超聲波-生物酶法提取鎖陽(yáng)多糖工藝優(yōu)化及其抗腫瘤活性

張慧瑛，羅光宏*，郝軍元，楊生輝，崔 偉，張 杰（.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖　734000；.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，甘肅 張掖　734000）

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超聲波-生物酶法提取鎖陽(yáng)多糖工藝優(yōu)化及其抗腫瘤活性

張慧瑛1，羅光宏2,*，郝軍元1，楊生輝2，崔 偉1，張 杰1
（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖734000；2.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，甘肅 張掖734000）

摘 要：為了獲得較高的鎖陽(yáng)多糖得率，以河西鎖陽(yáng)為原料，采用超聲波協(xié)同生物酶技術(shù)進(jìn)行鎖陽(yáng)多糖提取工藝及活性的研究，選用單因素試驗(yàn)探索料液比、超聲時(shí)間、超聲功率及纖維素酶加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值對(duì)鎖陽(yáng)多糖得率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用四甲基噻唑藍(lán)（methlthiazoletrazolium，MTT）法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)多糖對(duì)HeLa細(xì)胞的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，鎖陽(yáng)多糖超聲波-纖維素酶法提取最佳工藝為：料液比1∶10（g/mL）、超聲功率300 W、酶解溫度60 ℃、超聲時(shí)間10 min、加酶量1.8%、酶解時(shí)間90 min、pH 5.5。最優(yōu)條件下鎖陽(yáng)多糖得率達(dá)3.01%。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取多糖對(duì)HeLa細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤活性。

關(guān)鍵詞：鎖陽(yáng)；多糖；提取；超聲波-纖維素酶；生物活性

引文格式：

張慧瑛, 羅光宏, 郝軍元, 等. 超聲波-生物酶法提取鎖陽(yáng)多糖工藝優(yōu)化及其抗腫瘤活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 59-64. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612010. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Huiying, LUO Guanghong, HAO Junyuan, et al. Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic extraction of polysaccharides from Cynomorium songaricum and their antitumor activity[J]. Food Science, 2016, 37(12): 59-64. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612010. http://www.spkx.net.cn

鎖陽(yáng)（Cynomorium songaricum）為鎖陽(yáng)科鎖陽(yáng)屬多年生肉質(zhì)寄生草本植物[1]。作為中蒙藥中的常用藥[1-2]，古代中醫(yī)用鎖陽(yáng)的干燥莖治療陽(yáng)痿精虛，陰衰血竭，老年氣弱陰虛等癥[3-5]。近年研究[3-6]表明，鎖陽(yáng)富含多種化學(xué)成分及藥用成分，包括黃酮類、甾體類、三萜類、氨基酸、熊果酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、胡蘿卜苷、鞣質(zhì)、多糖和無(wú)機(jī)離子等。其中鎖陽(yáng)多糖具有抗腫瘤、降低血糖、抗輻射、調(diào)節(jié)血脂以及促進(jìn)細(xì)胞再生和新陳代謝、增強(qiáng)免 疫調(diào)節(jié)能力的功效[6-7]；傳統(tǒng)方法中將其用于釀酒和制作飼料[7]，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，鎖陽(yáng)多糖提取工藝條件的建立及有效利用是急需解決的問(wèn)題。

目前，鎖陽(yáng)多糖的提取方法主要有大孔樹(shù)脂吸附法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界提取法等[8-9]。超聲破碎是利用超聲波振動(dòng)傳遞能量，改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能或加速這些改變過(guò)程，從而提高多糖得率，縮短提取時(shí)間，降低提取液黏度。生物酶技術(shù)是一種新型高效綠色提取技術(shù)，具有快速、高效、反應(yīng)溫和、專一性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)[10]，其中纖維素酶能特異性降解纖維素[11]。超聲破碎和纖維素酶酶解相結(jié)合可高效破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)多糖最大限度地溶出。因此，本研究選用河西鎖陽(yáng)為原料，利用生物酶技術(shù)對(duì)鎖陽(yáng)多糖的提取活性進(jìn)行了研究，旨在為鎖陽(yáng)資源的合理利用及其多糖提取物在抗腫瘤方面的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鎖陽(yáng)甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心。

