高效液相色譜法測定心肌肽中組胺含量的可行性分析

矯　建，張婷婷, 杜　娟，劉進(jìn)朋，魯　軍

(1. 大連市藥品檢驗所，遼寧 大連 116021；2. 大連市第二人民醫(yī)院，遼寧 大連 116011 )

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高效液相色譜法測定心肌肽中組胺含量的可行性分析

矯建1，張婷婷1, 杜娟2，劉進(jìn)朋1，魯軍1

(1. 大連市藥品檢驗所，遼寧 大連 116021；2. 大連市第二人民醫(yī)院，遼寧 大連 116011 )

[摘要]目的建立和驗證高效液相色譜(HPLC)測定心肌肽中組胺含量的方法。方法采用多道生理記錄儀記錄受試樣品致貓血壓下降情況。用丹磺酰氯柱前衍生化高效液相色譜法測定心肌肽中組胺含量，心肌肽溶液經(jīng)三氯乙酸沉淀后，取上清液以丹磺酰氯丙酮溶液為衍生化試劑，衍生化后進(jìn)行高效液相色譜測定。色譜條件為：色譜柱C18柱(250 mm×4.6 mm，i.d.,5 μm)，以水-乙腈為流動相梯度洗脫，檢測波長254 nm，并對此方法進(jìn)行方法學(xué)考察(標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、加標(biāo)、回收率、精密度重復(fù)性、專屬性)。分析樣品中組胺含量與致貓血壓下降值之間的相關(guān)性。結(jié)果1～5號樣品dT/dS值分別為(0.22±0.07,0.74±0.07,0.91±0.03,0.93±0.10,1.16±0.05)均為合格產(chǎn)品。組胺對照品在0.1～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.996，檢出限為0.03 μg/mL，平均加標(biāo)回收率>91.1%。日內(nèi)與日間精密度RSD均<1.0%,重復(fù)性及專屬性均符合生物樣品分析要求。SPSS軟件分析心肌肽中組胺的含量與降壓物質(zhì)檢查法中降壓反應(yīng)比值(dT/dS)成良好的線性相關(guān)(r=0.974，P=0.036)。結(jié)論采用HPLC法測定心肌肽溶液中組胺的含量，并結(jié)合降壓反應(yīng)比值(dT/dS)設(shè)定組胺含量的限值可能成為控制心肌肽原料藥質(zhì)量的良好方法。

[關(guān)鍵詞]降壓物質(zhì)；心肌肽；組胺；高效液相色譜法；丹磺酰氯柱前衍生法

[引用本文]矯建,張婷婷，杜娟,等.高效液相色譜法測定心肌肽中組胺含量的可行性分析[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016,38(3)：228-231.

組胺屬于一種生物胺，由組氨酸脫羧酶(HDC)以組氨酸為底物合成，由組氨酸脫羧形成，作為生物活性物質(zhì)存在于大多數(shù)活的生物中。組胺被公認(rèn)為是一種過敏反應(yīng)介質(zhì)，是免疫性刺激或非免疫性刺激生物反應(yīng)的介質(zhì)[1]，同時，單胺氧化酶抑制劑可以增加含組胺類物質(zhì)的毒性[2]。魚類等食品的中毒多由組胺所致，當(dāng) 100 g 食品中組胺的含量超過50 mg就會產(chǎn)生致命危害。組胺有一定的血管擴(kuò)張作用，超過一定劑量會使血壓迅速下降[3]，導(dǎo)致心率增加，冠脈及腦血管供血不足、甚至休克等[4]。

