瑞舒伐他汀抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及信號(hào)通路

楊　博，李　平，孟立平，郭航遠(yuǎn)

(1. 山東能源新汶礦業(yè)集團(tuán)萊蕪中心醫(yī)院，山東萊蕪　271103；2. 紹興市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江紹興　312000)

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◇基礎(chǔ)研究◇

瑞舒伐他汀抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及信號(hào)通路

楊博1，李平1，孟立平2，郭航遠(yuǎn)2

(1. 山東能源新汶礦業(yè)集團(tuán)萊蕪中心醫(yī)院，山東萊蕪271103；2. 紹興市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江紹興312000)

摘要：目的驗(yàn)證瑞舒伐他汀是否具有抑制同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)表型轉(zhuǎn)化的作用及其可能的信號(hào)通路。方法SD大鼠主動(dòng)脈VSMCs原代細(xì)胞培養(yǎng)鑒定，取4～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。VSMCs分為空白組、100 μmol/L Hcy干預(yù)組、Hcy+瑞舒伐他汀干預(yù)組、Hcy+雷帕霉素干預(yù)組共4組。MTT法測(cè)各組VSMCs的增殖；劃痕法和Transwell法測(cè)各組VSMCs的遷移；ICC法觀察各組VSMCs的細(xì)胞形態(tài)；Western blot 檢測(cè)各組VSMCs中SM-actin、SM-MHC、calponin、OPN、p-P70S6K1的表達(dá)。結(jié)果相比于空白組，Hcy組VSMCs增殖和遷移增加；細(xì)胞形態(tài)變圓；SM-MCH和calponin表達(dá)減少(P<0.01)；OPN和p-P70S6K1表達(dá)增加(P<0.01)。相比于Hcy組，瑞舒伐他汀組和雷帕霉素組VSMCs增殖和遷移減少，細(xì)胞形態(tài)變的細(xì)長(zhǎng)，SM-MHC和calponin表達(dá)增加(P<0.01)；OPN和p-P70S6K1表達(dá)減少(P<0.01)。結(jié)論Hcy可以促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，瑞舒伐他汀可以抑制Hcy的這一作用，其機(jī)制可能是通過抑制mTOR/P70S6K1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：瑞舒伐他?。焕着撩顾?；同型半胱氨酸；平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中重要的病理基礎(chǔ)[1]，也是造成支架植入術(shù)或冠脈搭橋術(shù)后冠脈再狹窄的重要原因[2]。最近有研究顯示血管平滑肌細(xì)胞在不同的分化階段具有不同的細(xì)胞表型，不同表型之間的平滑肌細(xì)胞生理特性相差巨大，并且在外界因素發(fā)生變化時(shí)，VSMCs不同表型之間可以相互轉(zhuǎn)化[3]。正常血管中的VSMCs一般是已分化的“收縮型”平滑肌細(xì)胞，在血管受到損傷時(shí)，一些已分化的“收縮型”VSMCs可以去分化成為“合成型”細(xì)胞?！笆湛s型”VSMCs低增殖、低分泌，特異性表達(dá)SMA、calponin、SM-MHC等具有標(biāo)志意義的特征性蛋白，“合成型”VSMCs增殖加快，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加[4]，表達(dá)“收縮型”細(xì)胞所沒有的OPN蛋白[5]?，F(xiàn)在大量的研究結(jié)果顯示在粥樣斑塊中，“收縮型”的VSMCs減少，“合成型”的VSMCs增多[6]。

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是目前公認(rèn)的冠脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7-8]，我們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)Hcy可以增強(qiáng)VSMCs的增殖和遷移，誘導(dǎo)VSMCs大量分泌MMPs等影響細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的蛋白酶[9]。王生蘭等[10]也通過試驗(yàn)證實(shí)Hcy可以促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖和表型轉(zhuǎn)化。

瑞舒伐他汀可以顯著減少LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的面積[11]，抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表達(dá)MMPs等破壞細(xì)胞外基質(zhì)平衡的蛋白[9]，但是瑞舒伐他汀是否抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制尚未探明。本實(shí)驗(yàn)通過使用mTOR/P70S6K1通路抑制劑雷帕霉素，觀察他汀對(duì)p-P70S6K1表達(dá)的影響，以闡明瑞舒伐他汀是否具有抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用及其可能的信號(hào)通路。