HeLa細(xì)胞中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、95%乙醇溶液、無(wú)支原體的胎牛血清、青霉素、鏈霉素、RPMI Medium 1640、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、N-2羥乙基哌嗪N-2-乙烷磺酸（E.M.K進(jìn)口分裝）、四甲基噻唑藍(lán)（methlthiazoletrazolium，MTT）均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

722型紫外分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；800型離心機(jī)上海手術(shù)器械廠；電熱恒溫水浴鍋北京長(zhǎng)遠(yuǎn)設(shè)備廠；BDS 300型倒置顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；RT-6000型酶標(biāo)分析儀美國(guó)雷社公司；5510型CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Nuaire公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板康寧生物有限公司；微孔濾膜天津東康科技有限公司；SB-JS-1型超凈工作臺(tái)上海醫(yī)療設(shè)備廠；3110型微量加樣器德國(guó)愛(ài)本德公司；YXQ-CS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊公司；HH.GF-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱長(zhǎng)沙醫(yī)療器械廠；AP-9925型無(wú)油真空泵天津奧特公司；AL104型電子分析天平梅特勒-托利多儀器公司；血球計(jì)數(shù)板上海醫(yī)科大學(xué)；D7411型超純水系統(tǒng) 美國(guó)BT公司。

1.3方法

1.3.1鎖陽(yáng)粗多糖提取工藝流程[12-13]

鎖陽(yáng)研碎→稱取鎖陽(yáng)粉末10 g→加去離子水→纖維素酶處理→55 ℃條件下超聲提取→離心取上清液→脫蛋白（Sevag法）3 次→離心取上清液→95%乙醇溶液沉淀→4 ℃靜置12 h→離心收集沉淀→干燥→鎖陽(yáng)粗多糖

1.3.2多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算

采用苯酚-硫酸比色法[14]測(cè)定多糖含量。精確稱取20 mg自制鎖陽(yáng)粗多糖，用少量50 ℃水完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL。吸0.5 mL多糖溶液加1.5 mL的蒸餾水，再加入5%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL；室溫靜置20 min后于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度。將所測(cè)吸光度代入回歸方程，得多糖相當(dāng)于葡萄糖含量[15]。多糖得率計(jì)算如式（1）所示：

式中：m為多糖液從回歸方程求得的多糖相當(dāng)于葡萄糖的含量/mg；D為稀釋倍數(shù)；F為鎖陽(yáng)多糖相對(duì)葡萄糖的換算因子，2.478；M0為鎖陽(yáng)干粉質(zhì)量/mg。

1.3.3超聲破碎單因素試驗(yàn)

按提取流程，固定纖維素酶處理工藝（加酶量2.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間90 min、酶作用pH 6.0），分別考察超聲功率（100、200、300、400、500 W）、超聲時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL）對(duì)鎖陽(yáng)多糖得率的影響。

1.3.4纖維素酶酶解單因素試驗(yàn)

按提取流程，固定超聲破碎條件，考察纖維素酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解溫度（25、35、45、55、65 ℃）、酶解時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、酶解pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對(duì)鎖陽(yáng)多糖得率的影響。

1.3.5鎖陽(yáng)多糖提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定鎖陽(yáng)多糖提取的正交試驗(yàn)因素和水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化多糖提取工藝，重復(fù)3 次。以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證及方差分析，P＜0.05表示影響顯著。因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　超聲波-纖維素酶法正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design for the optimization of extraction parameters

