微波輔助酶法提取絞股藍皂苷工藝優(yōu)化

張 笛，曾慶梅*，王 琳，閆春明，高 雅（合肥工業(yè)大學 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥　230009）

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微波輔助酶法提取絞股藍皂苷工藝優(yōu)化

張 笛，曾慶梅*，王 琳，閆春明，高 雅
（合肥工業(yè)大學 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

摘 要：為改善傳統(tǒng)水提法提取得率低的問題，研究微波輔助酶法提取絞股藍皂苷工藝。采用響應面法篩選酶法提取中復合酶的最佳配比，確定了復合酶最佳配比為果膠酶-半纖維素酶-纖維素酶質量比為4∶5∶5，再利用單因素試驗結合Box-Behnken設計法優(yōu)化提取工藝。結果表明：影響微波輔助酶法提取絞股藍皂苷主要因素為復合酶添加量、酶解溫度、酶解時間、微波時間，優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為復合酶添加量1.8%、酶解溫度52 ℃、酶解時間2 h、微波時間4 min，此工藝條件下絞股藍皂苷得率為7.88%。該提取方法與傳統(tǒng)水提法相比，產(chǎn)品得率增加了68%，且提取溫度較低，工藝可操作性強。

關鍵詞：微波；復合酶法；響應面法；絞股藍皂苷

引文格式：

張笛, 曾慶梅, 王琳, 等. 微波輔助酶法提取絞股藍皂苷工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 1-6. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612001. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Di, ZENG Qingmei, WANG Lin, et al. Optimization of microwave-assisted enzymatic extraction of gypenosides from Gynostemma pentaphyllum[J]. Food Science, 2016, 37(12): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612001. http://www.spkx.net.cn

絞股藍為葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤木，又名五葉參、七葉膽，主要分布在我國湖南、廣西、云南、四川等省份，歷來有“南方人參”的美譽[1]。20世紀70年代以來，日本和中國的學者已從絞股藍中分離出80多種絞股藍皂苷，發(fā)現(xiàn)其中4種絞股藍皂苷[2]分別與人參皂苷Rb1、Rb3、Rd和F2同構異名，并且研究[3-5]表明絞股藍中皂苷的含量是人參的3 倍?，F(xiàn)代藥理學研究及臨床實驗[6-11]證明，絞股藍皂苷為絞股藍的主要功能性組分，具有降血脂、抗誘變、抗衰老、增強免疫力和保護肝臟等作用。

近幾年對絞股藍皂苷的研究多數(shù)集中在絞股藍藥理作用和皂苷單體的分離純化等方面，而忽略了對絞股藍皂苷提取工藝的研究[12]。目前已見報道的絞股藍提取工藝研究大多集中在傳統(tǒng)的水提[13]、醇提[1]、超聲提取[14]、單一酶種提取[15-16]，而這些方法不同程度地存在皂苷得率提高不大、耗能大等問題[13]。

通常的酶法提取只考察一種酶的酶解破壁實驗，無法同時發(fā)揮不同酶種特有的優(yōu)勢，本實驗針對絞股藍細胞壁組成，同時采用果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶，充分發(fā)揮各自的酶解優(yōu)勢，復合酶解破壁。同時引入操作簡單、能耗小、效率高的微波提取技術，絞股藍粉末在快速振動的微波電磁場中吸收電磁能，細胞內部的極性分子發(fā)生高頻振動和摩擦，溫度迅速上升，瞬間的內外壓力差超過細胞壁的承受能力而導致細胞破裂[17-20]，從而輔助提高復合酶解破壁提取絞股藍的效果，增加絞股藍皂苷的溶出率。第一步先通過響應面試驗篩選復合酶最佳配比，然后利用單因素試驗結合Box-Behnken設計[21]對微波輔助酶法提取絞股藍皂苷的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，進而開發(fā)一種高效破壁提取絞股藍皂苷的新技術。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

絞股藍神農(nóng)金康原生態(tài)茶業(yè)有限公司；Amberlite XAD-2大孔樹脂上海金穗生物科技有限公司；冰乙酸、高氯酸、無水乙醇、檸檬酸等（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶（均為食品級，酶活均為50 000 U/g）江蘇銳陽生物科技有限公司；人參皂苷Re標準品中國食品藥品檢定研究院。