心肌肽是從不包括人的哺乳動物心臟中提取的多肽，可直接作用于心肌細(xì)胞，促進(jìn)在多種損傷因素下心肌的修復(fù)[5-6]。動物臟器提取物或發(fā)酵產(chǎn)物都有可能含有組胺，中國藥典規(guī)定此類制劑須進(jìn)行降壓物質(zhì)檢查。目前檢測組胺的方法為采用多道生理記錄儀檢測受試樣品致實驗動物血壓下降情況。本文參考水產(chǎn)品、肉制品等食品中的組胺檢測方法[3，7-9]，建立了心肌肽中組胺的高效液相色譜檢測方法，擬為心肌肽的質(zhì)量控制提供一種新的替代方法。

1材料和方法

1.1實驗儀器

MP100 多道生理儀(美國BIOPAC公司)，高效液相色譜儀(Thermo Scientific，Ultimate 3000，配有四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)，XS105-DU十萬分之一分析天平(Mettler公司)，離心機(jī)(Beckman Allegra X-30R Centrifuge)，ZSXH-625 型恒溫水浴箱(上海智城分析儀器制造有限公司)，渦旋振蕩器(德國IKA公司)。

1.2實驗試劑

磷酸組織胺(批號：150510-200412)，丹磺酰氯(CAS 號：805- 65- 2，批號：101065422)，乙腈，丙酮為色譜純；檸檬酸鈉，鹽酸，三氯乙酸，碳酸鈉，氨水，無水乙醚均為分析純。5 批心肌肽溶液，由大連珍奧藥業(yè)有限公司提供。

1.3實驗動物

貓，3只，體重2.0 ～ 4.0 kg，均為雄性, 購于大連醫(yī)科大學(xué)，合格證號為：211003700000448。

1.4方法

1.4.1降壓物質(zhì)檢查

按照《中國藥典》2015年版四部通則1145[10]降壓物質(zhì)檢查法和廠家標(biāo)準(zhǔn)，將貓用苯巴比妥(1000 mg/kg)和戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于保溫手術(shù)臺上，分離氣管，必要時插入插管以使呼吸暢通。在一側(cè)頸動脈插入連接到多道生理記錄儀的動脈插管，管內(nèi)充滿適宜的抗凝劑溶液，以記錄血壓。在一側(cè)股靜脈內(nèi)插入靜脈插管，供注射對照品及樣品用。

5 批心肌肽溶液對貓的降壓反應(yīng)：取對照品稀釋液的劑量為dS，心肌肽溶液的劑量為dT，照下列次序注射一組4 個劑量：dS、dT、dT、dS。然后以第1與第3、第2與第4劑量所致的反應(yīng)分別比較；如 dT所致的反應(yīng)值均不大于dS所致反應(yīng)值的1/2，即dT與 dS所致反應(yīng)值的比值<0.5 時，判定供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定。否則應(yīng)按上述次序繼續(xù)注射一組 4 個劑量，并按相同方法分別比較兩組內(nèi) dS、 dT劑量所致的反應(yīng)值；如 dT所致的反應(yīng)值均不大于dS所致的反應(yīng)值，即 dT與 dS所致反應(yīng)值的比值<1時，仍判定供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定；如 dT所致的反應(yīng)值均大于 dS所致的反應(yīng)值，即 dT與 dS所致反應(yīng)值的比值>1 時，判定供試品的降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定；否則應(yīng)另取動物復(fù)試。如復(fù)試的結(jié)果仍有 dT所致的反應(yīng)值大于 dS所致的反應(yīng)值，即 dT與 dS所致反應(yīng)值的比值>1時，判定供試品的降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定。

1.4.2樣品制備與色譜條件

1.4.2.1對照品衍生化

精密稱取磷酸組胺對照品適量，用鹽酸溶液(0.1 mol/L)溶解并稀釋至1.00 mg/mL，4 ℃保存作為儲備液。精密量取儲備液適量，分別稀釋至濃度為0.10，0.25，0.50，1.25，2.50，5.00，10.00 μg/mL，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取組胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，加0.5 mL飽和碳酸鈉溶液，混勻(pH9.0)，加入10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液1.0 mL，振蕩混勻約1 min，置60 ℃水浴避光反應(yīng)30 min，中間振蕩2次，取出加入氨水250 μL，混勻暗處放置30 min，加入乙醚2 mL，混勻，取乙醚層，再提取2次，合并乙醚層，40 ℃氮氣吹干，加入1.00 mL乙腈溶解，0.45 μm濾膜過濾，待上樣。

