a.i./hm2和243 g.a.i./hm2劑量，分別灌根施藥1～2次，末次施藥14 d后，溴菌腈在煙葉樣品中的最終殘留量為0.010～0.13 mg/kg。根據煙草青枯病發(fā)病條件、發(fā)病時期、農藥在煙葉中使用情況及OECD農藥殘留限量計算結果，建議溴菌腈在煙葉中殘留限量為0.2 mg/kg，安全間隔期為14 d。

關鍵詞：溴菌腈；煙草；殘留；QuEChERS；氣相色譜-串聯質譜

溴菌腈（bromothalonil）是一種廣譜、高效、低毒的內吸性殺菌劑，能抑制和鏟除真菌、細菌、藻類的生長，對農作物多種真菌性、細菌性病害［1-5］以及煙草青枯病具有較好的防治效果。研究溴菌腈在煙草中的農藥殘留消解動態(tài)及殘留特征，可以為制定溴菌腈在煙草上的合理用量和殘留限量提供科學依據。劉偉等［6］、劉慧群［7］建立了氣相色譜法檢測溴菌腈在蘋果、黃瓜及土壤中殘留量方法并研究了殘留降解規(guī)律。目前，國內外尚無該農藥在煙草上降解規(guī)律和殘留特征的研究報道。近年來，QuEChERS技術作為液液萃取和固相萃取的替代前處理方法，已經成功應用于多種有機物的提取和凈化［8-11］，在煙葉農藥殘留的前處理過程中的應用也較為廣泛［12-13］。本研究建立了QuEChERS提取凈化，GC-MS/MS檢測煙草中溴菌腈農藥殘留量的方法，并對山東和湖南GAP試驗條件下，煙葉中溴菌腈農藥殘留量和消解動態(tài)進行了檢測和研究，對該農藥安全使用提出建議。

1　材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-串聯三重四極桿質譜（TSQ QUANTUM XLS，德國Thermo fisher公司）；千分之一電子天平（SHIMADZU-UW 420 H，日本Shimadzu公司）；萬分之一電子天平（ER-182 A，日本Tykyo公司））；超聲波振蕩機（RSQ-60 AS，寧波榮順）；回旋式振蕩器（BLUD PARD WSZ-200 A，上海藍豹）；旋轉蒸發(fā)儀（HEIDOLPHADVANTAGE，德國海道爾夫）。

95%溴菌腈標準品（美國Sigma-Aldrich公司）；25%溴菌腈·壬菌銅微乳劑（溴菌腈含量為 20%，濰坊萬勝生物農藥有限公司）；乙腈（色譜純，99.9%，德國默克股份兩合公司）；丙酮（99.5%，煙臺三和化學試劑有限公司）；無水硫酸鎂（98.0%，國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鈉（99.5%，西隴化工股份有限公司）；檸檬酸鈉（99.0%，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸氫二鈉（99.0%，國藥集團化學試劑有限公司）；N-丙基乙二胺吸附劑（99.5%，天津市天興達科技有限公司）。

1.2 田間試驗

分別于2012—2013年在山東青島（土壤為砂性棕壤，pH值為6.4，有機質含量1.79%，中等肥力）、湖南長沙（土壤為紅壤，pH為5.9，有機質含量1.56%，中等肥力）進行了田間試驗，供試煙草品種為NC89（山東）和云煙87（湖南），整個田間生產過程符合當地GAP生產要求。試驗農藥為 25%溴菌腈·壬菌銅微乳劑（溴菌腈含量為20%）。農藥登記資料顯示，該農藥防治煙草青枯病，總用量為112.5～202.5 g.a.i./hm2（溴菌腈用量90～162 g.a.i./hm2），施藥方式為灌根，次數為1次。按《農藥殘留試驗準則》［14］要求，設置 243 g.a.i./hm21次施藥，243 g.a.i./hm22次施藥，162 g.a.i./hm21次施藥，162 g a.i./hm22次施藥共4個最終殘留量試驗及1個消解動態(tài)試驗，合計5個處理區(qū)。每小區(qū)面積30 m2，重復3次，隨機排列，小區(qū)間設保護帶，另設對照小區(qū)。