1.2儀器與設備

FD-1真空干燥箱北京博醫(yī)康技術公司；JP-500C微型植物粉碎機永康市久品工貿有限公司；PB-10 型pH計美國Stangardize公司；MP-70107FL微波爐廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司；UV-1600紫外分光光度計美國Spectrophotometer公司；TB-215D型電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市儀器研究所；SIGMA 3K15高速冷凍離心機德國Sigma公司；XW-80A微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1絞股藍皂苷的提取工藝流程

絞股藍全草→真空干燥→粉碎過60 目篩→準確稱取2.0 g預處理過的絞股藍粉末→添加一定比例蒸餾水→800 W微波間歇處理一定時間→檸檬酸調節(jié)pH值→添加復合酶50 ℃條件下酶解一定時間→70 ℃滅酶30 min→離心（3 000 r/min，10 min）→過濾→濾液4 ℃冷藏柜中靜置過夜→離心（5 000 r/min，10 min）得上清液→Amberlite XAD-2離子交換大孔樹脂層析→70%乙醇溶液洗脫→60 ℃水浴揮干→絞股藍皂苷晶體

1.3.2絞股藍皂苷得率的測定

按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[22]進行測定。

1.3.3復合酶最佳組合的確定

針對絞股藍細胞壁特點和皂苷分布部位[23]，選用纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶進行復配，采用響應面法優(yōu)化纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的組合比例。以充分發(fā)揮不同酶種的優(yōu)勢，最大限度地破壞細胞結構，提高皂苷得率。

設定pH 5.0，準確稱取2.0 g預處理過的絞股藍粉末于100 mL三角瓶中，以1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水[24]，800 W條件下微波2 min[25]，之后用檸檬酸調節(jié)pH值為規(guī)定值，按照響應面試驗設計方案（表1）加入不同質量分數(shù)的纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶進行混合，50 ℃酶解1 h，70 ℃滅酶30 min，再按1.3.2節(jié)方法測定并計算總皂苷得率，根據(jù)試驗結果利用Design-Expert 8.0.6進行響應面分析，并通過驗證實驗優(yōu)化出效果較好的復合酶組合進行后續(xù)實驗。

表1　復合酶配比響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in central composite design experiments for the optimization of enzyme mixing ratio

1.3.4絞股藍皂苷提取單因素試驗

預設料液比1∶30（g/mL）、pH 5.0、復合酶添加量1%（質量分數(shù)，果膠酶-半纖維素酶-纖維素酶質量比1∶1∶1）、酶解溫度50 ℃、酶解時間1.0 h、微波時間2 min。準確稱取預處理過的絞股藍粉末2.0 g，以料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、復合酶添加量（0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%）、酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、酶解pH值（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）、酶解溫度（40、50、60、70、80 ℃）、微波時間（2、4、6、8、10 min）6 個單因素為變量，每一個單因素試驗篩選出最優(yōu)條件作為下一個單因素的常規(guī)量，每個處理組均重復3 次。按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法提取、測定并計算絞股藍皂苷得率，根據(jù)單因素試驗結果進行方差分析確定影響顯著的因素。

1.3.5絞股藍皂苷提取響應面試驗設計

利用響應面中Box-Behnken設計結合單因素試驗確定的4 個影響絞股藍皂苷得率的顯著因素，進行四因素三水平的試驗設計（表2），建立數(shù)學回歸模型并分析。

表2　絞股藍皂苷提取響應面試驗因素及水平Table 2 Factors and levels used in central composite design experiments for for the optimization of extraction parameters

2　結果與分析

2.1復合酶最佳配比的確定

表3　復合酶配比響應面優(yōu)化試驗方案及結果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology for the optimization of enzyme mixing ratio

對試驗數(shù)據(jù)（表3）進行逐步回歸，剔除影響不顯著的擬合項，可得到其二次多項式方程為：

Y=0.23＋7.89A＋8.07B＋13.94C＋7.63AC－12.92A2－8.61B2－18.73C2

表4　復合酶配比回歸方程各項的方差分析Table 4 Anal y sis of variance of all terms in regression equation for the optimization of enzyme mixing ratio

2.2復合酶配比驗證實驗結果

鑒于實際操作的局限，將條件設定為果膠酶添加量0.4%、半纖維素酶添加量0.5%、纖維素酶添加量0.5%，并結合料液比1∶30（g/mL）、酶解時間2 h進行實驗，在50 ℃條件下進行絞股藍皂苷提取，3 次平行實驗絞股藍皂苷得率（7.03%、7.10%和7.06%）平均值為7.06%。實際值與預測值差異不顯著，采用響應面法優(yōu)化得到的參數(shù)可以作為下一步實驗的基礎數(shù)據(jù)。

