微流控法DNA片段化研究進展

水玲玲， 李嵐慧， 金名亮， 周國富

(華南師范大學華南先進光電子研究院，彩色動態(tài)電子紙顯示技術研究所，廣州 510006)

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微流控法DNA片段化研究進展

水玲玲*， 李嵐慧， 金名亮， 周國富

(華南師范大學華南先進光電子研究院，彩色動態(tài)電子紙顯示技術研究所，廣州 510006)

摘要：DNA分子的片段化技術對于下一代基因測序技術和疾病檢測技術意義重大，文章回顧了現(xiàn)有的DNA片段化方法，著重介紹了基于微流控芯片技術的流體動力學剪切法DNA片段化技術，總結了影響微流控芯片中DNA片段化過程的因素，并且展望未來微流控技術在DNA片段化和生物芯片領域的應用.

關鍵詞：微流控； DNA片段化； 流體剪切； 基因測序

基因測序也稱DNA測序，是現(xiàn)代生物學研究中重要的手段之一，其關鍵是快速獲得隨機分布長短一致的DNA片段[1-3].通常，DNA片段長度的范圍是選取接近相關生物體內1個單基因的平均長度，或者基于為整個數據庫自動生成序列數據的方法來選取[4].因此，如何得到片段大小可控且長度分布集中的DNA片段成為大家普遍關心的熱點研究課題之一.

DNA是由核苷酸組成的長鏈分子聚合物，易溶于水，在外力作用下，DNA長鏈會被拉伸，當外力大于分子間的化學鍵時，DNA組成單元間的共價鍵斷裂從而形成隨機分布的DNA片段[5].目前，常用的DNA片段化方法有以下幾種：DNA限制酶切法[6]、超聲波降解法[7-8]、噴射霧化法[9-10]和水動力剪切法[11-16].這些方法均被用于DNA片段的生成，并各有優(yōu)點和缺點.基于水動力剪切DNA的方法是目前大家公認的比較有效的方法之一，可以較好地得到隨機分布并且分散度較小的DNA片段，并且不會對DNA造成損傷；但是目前的實驗設備，對密閉性和壓力要求嚴格，器件相對昂貴.Digilab公司生產的全自動基因組DNA剪切儀(Hydrodynamic DNA Shearing Instrument)，利用水動力剪切可以獲得長度為40～4 000 bp的DNA片段[17].針對便攜式醫(yī)療器械和下一代基因測序技術來說，操作更容易、樣品用量更少、無規(guī)片段化、片段長度可控和對樣品無損害的方法，仍然是科學家們追求的夢想.

微流控芯片實驗室(Lan-on-a-Chip)或稱微全分析系統(tǒng)(Micro Total Analysis System)，是有由MANZ與WIDMER[18]在1990年提出的. 通過這種技術可以把生物和化學領域中所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成與一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或者化學過程，并對其產物進行分析的一種技術[19].隨著20世紀微納米加工技術的飛速進步，微納米器件已經廣泛的應用于各個領域當中，包括電子信息、醫(yī)療器械、生物和化學分析以及藥物篩選等[20].從微流控技術的特征來看，它可以精密地操控微米級的流體，是一種非常適合用來實現(xiàn)少量DNA樣品處理(包括片段化)的方法[8, 21]；并且這種技術的器件小(mm～cm)、便攜性好、樣品使用量少.在微流控的微通道中，流體的流速以及流動的變化不但可以整體控制流體的速度，而且可以通過對微流控通道的幾何結構的設計來控制流體流速在微通道中的變化(加速或者減速).因此，可以控制流體對DNA樣品的流體剪切力，從而快速剪切溶液中的DNA分子，得到短鏈的DNA片段.微流控芯片可以通過現(xiàn)有的微加工方法來簡單地實現(xiàn)，因此也可以比較容易地與其他功能的芯片集成，從而可以實現(xiàn)快速高效的診療流程，實現(xiàn)個人診療系統(tǒng)的器件化.