1.2.1 農藥殘留消解動態(tài)試驗 旺長后期施藥，按照溴菌腈用量243 g.a.i./hm2，用水量900 L/hm2，葉面均勻噴霧。施藥后1 h，1、3、5、7、14、21、28、35、42 d采樣。在試驗小區(qū)內隨機采集1 kg生長正常、無病害煙葉，切碎、混勻，四分法留樣200 g，-20 ℃保存，待測。

1.2.2 煙葉最終殘留量試驗 4個處理區(qū)灌根施藥，每株藥液量50 mL，最后一次施藥后7、14、21 d，隨機采集煙葉樣品不少于100片，三段式烘烤工藝烘烤，粉碎、縮分后取200 g，-20 ℃保存。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品的提取與凈化 提?。悍Q取鮮煙葉樣品5.0 g（或干煙葉樣品2.0 g，加2 mL蒸餾水，輕搖使樣品潤濕，靜置5 min）于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL乙腈，于漩渦混合振蕩器上振蕩提取1 min，加入4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，立即于漩渦混合振蕩儀振蕩2 min，防止無水硫酸鎂結塊，然后以4000 r/min離心10 min。凈化：移取1.5 mL上清液于2 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂和25 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，于漩渦混合振蕩儀上漩渦振蕩2 min，以13000 r/min離心5 min，吸取上清液1.0 mL，濃縮近干，加入1 mL正己烷/丙酮（V∶V，7∶3）溶解，待測。

1.3.2 儀器條件 色譜柱：HP-5 MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）；載氣：氦氣 （ 純度99.999%）；恒流模式：流速1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；柱溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持3 min；進樣量：1 μL。

質譜條件：離子源溫度：250 ℃；保留時間：5.4 min，定性離子對（m/z）：106.0/66.1，106.0/79.1；定量離子對（m/z）：106.0/66.1；碰撞能量：10 ev。

1.3.3 標準曲線的繪制 100 mg/L的溴菌腈標準溶液逐級稀釋，得到濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列工作標準溶液，在上述儀器條件下測定，以溴菌腈進樣量（mg/L）為橫坐標，對應色譜測定峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 添加回收率試驗 分別在空白鮮煙葉、干煙葉中添加0.01、0.2和1.0 mg/kg濃度的溴菌腈標準溶液，按照1.3.1和1.3.2的方法提取、凈化、檢測。每個水平重復5次，同時設空白對照。

1.3.5 數據分析 采用 SPSS 22.0進行單因變量多自變量隨機區(qū)組分析。

2　結果

2.1 檢測條件的優(yōu)化

柱箱初始溫度與最終溫度及持續(xù)時間，是影響溴菌腈出峰時間的重要因素，通過優(yōu)化試驗，選定條件為：初始溫度50 ℃，保持1 min，最終溫度280 ℃，保持3 min。在選定的氣相色譜條件下，采用全掃描（SCAN）方式檢測，對溴菌腈進行定性分析，并選擇特征檢測離子對106.0/66.1和106.0/79.1。之后選擇SIM掃描方式，對其進行定量分析，發(fā)現特征檢測離子對 106.0/66.1的檢測靈敏度高，選擇性好，定量準確。

2.2 方法的線性范圍與檢出限

在0.01～5.0 mg/L范圍內，溴菌腈峰面積與質量濃度間呈良好的線性關系，方程為Y=11530369X-96331（鮮葉）、Y=12661040X+77811（干葉），相關系數均為r=1.0。