1.3.6鎖陽(yáng)多糖的制備

準(zhǔn)確稱取各種方法提取干燥的鎖陽(yáng)粗多糖提取物粉末，加無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基溶解至質(zhì)量濃度為800 μg/mL，膜過(guò)濾除菌，作為高質(zhì)量濃度多糖母液[13]放于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的HeLa細(xì)胞，迅速放入40 ℃水浴中解凍并不斷輕輕搖動(dòng)，使凍存管中的凍存物在1 min之內(nèi)融化。取出凍存管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗一次，1 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，吸到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入4 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞豐度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)。

1.3.8MTT法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)多糖對(duì)HeLa細(xì)胞的抗腫瘤活性[16-17]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量濃度5×104個(gè)/mL接種于96 孔板（平底），每孔100 μL，同時(shí)設(shè)只加培養(yǎng)基的空白調(diào)零孔3 個(gè)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入質(zhì)量濃度800 μg/mL的鎖陽(yáng)多糖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別接種3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72、96、120、144 h。采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞抑制率測(cè)定。測(cè)定過(guò)程為：終止實(shí)驗(yàn)前4 h每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加DMSO 100 μL，輕輕振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按式（2）計(jì)算多糖對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：

1.3.9Gimesa染色觀察細(xì)胞形態(tài)

各實(shí)驗(yàn)組HeLa細(xì)胞分別加入800 μg/mL不同提取方法的鎖陽(yáng)多糖，繼續(xù)培養(yǎng)72、96、120、144 h后，除細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，甲醇固定10 min，滴入Gimesa染色液1～2 滴，染色15 min，用自來(lái)水沖去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光學(xué)樹(shù)脂膠封固。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，比較各種方法提取的鎖陽(yáng)多糖對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲破碎單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)多糖得率的影響

由圖1可知，控制超聲作用時(shí)超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時(shí)，多糖得率隨著溶劑用量的增大而增大，料液比在1∶5～1∶10之間呈現(xiàn)了明顯的增大趨勢(shì)，1∶10之后多糖得率趨于平緩，因溶劑用量達(dá)到一定程度時(shí)，游離態(tài)的多糖已基本全部溶出，再增加溶劑用量，得率變化不大，還會(huì)增加后續(xù)工作困難。

圖1　料液比對(duì)多糖得率的影響Fig. 1　Effect of miterial-to-liquid ratio on polysaccharides yield

2.1.2超聲功率對(duì)多糖得率的影響

圖2　超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig. 2　Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

由圖2可知，控制超聲作用料液比1∶10、超聲時(shí)間15 min，超聲功率為100、200、300、400、500 W時(shí)，多糖得率隨著超聲功率的增大而增大，當(dāng)超聲功率在100～300 W之間時(shí)呈現(xiàn)明顯的增大趨勢(shì)，大于300 W多糖得率趨于穩(wěn)定，分析其原因是由于隨著功率的增大，產(chǎn)生大的沖擊波、剪切力使細(xì)胞破碎，多糖溶出率增加，當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，多糖得率曲線上升幅度趨于平緩，考慮到實(shí)際情況，功率過(guò)大需要的能耗大，同時(shí)也會(huì)使超聲時(shí)的溫度升高或破壞多糖結(jié)構(gòu)。

2.1.3超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖3　超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig. 3　Effect of ultrasonic treatment time on polysaccharides yield

由圖3可知，控制超聲作用時(shí)料液比1∶10、超聲功率300 W，超聲時(shí)間為5、10、15、20、25 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率先增加后減小，在超聲時(shí)間為10 min時(shí)有最大多糖得率，之后開(kāi)始下降。這是由于過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲波劇烈振動(dòng)會(huì)使多糖降解，從而使多糖提取量下降[18]。

2.2纖維素酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1加酶量對(duì)多糖得率的影響

圖4　加酶量對(duì)多糖得率的影響Fig. 4　Effect of enzymatic quantities on polysaccharides yield

由圖4可知，控制纖維素酶作用pH 6.0、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度45 ℃，加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在加酶量小于2.0%時(shí)，多糖得率隨加酶量的增大迅速升高，當(dāng)酶量增大至2.0%后多糖得率基本保持不變。