2.3提取工藝單因素試驗結果

圖1　單因素試驗結果Fig. 1　Results of single factor experiments showing the effects of extraction parameters on the yield of gypenosides

由圖1a可知，溶劑用量過少時提取得率不高，這可能是因為過少的溶劑不利于絞股藍粉末的充分溶解，造成酶與底物接觸不充分。過大的溶劑用量則稀釋了酶溶液、不利于酶解反應的高效進行，同樣造成提取效果下降。綜合考慮溶劑消耗、提取效果、后續(xù)調配需求等實際問題，選擇料液比1∶30（g/mL）為宜。

由圖1b可知，隨著復合酶添加量的增加，酶與底物接觸機會相應增大，可使絞股藍細胞壁破解，內容物隨之釋放出來。但當復合酶添加量超過1.5%后，皂苷得率的增加程度不明顯，其原因可能是由于底物完全被酶分子所飽和，繼續(xù)增加的酶分子失去了與底物結合的機會，造成酶解反應速度降低，也可能是因為不同酶種的競爭機制造成酶活降低[26]，導致皂苷得率相應降低。因此從控制成本和皂苷得率綜合考慮，選擇復合酶添加量1.5%為宜。

由圖1c可知，絞股藍皂苷得率隨酶解時間的延長增加，從提高生產(chǎn)效率的角度看，酶解時間超過2.0 h 后，繼續(xù)延長酶解時間對皂苷提取意義不大，因此選擇酶解時間在2.0 h為宜。

由圖1d可知，pH值在4.4～5.2之間，皂苷得率隨pH值的上升而增加，但皂苷得率變化不大，這可能是由復合酶的酶種特性決 定的，在這段pH值范圍內復合酶能保持較高的酶活。弱酸性的提取環(huán)境有利于提取液的后期殺菌，降低殺菌溫度和殺菌時間從而更好地保留絞股藍皂苷，為絞股藍皂苷的產(chǎn)業(yè)化應用提供了很好的前提條件[27]。綜合考慮皂苷得率和殺菌效果，選擇酶解pH 4.8為宜。

由圖1e可知，隨著酶解溫度的升高，絞股藍皂苷得率升高，但當溫度超過50 ℃時，皂苷的提取率反而下降。過高的酶解溫度導致酶結構發(fā)生變化而失去活性[15]，當溫度超過70 ℃后酶基本失活，失去了添加復合酶的破壁優(yōu)勢。所以酶解溫度控制在50 ℃為宜。

經(jīng)預實驗發(fā)現(xiàn)，在800 W微波條件下，用時2 min提取液可達70 ℃，為防止部分皂苷由于長時間微波作用產(chǎn)生熱降解，本實驗固定微波功率在800 W，2 min間歇微波處理。由圖1f可知，在累積微波時間4 min后，繼續(xù)延長微波時間絞股藍皂苷得率提高不大，這可能是因為4 min時微波的破壁作用已充分進行，之后微波時間的延長所帶來絞股藍皂苷得率的微弱提高大多是因為溫度的提升所帶來的，考慮到節(jié)約能耗和時間，選擇微波時間在4 min左右為宜。

表5　單因素試驗方差分析Table 5 Analysis of variance of single factor experiment

通過單因素試驗方差分析（表5）確定各因素的顯著性先后順序為酶解溫度、復合酶添加量、酶解時間、微波時間、酶解pH值、料液比，其中影響極顯著的4 個因素分別為酶解溫度、酶添加量、酶解時間、微波時間。

2.4絞股藍皂苷提取工藝響應面試驗結果

表6　絞股藍皂苷提取Box-Behnken設計方案與結果Table 6 Box-Behnken design with experimental values of gypenosides yield

對表6試驗數(shù)據(jù)進行逐步回歸多次擬合，剔除影響不顯著的擬合項后，可得到其二次多項式方程為：

表7　絞股藍皂苷提取回歸方程各項的方差分析Table 7 Analysis of variance of all terms in regression equation for the optimization of extraction parameters