1.4.2.2供試品衍生化

精密量取心肌肽溶液適量，加入30 %三氯乙酸溶液使成含5%三氯乙酸的心肌肽溶液，漩渦混勻，8000 r/min， 4 ℃離心15 min，收集上清液，同對照品衍生化；另取樣品加入組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液使其終濃度分別為5.00，1.00，0.125 μg/mL同法制備，得樣品加標(biāo)溶液；取1份樣品上清液用丙酮代替丹璜酰氯溶液制備供試品空白溶液。

1.4.2.3柱前衍生高效液相法的色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈- 水；流速：1.0 mL/min，時間-梯度洗脫；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm。見表1。

表1　梯度洗脫程序

1.4.3柱前衍生高效液相色譜法的方法學(xué)考察

1.4.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取組胺對照品衍生化溶液20 μL進(jìn)樣，測定組胺衍生物峰面積，以組胺濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(S)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.4.3.2加標(biāo)回收率

以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算組胺的濃度，求得回收率。

1.4.3.3精密度

以1 d內(nèi)測得的同一對照品衍生化溶液(5 μg/mL)的濃度計算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)6 d測得同一對照品衍生化溶液(5 μg/mL)的濃度計算日間精密度。

1.4.3.4重復(fù)性

取心肌肽溶液，平行制備6份供試品衍生化溶液進(jìn)行測定。

1.4.3.5專屬性

分別取對照品衍生化溶液、供試品衍生化溶液及供試品空白溶液20 μL進(jìn)樣測定。

1.4.4心肌肽中組胺含量的測定

分別精密吸取5 批心肌肽溶液的衍生化溶液20 μL進(jìn)樣，測定組胺衍生物峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算組胺含量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行處理，以樣品中組胺含量為橫坐標(biāo)(C)，以其所致的降壓反應(yīng)(dT/dS)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1降壓反應(yīng)

1號樣品符合規(guī)定，2、3號樣品經(jīng)復(fù)試后，判定為合格；4、5號樣品換貓復(fù)試，4號樣品經(jīng)換貓復(fù)試為合格。見表2。

2.2柱前衍生高效液相色譜法的方法學(xué)考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

回歸方程為S=0.9925C+ 2.9264，r=0.996；線性范圍：0.1～10 μg/mL；檢測限為0.03 μg/mL，S/N≥3；定量限為0.1 μg/mL，S/N≥10。

2.2.2加標(biāo)回收率

表2　 降壓物質(zhì)檢查法的結(jié)果

結(jié)果表明，高(5.00 μg/mL)、中(1.00 μg/mL)、低(0.125 μg/mL)3 個濃度的組胺回收率均>91.1 %。

2.2.3精密度

結(jié)果表明，日內(nèi)與日間精密度RSD 均<1.0%，符合生物樣品的分析要求。

2.2.4重復(fù)性

6份供試品中組胺的平均含量為0.24 μg/mg，RSD為1.5 %。

2.2.5專屬性

對照品和供試品衍生化溶液中可檢出組胺，供試品空白溶液均未檢出組胺(圖1)。

2.3心肌肽中組胺含量的測定

5 批心肌肽溶液的組胺含量分別為0.04,0.17,0.24,0.25,0.34 μg/mg，SD值均<0.03。

2.4降壓物質(zhì)檢查法與柱前衍生化高效液相法結(jié)果的相關(guān)性分析

回歸方程為C=0.301X- 0.031，r=0.974，P=0.036。通過回歸方程計算得，當(dāng)組胺濃度控制在0.12 μg/mg以下時，降壓反應(yīng)比值(dT/dS)可控制在0.5以下，降壓物質(zhì)檢查無需復(fù)試即可符合規(guī)定，當(dāng)組胺濃度控制在0.27 μg/mg以下時，降壓反應(yīng)比值(dT/dS)可控制在1.0以下，降壓物質(zhì)檢查需復(fù)試方可判定為符合規(guī)定。