2.2.2酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

圖5　酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig. 5　Effect of hydrolysis temperature on polysaccharides yield

由圖5可知，控制纖維素酶加酶量2.0%、酶解pH 6.0、酶解時(shí)間90 min，酶解溫度分別為25、35、45、55、65 ℃，當(dāng)酶解溫度從25 ℃升高到55 ℃時(shí)，多糖得率隨著酶解溫度的升高而增大，在55 ℃時(shí)達(dá)到最大值，在60 ℃時(shí)又降低。這是由于酶本身也是一種蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高時(shí)會(huì)因變性而失去活性，導(dǎo)致多糖得率降低。

2.2.3酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

圖6　酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig. 6　Effect of hydrolysis time on polysaccharides yield

由圖6可知，控制加酶量2.0%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 6.0，酶解時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min，當(dāng)酶解時(shí)間在30～90 min范圍內(nèi)時(shí)，多糖得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在90 min時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)90 min時(shí)，多糖得率反而減小，說(shuō)明延長(zhǎng)酶解時(shí)間可以使纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁中的纖維素物質(zhì)充分酶解，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶的催化活性降低，進(jìn)而對(duì)多糖得率影響不大。

2.2.4酶解pH值對(duì)多糖得率的影響

圖7　酶解pH值對(duì)多糖得率的影響Fig. 7　Effect of initial pH values on polysaccharides yield

由圖7可知，控制加酶量2.0%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間90 min，酶解pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，pH值在5.0～6.5之間時(shí)，多糖得率隨著pH值的升高而升高，pH值大于6.5時(shí)出現(xiàn)細(xì)微的降低，這是由于pH值的變化可以改變酶的空間構(gòu)象而引起酶活性的降低，酶對(duì)pH值比較敏感，而纖維素酶在弱酸條件下酶活較高，自身穩(wěn)定性好，因此選擇纖維素酶最適作用pH 5.5。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以鎖陽(yáng)多糖得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)直觀分析和極差分析得到最優(yōu)組合，確定鎖陽(yáng)多糖的最優(yōu)提取工藝條件。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　L9(34) orthogonal array design with experimental results

表3　正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

由表2、3可知，各因素對(duì)多糖得率的影響依次為，超聲功率＞酶解溫度＞超聲時(shí)間＞加酶量，且超聲功率、超聲時(shí)間、酶解溫度對(duì)多糖得率的影響顯著，最優(yōu)工藝為A2B2C3D1，因此選擇超聲功率300 W、酶解溫度60 ℃、超聲時(shí)間10 min、加酶量1.8%，該條件下多糖得率為3.01%。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠程度，選擇料液比1∶10、超聲功率300 W、酶解溫度60 ℃、超聲時(shí)間10 min、加酶量1.8%，酶解時(shí)間90 min、酶解pH 5.5進(jìn)行多糖的提取實(shí)驗(yàn)，重復(fù)6 次，多糖得率分別為2.96%、2.87%、3.18%、2.89%、3.16%、3.12%，結(jié)果可靠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

1）進(jìn)一步優(yōu)化和完善系統(tǒng)設(shè)計(jì)。根據(jù)系統(tǒng)試用發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)收集格式、數(shù)據(jù)兼容性等問(wèn)題，聯(lián)合系統(tǒng)研發(fā)公司一起制訂優(yōu)化方案。例如：對(duì)于原始數(shù)據(jù)庫(kù)中的項(xiàng)目不能進(jìn)行在線中期檢查和結(jié)題申請(qǐng)的問(wèn)題，將對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，達(dá)到兼容的目標(biāo)；對(duì)于數(shù)據(jù)采集中存在的非格式化數(shù)據(jù)，重新進(jìn)行賦值定義，做好備注，引導(dǎo)項(xiàng)目申報(bào)者完成數(shù)據(jù)錄入各項(xiàng)工作。