1材料與方法

1.1材料①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不限，50 d左右，體質(zhì)量150～180 g(購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；②實(shí)驗(yàn)試劑：瑞舒伐他汀(英國阿斯利康公司)，乙醚、甲醇、750 mL/L乙醇、950 mL/L乙醇、無水乙醇、甲醇(杭州化學(xué)試劑有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉素(杭州吉諾公司)；同型半胱氨酸(Sigma公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，MTT(Emresco公司)；DAPI(Rcohe公司)；兔抗大鼠SM-actin單克隆抗體、兔抗calponin、SM-MHC、OPN多克隆抗體(ABCOM公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC、FRITC標(biāo)記的山羊抗兔IGg(jackson公司)；蛋白免疫印跡以及明膠酶譜相關(guān)試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2VSMC原代細(xì)胞培養(yǎng)以及鑒定采用組織貼塊法培育大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin, SMA)鑒定VSMCs，通過SMA與DAPI核染之間的關(guān)系鑒定VSMCs的純度。取第4～7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞加干預(yù)因素時(shí)用含25 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基。

1.3分組及干預(yù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(不加任何干預(yù)因素)，同型半胱氨酸組(Hcy，濃度為100 μmol/L，以0.1 mL/L DMSO為溶劑)，瑞舒伐他汀組(100 μmol/L Hcy+5 μmol/L瑞舒伐他汀，以0.1 mL/L DMSO為溶劑)和雷帕霉素組(100 μmol/L Hcy+20 nmol/L雷帕霉素，以0.1 mL/L DMSO為溶劑)。文獻(xiàn)報(bào)道DMSO終濃度≤1 mL/L時(shí)，可排除DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性作用，所以本實(shí)驗(yàn)中沒有設(shè)0.1 mL/L DMSO溶劑對(duì)照組。

1.4MTT法檢測(cè)VSMCs增殖取4～7代培養(yǎng)細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化單層VSMCs，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以每孔6×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化。各組細(xì)胞按上述分組加入對(duì)應(yīng)濃度的干預(yù)因子，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)空白對(duì)照孔(不加細(xì)胞)。細(xì)胞于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入MTT液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4～6 h，終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值。以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制VSMCs生長(zhǎng)曲線。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound Healing)檢測(cè)VSMCs遷移取4～7代培養(yǎng)細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化單層VSMCs，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔體積2 mL。細(xì)胞鋪滿板底后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，用100 μL黃色槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入各組相應(yīng)的干預(yù)因子，于0、12、24、48、72、96 h光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移并拍照，用Image pro plus 6.0分析計(jì)算出細(xì)胞遷移的面積(劃痕面積減去遷移后細(xì)胞之間剩余面積)，以細(xì)胞遷移的面積與最開始的劃痕面積的比值表示細(xì)胞遷移率。

1.6Transwell法檢測(cè)VSMCs遷移取4～7代VSMCs，血清饑餓法使細(xì)胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，2.5 g/L胰蛋白酶消化單層VSMCs，用含有各組干預(yù)因子的DMEM高糖培養(yǎng)基(無血清)配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)(3×104個(gè)/mL)。各組24孔板配套的Transwell小室(0.8 μm)的上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入含有100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基500 μL，分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。干預(yù)結(jié)束后以棉簽輕輕擦去上層未穿透膜的VSMCs，取下Transwell半透膜，TBS洗滌3次，37 g/L多聚甲醛室溫固定5 min，流水沖洗后，用2 μg/mL的DAPI染核，PBS沖洗后，熒光顯微鏡下隨機(jī)每組取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)計(jì)算均值。

1.7細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)SM-actin在細(xì)胞中的分布及表達(dá)將第4～7代VSMCs接種于96孔板，每孔3 000～5 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入各組干預(yù)因子，在細(xì)胞融合之前進(jìn)行檢測(cè)。先PBS洗3遍，用40 g/L多聚甲醛固定，2.5 mL/L Triton X 100穿破細(xì)胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入anti-SMA抗體(1∶250)，4 ℃過夜，PBS洗滌3遍之后加入結(jié)合有FICT或者FRICT的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后PBS洗滌3遍，熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Pro Plus 6.0分析。