根據添加回收率試驗，在選定的樣品前處理方法和檢測條件下，溴菌腈在干煙葉和鮮煙葉中的定量限（LOQ）均為0.01 mg/kg。

2.3 方法的準確度及精密度

在鮮煙葉和干煙葉中分別添加0.01、0.2、1.0 mg/kg 3個水平，結果見表1。在0.01～1.0 mg/kg的添加水平下，溴菌腈在鮮煙葉樣品中的平均回收率為 85.8%～94.5%，相對標準偏差（RSD）為1.4%～10.6%；在干煙葉樣品中的平均回收率為83.2%～110.0%，相對標準偏差（RSD）7.3%～14.1%，均符合農藥殘留試驗準則中對殘留檢測方法的要求［15］，可以用于實際樣品的分析與檢測。

表1　溴菌腈在煙葉中的添加回收率及相對標準偏差Table 1 Average recovery and relative standard deviation of bromothalonil in fresh and cured tobacco leaves

2.4 溴菌腈在煙葉中的消解動態(tài)和最終殘留

2.4.1 溴菌腈在煙葉中的消解動態(tài) 由圖1看出，溴菌腈在植株中的原始沉積量分別為 0.088～0.84 mg/kg，當1 d和3 d時，溴菌腈在煙葉中的消解率超過50%；28 d和35 d時，消解率超過90%。不同試驗地點品種、氣候、煙株長勢等條件的影響，煙葉中農藥殘留降解有一定差異。

動力學方程擬合結果（表2）表明，溴菌腈在煙葉的消解符合一級動力學特征。煙葉中溴菌腈的半衰期為7.8～14.9 d。

2.4.2 溴菌腈在煙葉中的最終殘留 山東、湖南2 年2地試驗結果表明（表3），末次施藥7 d，14 d 后2年2地溴菌腈的最終殘留量均為0.010～0.13 mg/kg；21 d后 2年 2地溴菌腈的最終殘留量＜LOQ～0.078 mg/kg。

2.5 施藥因子對煙葉中溴菌腈殘留量的影響

由表4看出，施藥次數對農藥殘留量呈顯著相關關系，施藥劑量和采收間隔對殘留量相關性影響不顯著。

表2　溴菌腈在煙葉中的消解動力學方程及其相關系數Table 2 Residue dissipation of bromothalonil in fresh tobacco leaves

圖1　溴菌腈在煙葉中的殘留消解動態(tài)Fig. 1 Residue dissipation of bromothalonil in cured tobacco leaves

表3　溴菌腈在干煙葉中的最終殘留量 mg/kgTable 3 The terminal residue of bromothalonil in cured tobacco leaves

表4　施藥因子對殘留量影響隨機區(qū)組分析Table 4 Composite factors randomized block analysis of pesticide residue

3　討論

本研究建立了以QuEchERS前處理方法提取凈化、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）檢測煙草中溴菌腈農藥殘留的方法。與文獻報道的該農藥在其他農作物的農藥殘留方法相比［6-7］，操作簡單，省時省力，有機溶劑使用少，經濟成本低。

由溴菌腈在煙葉中的殘留消解動態(tài)可以看出，該農藥降解較快，不同試驗地點和試驗年度，煙葉中農藥殘留降解速率差別較大。王秀國等［16］認為，內吸性殺菌劑施用后會很快被吸收到煙草植株體內，煙草植株本身的生長發(fā)育及生理生化特性會影響其對內吸性殺菌劑的吸收傳導。此外，大田試驗期間溫度、降雨和光照等因素均會影響溴菌腈在煙葉中的殘留消解趨勢。施藥期間，煙葉質量和體積均迅速增長，對降低煙葉農藥殘留方面也有一定的作用［17］。

由溴菌腈在干煙葉中的最終殘留量及影響因素可以看出，灌根施藥后，溴菌腈在煙葉中殘留量較低，且殘留量與采收間隔期和施藥次數顯著相關，采收間隔期越長，殘留量越低，施藥次數越多，殘留量越高。在煙葉生產中，青枯病大多為成株期發(fā)病，施用此農藥可以保證煙葉安全水平，由于施藥次數和安全間隔期對農藥殘留量有顯著影響，宜采用推遲采收時間的措施控制農藥殘留量，發(fā)病嚴重的區(qū)域可以適當增加農藥施用劑量，對煙葉農藥殘留量影響較小。