3討論

本實驗通過采用建立的方法對引起不同降壓反應(yīng)的心肌肽原料藥中的組胺進(jìn)行了測定， 5批樣品中組胺含量在0.04 ～ 0.34 μg/mg之間。進(jìn)一步采用該方法考察了心肌肽原料藥在室溫條件下放置1周時組胺的含量變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌肽原料藥在密封條件下組胺含量不受影響，表明心肌肽原料藥中的組胺成分具有一定的穩(wěn)定性。

本實驗研究了常規(guī)的降壓物質(zhì)檢查法中不同批次心肌肽所致的降壓反應(yīng)比值(dT/dS)與心肌肽溶液中組胺的含量相關(guān)性，結(jié)果提示二者呈良好的正相關(guān)，如果設(shè)定心肌肽溶液中組胺含量的限值為0.27 μg/mg ，降壓反應(yīng)比值(dT/dS)可控制在1.0以下。實驗結(jié)果表明，該方法滿足替代方法的要求，可以定量準(zhǔn)確檢測心肌肽中的組胺含量。通過擴(kuò)大樣本數(shù)進(jìn)一步考察組胺含量和貓降壓反應(yīng)的相關(guān)性，設(shè)定組胺的含量限值，該方法可能作為心肌肽貓降壓檢查的良好方法。此方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可避免因動物個體差異大導(dǎo)致實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性差的問題。

圖1　高效液相法色譜圖Fig 1 HPLC chromatogramsA：組胺對照品衍生化；B：心肌肽衍生化；C：心肌肽空白對照

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作者簡介:矯 建(1984-)，女，遼寧大連人，主管藥師。E-mail：jiaojian91@aliyun.com 通信作者:魯 軍，副主任藥師。E-mail：261748914@qq.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.03.05

[中圖分類號]R932-33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

文章編號：1671-7295(2016)03-0228-04

(收稿日期:2016-03-29;修回日期:2016-03-30)

Feasibility analysis of HPLC detecting histamine content in cardiomyopeptide

JIAO Jian1, ZHANG Ting-ting1, DU Juan2, LIU Jin-peng1， LU Jun1

(1.DalianInstituteforDrugControl，Dalian116021，China；2.DalianSecondPeople’sHospital，Dalian116011，China)

[Abstract]Objective To establish and validate a method to determine histamine content in Cardiomyopeptide. Methods HPLC procedures employing derivatization reagents, dansylchloride were applied for determination of histamine in cardiomyopeptide. the supernatant derivatisation with dansylchloride was performed after cardiomyopeptide solution precipitated by Trichloroacetic acid(TCA)，the histamine was determined by a gradient elution HPLC method on a C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of acetonitrile and water and detection at 254 nm. The method was validated in terms of linearity, precision，accuracy and recovery. Drop of blood pressure in cats caused by cardiomyopeptide was meassued with BIOPAC MP100 system. Results The method showed excellent linearity in the range 0.1-10 μg/mL，and the resulting correlation coefficients for histamine in the calibration range were 0.996，a limit of detection (LOD) of 0.03 μg/mL could be achieved，mean recovery rate was more than 91.1%，statistical analysis showed a good linear relationship between histamine content and the ratio of blood pressure dropping(dT / dS) (r=0.974，P=0.036). Conclusion The HPLC method was appropriate for the determination of histamine content in Cardiomyopeptide, which suggested the method could be a suitable alternative to conventional method in vivo experiments.

[Key words]depressor substance；cardiomyopeptide；histamine；HPLC；dansyl chloride pre-column derivatization