1.8Western blot檢測(cè)SM-actin、calponin、OPN、p-P70S6K1的表達(dá)各組干預(yù)因子干預(yù)48 h之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法蛋白定量。SDS-PAGE膠每孔加入20 μL樣品，80 V 30 min進(jìn)行蛋白濃聚，120 V 2 h進(jìn)行凝膠電泳，并用孔徑0.45 μm硝酸纖維素膜250 mA 90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢經(jīng)常溫下TBST洗膜×3、脫脂奶粉封閉2 h后，以1∶1 000濃度加入兔抗鼠SM-actin一抗(或抗calponin、SM-MHC、OPN、p-P70S6K1β-actin一抗)，4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜×3，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白和內(nèi)參。暗室柯達(dá)膠片顯影，Quantity one軟件定量分析。

2結(jié)果

2.1VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，8 d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，2周左右細(xì)胞融合可以傳代。傳代后細(xì)胞呈典型“峰谷”狀排列生長(zhǎng)，SM-actin細(xì)胞免疫熒光鑒定VSMCs，DAPI核染之后確定細(xì)胞純度在99%以上(圖1)。

圖1大鼠主動(dòng)脈VSMCs形態(tài)學(xué)變化(×100)以及細(xì)胞免疫熒光鑒定

Fig.1 Identification of the VSMCs’ morphology (×100) and immunocytochemistry (×400)

A：倒置光學(xué)纖維鏡下見VSMCs呈“峰谷”樣生長(zhǎng)(×100)；B：免疫熒光染色SM-actin鑒定VSMCs純度。

2.2瑞舒伐他汀抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖在加入各組干預(yù)因素后，12 h和24 h時(shí)各組A值沒有明顯差別。相比于空白對(duì)照組，48 h之后Hcy組A值明顯升高(P<0.05)，說明Hcy可促進(jìn)VSMCs的增殖；相比于Hcy組，瑞舒伐他汀組和雷帕霉素組A值明顯降低(P<0.05)，說明瑞舒伐他汀和雷帕霉素具有抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖的作用(圖2)。

圖2各組不同時(shí)間點(diǎn)VSMCs增殖情況

Fig.2 Proliferation of VSMCs among different groups at different time points

對(duì)照組相比，*P<0.01；與同型半胱氨酸組相比，#P<0.01。

2.3瑞舒伐他汀和雷帕霉素抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs遷移在劃痕之后，各組干預(yù)4、8、12、24、48 h，光學(xué)纖維鏡下觀察VSMCs遷移。從8 h開始，相比于對(duì)照組，Hcy組VSMCs遷移率明顯增加(P<0.01)；相比于Hcy組，瑞舒伐他汀組和雷帕霉素組VSMCs遷移率明顯減少(P<0.01)，說明瑞舒伐他汀和雷帕霉素具有抑制Hcy引起的VSMCs遷移的作用(表1、圖3)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VSMCs穿透Transwell小室進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)見表2。相比于對(duì)照組，Hcy組穿透細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)；相比于Hcy組，瑞舒伐他汀和雷帕霉素組穿透細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01，圖4)。

表1各組不同時(shí)間點(diǎn)VSMCs的遷移率與劃痕面積之間的百分比

Tab.1Distance of VSMCs migration area/scratch area at different time points

(%)

與對(duì)照組組相比，*P<0.01；與同型半胱氨酸組相比，#P<0.01。

表2VSMCs穿透Transwell小室的細(xì)胞數(shù)

Tab.2Counts of the VSMCs which penetrated the Transwell chambers (×200)

±s)

與對(duì)照組相比，*P<0.01；與同型半胱氨酸組相比，#P<0.01。

圖3光鏡下觀察干預(yù)24 h后各組VSMCs的遷移情況

Fig.3 Migration of the VSMCs after each treatment for 24 h (×100)

A：對(duì)照組；B：同型半胱氨酸組；C：瑞舒伐他汀組；D：雷帕霉素組。

圖4VSMCs在Transwell小室培養(yǎng)48 h后各組遷移到下室的細(xì)胞DAPI染色圖

Fig.4 The migration ability of the VSMCs among groups at 48 h in Transwell chambers (×200)