我國和CORESTA都未制定溴菌腈在煙草中最大殘留限量（MRL），根據7、14、21 d農藥殘留數據結果，經OECD農藥殘留限量計算器計算，7、14 d時MRL值均為0.2 mg/kg，21 d時MRL 為0.15 mg/kg。根據煙草青枯病發(fā)病條件、發(fā)病時期和農藥在煙葉中使用情況，建議溴菌腈在煙葉中殘留限量為0.2 mg/kg，安全間隔期為14 d。

4　結論

建立了QuEchERS前處理和氣相色譜-串聯質譜相結合的煙葉中溴菌腈殘留量的分析方法，該方法凈化效果好，方法檢出限、精密性、準確度均符合農藥殘留分析方法要求。

根據農藥殘留試驗數據和病害發(fā)病特征，使用25%溴菌腈·壬菌銅微乳劑防治煙草青枯病，在發(fā)病初期，溴菌腈用量90～162 g.a.i./hm2灌根施藥1次。建議溴菌腈在煙葉中殘留限量為0.2 mg/kg，安全間隔期為14 d。

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Residue Analysis and Dissipation of Bromothalonil in Tobacco

ZHOU Yangquan1，XU Guangjun1，XU Jinli1，ZHANG Jili2，SU Zan2，WANG Peng3，LI Mingguang3，DENG Dongqiang3，HU Yajie2*
（1. Tobacco Research Institute of CAAS，Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring Controlling & Integrated Management，Qingdao 266101，China；2. China Tobacco Guangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanning 530001，China；3. China Tobacco Shandong Qingdao Co.，Ltd.，Qingdao 266000，China）

Abstract:To study residue and dissipation of bromothalonil in tobacco，a modified QuEChERS combined with gas chromatography triple quadrupole-tandem mass-spectrometry （GC-MS/MS） liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed. Samples were extracted with acetonitrile，cleaned up with primary secondary amine （PSA），and then determined with GC-MS/MS. The results showed that the average recoveries of bromothalonil were 85.8%-94.5% and 83.2%-110.0%，with relative standard deviations （RSDs） of 1.4%-10.6% and 7.3%-14.1% in fresh and cured tobacco leaves，respectively. The limit of quantification （LOQ） of this method was 0.01 mg/kg for both fresh and cured tobacco leaves. The dissipation and terminal residues were investigated in Qingdao and Changsha，China from 2012 to 2013. The dynamic results showed that the half-life of bromothalonil in fresh tobacco leaves was 7.8-14.9 d. The terminal residues of bromothalonil in cured tobacco leaves were determined after the first and second application at levels of 162 g.a.i/hm-2and 243 g.a.i/hm-2. The terminal residues were 0.010-0.13 mg/kg 14 days after the last application in cured tobacco leaves. Based on the tobacco bacterial wilt incidence conditions，the incidence period，the use of pesticides in tobacco and OECD MRL calculator findings，we recommend the residue limit of bromothalonil in tobacco leaves of 0.2 mg/kg，and the safety interval of 14 d.

Keywords:bromothalonil；tobacco；residue；QuEChERS；gas chromatography-tandem mass-spectrometry

中圖分類號：S345.72

文章編號：1007-5119（2016）01-0067-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.012

基金項目：廣西中煙工業(yè)有限責任公司項目“廣西中煙原料質量安全評價體系建設與應用”（GXZX-2014-02）

作者簡介：周楊全，男，碩士研究生，研究方向為煙草植物保護。E-mail：zhouyangquan0413@163.com。*通信作者，E-mail∶ 312665054@qq.com

收稿日期：2015-07-27 修回日期：2016-01-2