1DNA片段化微流控芯片材料和結構

在微流控芯片器件中，流體的控制主要通過外加力場來控制，因此流體的流速和外加力場的壓力差成正比，可表示為[22]264：

Q=∫vidA，

(1)

其中，Q(m3/s)、vi(m/s)、A(m2)和P(Pa)分別代表流體的體積流速、特定位置點i處流體的線性速度、微通道的橫截面積和通道兩端的壓力差；Rhy代表微通道中流體流動產生的阻力.由式(1)可知，微流控通道中流體對DNA分子的剪切力來源于流體流動過程，因此,流體的流速越快或者外加力場越大，DNA片段化的效果越好.

基于目前常用的微米加工技術和材質的選擇，玻璃/硅基微流控芯片可以耐受比較高的壓力，因此被常用于DNA片段化的芯片器件(圖1A)[21]3；但是為了降低剪切壓力，通過分段和連續(xù)的方法可以提高剪切效率，同時降低速度，因此高分子材料的微流控芯片也可以被用于DNA片段化的微流控芯片(圖1B)[12]1045.

2微流控芯片DNA片段化技術中DNA樣品的處理和要求

片段化的DNA分子對于基因測序和疾病檢測技術非常關鍵，因此要求DNA片段化的技術對樣品

圖1用于DNA片段化微流控芯片的玻璃和高分子材料

Figure 1DNA fragmentation microfluidic chips made of glass and polymer materials

不挑剔，不會帶來污染和損害.大量的流體力學DNA片段化實驗結果表明，這種技術對DNA樣品基本不挑剔.human genomic DNA[12]、salmon sperm DNA、restriction fragments、cosmids、BACs、YACs[13]等不同種類的DNA樣品均可以在微流控芯片中實現(xiàn)無規(guī)的有效DNA片段化，不同剪切速度下得到的DNA片段分布和DNA的來源無關.

DNA溶液中離子強度會導致溶液的粘度增加，通常DNA分子在高離子強度下更趨于形成團狀的卷曲結構，因此，隨著離子濃度增加，要將同一種DNA分子剪切到相同大小的片段所需要的剪切力(流體速度)越大(圖2A)；隨著DNA濃度的增加，其粘度也增加，但是研究結果表明，在相同剪切力(流體速度)條件下，所產生的DNA片段差別不明顯(圖2B).

3流體速度和微通道尺寸的影響

眾所周知，流體力學DNA片段化主要由流體對DNA分子的快速剪切作用造成，因此流體的剪切速度決定了最終DNA片段化的尺寸.大量實驗表明，隨著流體流速的增加，DNA片段化的尺寸減??；而在一定剪切速度下，DNA片段的大小隨著時間的增加而減小，經過一段時間以后將達到平臺不再變化. 即在一定的流體速度下，DNA分子能夠被剪切得到穩(wěn)定的最小尺寸的片段(圖3)[21]4.

由式(1)可知，流體的體積流速和施加在微通道兩端的壓力差成正比，與流體在微通道中的流體阻力成反比，因此,在相同的體積流速下，微通道尺寸越小，其中的流體線性速度越大，可以將相同DNA分子片段化得到的尺寸越小.表1顯示，在同一種微流控芯片中，當微通道尺寸從50 μm減小到10 μm，體積流速穩(wěn)定在3 mL/min時，DNA片段從9 000 bp降低到1 870 bp，而Human DNA也從較大尺寸降低到2 320 bp[12]1045.

圖2　DNA樣品溶液離子強度(A)[12]3883和DNA濃度(B)[21]5對微流控片段化的影響

圖3　微流控芯片中流體流速變化對剪切獲得的DNA片段長度的影響[21]4

表1　不同尺寸微通道對DNA片段化結果的影響[12]1045

注：a表示流速為3 mL/min. NDb表示未檢出.括號中的百分數為相對標準偏差.