A：對(duì)照組；B：同型半胱氨酸組；C：瑞舒伐他汀組；D：雷帕霉素組。

2.4瑞舒伐他汀和雷帕霉素抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs形態(tài)的變化用SM-actin免疫熒光染色觀察各組VSMCs形態(tài)變化，結(jié)果顯示對(duì)照組中細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，呈典型的血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)；在100 μmol/L Hcy干預(yù)下，平滑肌細(xì)胞變圓變小，失去原有的細(xì)胞形態(tài)；瑞舒伐他汀和雷帕霉素組VSMCs形態(tài)恢復(fù)正常，表明瑞舒伐他汀和雷帕霉素可以抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs形態(tài)變化(圖5)。

2.5SM-actin、calponin、SM-MHC、OPN和p-P70S6K1的表達(dá)各組VSMCs中SM-actin的表達(dá)量沒有顯著差異(圖6)；相比于對(duì)照組，Hcy組VSMCs中OPN表達(dá)增加(P<0.01)，calponin和SM-MCH的表達(dá)減少(P<0.05)；相比于Hcy組，瑞舒伐他汀和雷帕霉素組VSMCs中OPN表達(dá)減少，calponin和SM-MHC表達(dá)增多。對(duì)照組與Hcy組之間p-P70S6K1的表達(dá)沒有明顯區(qū)別；相比于Hcy組，瑞舒伐他汀組和雷帕霉素組VSMCs中p-P70S6K1表達(dá)明顯減少(P<0.01，圖6)。

圖5細(xì)胞免疫熒光法觀察各組的細(xì)胞形態(tài)

Fig.5 Detection of the VSMCs’ morphology by immunocytochemistry (×400)

A：對(duì)照組；B：同型半胱氨酸組；C：瑞舒伐他汀組；D：雷帕霉素組。相比于對(duì)照組，同型半胱氨酸組VSMCs變圓，失去梭形形態(tài)；相比于同型半胱氨酸組，瑞舒伐他汀組和雷帕霉素組VSMCs形態(tài)恢復(fù)正常。

圖6 Westernblot檢測(cè)各組VSMCs中SM-actin,calpo-nin,SM-MHC,OPN和p-P70S6K1的表達(dá)Fig.6ExpressionsofSM-actin,calponin,SM-MHC,OPNandp-P70S6K1intheVSMCsdetectedbyWesternblot與對(duì)照組相比,*P<0.01;與同型光胱氨酸組相比,#P<0.01。

3討論

在不同的外界因素影響下，VSMC具有不同的細(xì)胞表型，具有很強(qiáng)的可塑性。在正常血管中VSMCs是一種高分化的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，主要起維持血管形狀和收縮血管的作用，具有低增殖、低遷移、低蛋白分泌等特征；當(dāng)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病時(shí)，VSMCs可以去分化為未分化的細(xì)胞，形態(tài)變圓，細(xì)胞收縮性能下降，表現(xiàn)出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征[12]。過去的觀點(diǎn)把VSMCs細(xì)胞表型單純的分為“收縮型”和“分泌型”兩種表型[13]，現(xiàn)在大量的研究已經(jīng)證實(shí)，在不同強(qiáng)度的外界因素作用下，VSMCs去分化的程度不同，可表現(xiàn)出各種介于“收縮型”與“分泌型”之間的細(xì)胞表型特征，從而在很多血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3]。

自從1979年CHAMLEY等第一次發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞具有不同的細(xì)胞表型以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一大批特異性比較高的可以當(dāng)作已分化成熟VSMCs標(biāo)志的蛋白，比如與細(xì)胞收縮密切相關(guān)的SM-actin、calponin、SM-MHC、SM22α、smoothelin等蛋白以及參與細(xì)胞骨架構(gòu)成的h-caldesmon、β-vinculin、telokin、metavinculin、desmin等蛋白[4]。這些蛋白在分化成熟的VSMCs中表達(dá)，其表達(dá)量隨著平滑肌細(xì)胞的去分化而逐漸減少。相反，最近的研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(osteopontin, OPN)和糖基質(zhì)蛋白在去分化的VSMCs中開始表達(dá)，并且表達(dá)量與細(xì)胞的去分化程度正相關(guān)[5]。通過檢測(cè)SM-actin、SM-MHC、calponin、OPN等蛋白的表達(dá)情況是近幾年來鑒別VSMCs不同細(xì)胞表型的常用方法[14-15]。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hcy可以促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移，使VSMCs細(xì)胞形態(tài)變圓變小，增加OPN在VSMCs中的表達(dá)，減少SM-MHC、calponin蛋白的表達(dá)，從而證實(shí)了Hcy可以促進(jìn)VSMCs去分化為“分泌型”的平滑肌細(xì)胞。瑞舒伐他汀是一種選擇性羥甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑，通過減少甲羥戊酸的生成，從而抑制膽固醇的合成，進(jìn)而降低血清中LDL的水平[16-17]。最近的許多研究表明他汀類藥物還具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化、抗炎、抗心肌重構(gòu)等作用[18-21]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瑞舒伐他汀具有抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用，這可能也是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