2.5鎖陽(yáng)多糖提取方法的比較

圖8　鎖陽(yáng)多糖不同提取方法的提取效果比較Fig. 8　Comparison of the extraction efficiencies of different extraction methods

由圖8可知，傳統(tǒng)的水提醇沉法提取鎖陽(yáng)多糖得率為0.87%，超聲法提取鎖陽(yáng)多糖得率為1.72%，單一纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖得率為2.58%，而超聲波-纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖得率為3.01%。結(jié)果表明超聲波-纖維素酶法可顯著提高鎖陽(yáng)多糖得率。

2.6MTT法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤活性

鎖陽(yáng)多糖質(zhì)量濃度為800 μg/mL，分別作用HeLa細(xì)胞72、96、120、144 h，各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)細(xì)胞抑制率如表4所示。

由表4可知，在鎖陽(yáng)多糖質(zhì)量濃度800 μg/mL、作用時(shí)間72 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組中超聲波-纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率最大為50.17%；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率均升高，當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至144 h，只有超聲波-纖維素酶法實(shí)驗(yàn)組提取鎖陽(yáng)多糖對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率增加趨勢(shì)最明顯，抑制率為76.59%。結(jié)果表明水提醇沉法、超聲波法、纖維素酶法和超聲波-纖維素酶法提取的鎖陽(yáng)多糖均有腫瘤抑制性，相比之下，超聲波-纖維素酶法提取的鎖陽(yáng)多糖的抗腫瘤活性更為明顯。

表4　鎖陽(yáng)多糖作用時(shí)間與細(xì)胞抑制率關(guān)系（n=3）Table 4 Inhibition of tumor growth after different times of exposure to Cynomorium songaricum polysaccharides (n=3)

由圖9可以看出，通過(guò)Giemsa染色在倒置顯微鏡下觀察，與正常細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（A、D）相比，各實(shí)驗(yàn)組（B、C、E、F）細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生明顯改變、細(xì)胞皺縮變形、細(xì)胞外形不規(guī)則、胞漿著色加深、細(xì)胞核固縮或碎裂、細(xì)胞與相鄰細(xì)胞分離；其中F組細(xì)胞回縮變圓，少數(shù)為不規(guī)則形，細(xì)胞核染色質(zhì)呈粗塊狀聚集于核膜下，核碎裂。對(duì)照組細(xì)胞貼壁較緊，呈梭形，充分生長(zhǎng)且連接成片，細(xì)胞核較規(guī)則，核仁明顯，核質(zhì)比正常，核膜完整。由觀察結(jié)果可說(shuō)明超聲波-纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖實(shí)驗(yàn)組對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于單一提取法。