由表7可以看出，該模型P＜0.01（極顯著），失擬項P＞0.05（不顯著）；同時模型的決定系數(shù)R2=0.95，說明模型擬合程度良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.92，表明預測值與實測值之間具有高度相關性；再次變異系數(shù)CV=1.02%，也說明其置信度較高。因此可以用此回歸模型對絞股藍皂苷得率進行分析和預測。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型進行數(shù)學分析獲得最佳工藝為復合酶添加量1.85%、酶解溫度52.32 ℃、酶解時間2.07 h、微波時間4.31 min，在此條件下，預測的絞股藍皂苷得率最大理論值為7.92%。

2.5絞股藍皂苷提取驗證實驗結果

為了方便實際操作，將條件調節(jié)為復合酶添加量1.8%、酶解溫度52 ℃、酶解時間2 h、微波時間4 min，并結合料液比1∶30（g/mL）、酶解pH 4.8，進行3次平行絞股藍皂苷提取實驗，絞股藍皂苷得率（7.86%、7.90% 和7.89%）平均值為7.88%，實際值與預測值差異不顯著。因此，該法優(yōu)化得到的工藝條件基本準確可靠，可以作為工業(yè)化應用的依據(jù)。

2.6與傳統(tǒng)水提法比較結果

若不采用微波輔助酶法，而是利用傳統(tǒng)水提法提取絞股藍皂苷，水提條件為2 g預處理過的絞股藍粉末、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間1 h，平行測定6組，絞股藍皂苷得率的平均值為4.69%。從產(chǎn)品得率看，微波輔助酶法提取率相比傳統(tǒng)水提法提高了68%，這主要是因為微波輔助酶法在微波破壁的基礎上進一步復合酶解更有利于改變細胞壁的組織結構和狀態(tài)，提高破壁效果，促進絞股藍皂苷的溶出，且微波輔助酶法提取溫度低，皂苷不易失活，有助于提高絞股藍皂苷得率。

3　結 論

經(jīng)響應面試驗優(yōu)化得到皂苷提取所用復合酶配比為果膠酶添加量0.4%、半纖維素酶添加量0.5%、纖維素酶添加量0.5%，即4∶5∶5。添加量影響強弱次序為：纖維素酶＞半纖維素酶＞果膠酶。

通過單因素試驗和Box-Behnken設計優(yōu)化，得到了影響絞股藍皂 苷得率的4 個顯著因素，并實現(xiàn)了提取條件的優(yōu)化。最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶30（g/mL）、酶解pH 4.8、微波功率800 W、復合酶添加量1.8%、酶解溫度52 ℃、酶解時間2 h、微波時間4 min，絞股藍皂苷得率平均為7.88%，與預測值差異不顯著。

微波輔助酶法提取工藝操作簡單，提取溫度較低，能耗大大減少[28]。成本增加主要是復合酶，但是酶的用量僅為1.8%，且3種酶的價格也較便宜，綜合來看產(chǎn)品得率提高所帶來的附加值以及產(chǎn)品能耗的降低可以抵消微波輔助酶法的成本增加，具有很好的工業(yè)化前景。

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Optimization of Microwave-Assisted Enzymatic Extraction of Gypenosides from Gynostemma pentaphyllum

ZHANG Di, ZENG Qingmei*, WANG Lin, YAN Chunming, GAO Ya
(Engineering Research Center of Bio-Process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei230009, China)

Abstract:This study addressed the microwave-assisted enzymatic extraction of gypenosides from the whole plants of Gynostemma pentaphyllum as an improvement over the traditional water extraction method, giving a lower extraction yield. Response surface method based on Box-Behnken design was used to optimize the ratio of pectinase to hemicellulase to cellulose for their combined use in the extraction of gypenosides as well as process parameters. The results showed that enzyme dosage, hydrolysis temperature, hydrolysis time and microwave irradiation time were identified as main variables that influence extraction efficiency. The optimum values for these 4 independent variables were 1.8%, 52 ℃, 2 h and 4 min, respectively. The yield of gypenosides was 7.88% under these conditions, which was increased by 68% compared with that obtained with the traditional water extraction method. Due to its low extraction temperature and simple operation, this method has a good prospect of industrial application.

Key words:microwave; multi-enzymatic method; response surface methodology; gypenosides

收稿日期：2015-11-15

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31371844）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100801）；安徽省科技攻關項目（1301032155）

作者簡介：張笛（1990—），男，碩士，研究方向為食品現(xiàn)代加工工程化技術。E-mail：baitianwy@163.com

*通信作者：曾慶梅（1962—），男，教授，博士，研究方向為食品科學與生物化工。E-mail：zengqingmei-1@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612001

中圖分類號：TS201.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0001-06