多項(xiàng)研究證實(shí)mTOR/P70S6K1通路在調(diào)節(jié)VSMCs增殖和遷移以及表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。MARTIN等[13]通過實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)mTOR/P70S6K1信號(hào)通路在血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化過程中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hcy可以促進(jìn)p-P70S6K1的表達(dá)，我們推測(cè)Hcy可能是通過mTOR/P-P70S6K1通路發(fā)揮其促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用。雷帕霉素是由鏈球菌屬產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，特異性抑制mTOR信號(hào)通路，對(duì)多種類型細(xì)胞有免疫抑制作用和抗增殖作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雷帕霉素可以抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化，而且雷帕霉素組p-P70S6K1的表達(dá)顯著減少。同樣，瑞舒伐他汀組VSMCs中p-P70S6K1的表達(dá)也明顯減少。我們推測(cè)瑞舒伐他汀抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用可能是通過抑制mTOR/P70S6K1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

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(編輯韓維棟)

收稿日期：2015-12-08修回日期：2016-03-02

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.LY14H020002)，

通訊作者：郭航遠(yuǎn). E-mail: ghangyuan@hotmail.com

中圖分類號(hào)：R543.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604008

Rosuvastatin inhibits homocysteine-induced smooth muscle cell phenotype transformation and its signal pathway

YANG Bo1, LI Ping1, MENG Li-ping2, GUO Hang-yuan2△

(1.Laiwu Center Hospital of Shandong Energy Xinwen Mining Group, Laiwu 271103;2. Department of Cardiology, Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing 312000, China)

ABSTRACT:Objective To verify whether rosuvastatin can inhibit homocysteine (Hcy)-induced rat aortic vascular smooth muscle cell (VSMC) phenotype transformation and its potential mechanism. Methods The primary culture and identification of rat VSMCs were conducted, using VSMCs in passage4-7 for the following experiments. The VSMCs were divided into 4 groups: control group, Hcy (100 μmol/L) group, Hcy+rosuvastatin group, and Hcy+rapamycin group. MTT was used to investigate the proliferation of VSMCs. Transwell chambers and wound healing were employed to test the migration ability of VSMCs. ICC was used to detect the VSMCs’ morphology. Western blotting was used to investigate the expressions of SM-actin, SM-MHC, calponin, OPN, and p-P70S6K1 in VSMCs of each group. Results Compared with those in control group, the proliferation and migration ability of VSMCs were significantly increased in Hcy modulation group (P<0.01). The expressions of SM-MCH and calponin increased but those of OPN and p-P70S6K1 decreased in Hcy group compared with control group (P<0.01). The expression of SM-actin did not significantly differ between the groups. Compared with those in Hcy modulation group, the proliferation and migration ability of VSMCs were significantly decreased in rosuvastatin and rapamycin groups (P<0.01). The expressions of SM-MCH and calponin increased while OPN and p-P70S6K1 expressions decreased in rosuvastatin and rapamycin groups compared with Hcy group (P<0.01). Conclusion Hcy can induce the dedifferentiation of VSMCs, and rosuvastatin can inhibit this effect of Hcy. Its

KEY WORDS:rosuvastatin; rapamycin; homocysteine (Hcy); vascular smooth muscle cells (VSMCs) phenotype transformation

Supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.LY14H020002)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160618.1759.002.html(2016-06-18)

potential mechanism may be realized via the mTOR/P70S6K1 signal pathway.