3　討 論

以河西鎖陽(yáng)為原料，前期采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取多糖得率為0.87%，作用于HeLa細(xì)胞，MTT法評(píng)價(jià)抗腫瘤活性，結(jié)果表明作用時(shí)間72～144 h時(shí)，細(xì)胞抑制率由29.54%增加為37.72%，推測(cè)鎖陽(yáng)多糖的對(duì)HeLa細(xì)胞具有抗腫瘤活性，但作用效果欠佳，分析其原因認(rèn)為傳統(tǒng)的水提醇沉法提取多糖時(shí)由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來(lái)，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，不但為后續(xù)的分離帶來(lái)困難，而且該法提取比較耗時(shí)，得率也不高[19-20]。因此采用超聲波-纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)，以多糖得率作為考察指標(biāo)，對(duì)超聲波料液比、超聲時(shí)間、超聲功率及纖維素酶加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值等因素分別進(jìn)行考察，研究各因素對(duì)鎖陽(yáng)多糖得率的影響。然后對(duì)上述因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以鎖陽(yáng)多糖得率作為考察指標(biāo)，確定出超聲波-纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖的最優(yōu)提取工藝，以優(yōu)化工藝提取鎖陽(yáng)多糖結(jié)果顯示，本研究提取鎖陽(yáng)多糖得率較傳統(tǒng)提取提高了2.14%。評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)水提醇沉法、超聲波法和單一纖維素酶法提取所得鎖陽(yáng)多糖相比，超聲波-纖維素酶法提取所得鎖陽(yáng)多糖具有明顯抗腫瘤活性。超聲法具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)約溶劑、得率高、對(duì)多糖結(jié)構(gòu)破壞小等優(yōu)點(diǎn)。但是由于超聲波具有較強(qiáng)的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)使大分子的多糖化學(xué)鍵斷裂，從而在后處理的過(guò)程中使損失增大而影響多糖得率[20-23]。酶解法作用條件溫和，對(duì)多糖的破壞較小，操作相對(duì)簡(jiǎn)單且能保證較高的得率。酶解法減少了化學(xué)試劑的使用，有利于資源的利用和環(huán)境的改善，但酶的價(jià)格高，限制了大規(guī)模的應(yīng)用[21-23]。鎖陽(yáng)多糖存在于細(xì)胞壁內(nèi)，由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，導(dǎo)致鎖陽(yáng)多糖的提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和提取不完全。超聲波-纖維素酶法提取鎖陽(yáng)多糖，先用超聲波的高頻振蕩及其產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”來(lái)破壞細(xì)胞壁間的維持力，使鎖陽(yáng)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)層發(fā)生變化，并除去一部分影響酶接觸纖維的妨礙物[22]，再用纖維素酶酶解，從而達(dá)到提高纖維素酶水解纖維素的水解效率，盡快最大限度地釋放細(xì)胞壁多糖[24-26]。本研究提取的鎖陽(yáng)多糖不僅得率增加，而且活性提高，為鎖陽(yáng)多糖的提取分離提供了一種新思路。同時(shí)也有利于擴(kuò)大鎖陽(yáng)多糖工業(yè)化生產(chǎn)，為充分利用鎖陽(yáng)資源及鎖陽(yáng)多糖在抗腫瘤方面的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Cynomorium songaricum and Their Antitumor Activity

ZHANG Huiying1, LUO Guanghong2,*, HAO Junyuan1, YANG Shenghui2, CUI Wei1, ZHANG Jie1
(1. College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye734000, China; 2. Kaiyuan Biology Technology Development Centre, Hexi Universi ty, Zhangye734000, China)

Abstract:The ultrasonic-assisted enzymatic extractio n of polysaccharides from the dried fleshy stem of Cynomorium songaricum grown in the Hexi Corridor region, Gansu province was optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods for improved yield of polysa ccharides. The effects of the ratio of material to water, ultrasonic treatment time, ultrasonic po wer, cellulase dosage, hydrolysis temperature, time, and pH on the extraction yield of polysaccharides were investigated. The inhibitory effects of the extracted polysaccharides on the proliferation of human cervical cancer HeLa cells in vitro were studied. The optimal extraction conditions obtained were a s follows: material to water ratio, 1:10 (g/mL); ultrasonic treatment time, 10 min; ultrasonic power, 300 W; enzyme dosage, 1.8%; hydrolysis temperature, 60 ℃; hydrolysis time, 90 min; and initial pH, 5.5. Under these conditions, the maximum yield of polysaccharides of 3.01 % was obtained. MTT assay results showed that the polysaccharide had obvious anti-tumor activity against human cervical cancer HeLa cells.

Key words:Cynomorium songaricum; polysaccharides; extraction; ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis; bioactivity

收稿日期：2015-10-30

基金項(xiàng)目：甘肅省青年科技研究基金項(xiàng)目（1107RJYG012）；甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（1304FKCG103）

作者簡(jiǎn)介：張慧瑛（1975—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)榧?xì)胞工程。E-mail：zhy20001101@126.com

*通信作者：羅光宏（1965—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)和微藻加工。E-mail：13993693452@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612010

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）12-0059-06