4循環(huán)次數對微流控片段化的影響

雖然在微流控芯片中，流體的快速剪切可以將

DNA分子片段化，但是微流控通道的尺寸有限.在微流控芯片中，流體的阻力與通道的長度成正比，因此通道越長，阻力越大.一般來說，玻璃或者硅基的微流控芯片可以耐受106Pa數量級的壓力，而塑料芯片一般只能耐受105Pa數量級的壓力.通常情況下，微流控通道的長度可以控制在mm到cm級之間；但是為了減低達到片段化要求的高速流體流動，通道的尺寸不能太長，一般在mm到cm級之間.總之，當DNA溶液從微流控芯片的入口到出口流動的時間都在μs至ms級之間.溶液中存在大量的DNA分子，快速短暫的流動可以讓部分DNA分子片段化，而大量的DNA分子來不及片段化就已經到達出口.研究發(fā)現(xiàn)，在流體力學剪切DNA片段化器件或設備中，可以通過多次循環(huán)樣品來達到降低DNA片段尺寸和尺寸分布的效果.圖4為樣品在微流控通道中，相同流速下循環(huán)1～10次對DNA片段化結果的影響，循環(huán)次數的增加，不但可以降低DNA片段尺寸，還可以提高樣品的回收率.

圖4　固定流速下1～10次循環(huán)的DNA片段尺寸分布(A)、平均尺寸和質量濃度(B)[21]6

Figure 4Length distribution (A), average length and collected DNA concentration (B) of DNA fragments produced by shearing DNA solution through a microfluidic device at a fixed flow rated with 1 to 10 cycles[21]6

5溫度對微流控片段化的影響

DNA溶液在低溫下一般很穩(wěn)定，可長時間保存；但是在高溫下則會發(fā)生變性，核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，同時溶液的粘度降低.DNA解鏈的溫度與分子中所含的堿基對成分有關，G和C越多則解鏈溫度越高.THORSTENSON等[15]的研究表明，當工作溫度在22～60 ℃時，流體力學剪切樣品DNA獲得的結果區(qū)別不大，而當溫度>60°以后，相同剪切條件下DNA片段的尺寸明顯減小.這可能是由于DNA分子由雙螺旋結構解旋變成單鏈結構，因此在相同剪切速度下，更加容易被剪切變成更小的DNA片段(圖5).

圖5　溫度對流體剪切DNA片段化的影響[15]851

Figure 5Effect of temperature on DNA fragmentation by hydrodynamic shearing[15]851

6結論

微流控技術可以精密準確地控制流體在微觀尺度的流動和變化，流體快速流過微流控通道會對溶液中的分子產生剪切力作用，因此，這種技術可以用于DNA片段化研究.本文總結了微流控流體力學DNA片段化的影響因素和效果.DNA樣品的來源、DNA的濃度對微流控DNA片段化影響不明顯；溶液的離子強度可以增加溶液粘度和使DNA分子處于團簇狀態(tài)，因此需要更大的剪切力才能獲得相同尺寸的DNA片段；溶液在微流控芯片中多次循環(huán)可以降低DNA片段尺寸和尺寸分布，同時可以提高回收產率；工作溫度在DNA解鏈溫度以下，溫度對片段化結果影響較小，當溫度大于解鏈溫度后，DNA解旋成單鏈因此更加容易被片段化.微流控流體剪切DNA片段化具有無規(guī)剪切、尺寸可控、分子破壞小和污染少等特點，結合微流芯片器件的尺寸小和用量少的優(yōu)勢，是一種非常適合于下一代基因測序和便攜式醫(yī)療的新技術，正受到越來越多的關注.

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【中文責編：譚春林英文責編：李海航】

Recent Progress of DNA Fragmentation Based on Microfluidics

SHUI Lingling*, LI Lanhui, JIN Mingliang, ZHOU Guofu

(Institute of Electronic Paper Displays, South China Academy of Advanced Optoelectronics, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

Abstract：DNA fragmentation is one of the key technologies for gene library and disease detection. Normal DNA fragmentation technologies are reviewed focusing on microfluidic based DNA fragmentation technology. Effective parameters are discussed and summarized according to the resulted DNA fragments. The importance and perspective of microfluidic DNA fragmentation are summarized.

Key words：microfluidics; DNA fragmentation; fluidic shearing; gene sequencing

收稿日期：2015-12-31 《華南師范大學學報(自然科學版)》網址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項目：國家自然科學基金項目(51405165)；教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT13064)；廣東省引進創(chuàng)新科研團隊計劃項目(2011D039)

*通訊作者:水玲玲，教授，國家“青年千人計劃”入選者， Email：shuill@m.scnu.edu.cn.

中圖分類號：TN27

文獻標志碼：A

文章編號:1000-5463(2016)01-0023-05