去氧鬼臼毒素抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞增殖和體外遷移的研究

陳振華，丘新才 ，林淑芳，甘振勇

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去氧鬼臼毒素抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞增殖和體外遷移的研究

陳振華，丘新才 ，林淑芳，甘振勇

目的探討去氧鬼臼毒素對人肺癌NCI-H358細(xì)胞增殖和體外遷移的影響，并初步探討其作用機(jī)制。方法應(yīng)用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實驗和DCFH-D法分別檢測去氧鬼臼毒素對NCI-H358細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡、體外遷移能力和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的影響，并通過Western blot檢測去氧鬼臼毒素對細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）B1、細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白（Cdc25c）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、p53腫瘤蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤（Bcl）-2和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9的表達(dá)水平，以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、p38分裂原激活蛋白激酶（MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化水平的影響。結(jié)果去氧鬼臼毒素能明顯抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞的生長，流式細(xì)胞結(jié)果顯示其能誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G2/M和S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞ROS產(chǎn)生，同時細(xì)胞體外遷移能力也明顯下調(diào)。Western blot結(jié)果顯示，去氧鬼臼毒素能使Cyclin B1、Cdc25c、CDK1、Bcl-2和MMP9的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而Caspase-3和p53的表達(dá)明顯上調(diào)，且ERK1/2、p38MAPK和JNK的磷酸化水平明顯受到抑制。結(jié)論去氧鬼臼毒素可抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞的增殖和體外遷移，是一種潛在的抗腫瘤藥物。

鬼臼毒素；肺腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運動；去氧鬼臼毒素

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐年增加的趨勢。目前，肺癌總的5年生存率僅為10%～13%［1］。如何改善肺癌的治療效果、提高肺癌患者的總生存率是亟待解決的向題。由于化療藥的不良反應(yīng)，許多患者往往無法耐受而放棄化療，這嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。因此尋求低毒、高效的天然植物成分成為近幾年來抗腫瘤研究的重要熱點。

去氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin，DPPT）是從中藥桃兒七Sinopodophyllum emodi（wall）、八角蓮和歐洲刺柏Juniperus communis等植物中分離得到的活性成分［2］。研究表明，DPPT具有較強的抗白血?。?］、抗腫瘤［4］、抗病毒［5］活性，是一種潛在的抗癌新藥，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過觀察DPPT對人肺癌NCI-H358細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡以及遷移的影響，探討其對肺癌的作用機(jī)制，為臨床研究提供實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑DPPT購自上海源葉生物科技有限公司；NCI-H358細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol 和0.25%胰酶均購自美國Life Technologies公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；熒光定量SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自大連寶生物有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒、青霉素和鏈霉素均購自江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所。CCK-8檢測試劑盒、Western blot的細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）B1、細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白（Cdc25c）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、p53腫瘤蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤（Bcl）-2和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、p38分裂原激活蛋白激酶（MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等一抗和辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2主要儀器培養(yǎng)箱購自美國Thermro公司；96孔板購自美國Corning公司；ELX800UV酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；FACScanTM流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司；7500 PCR儀購自美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組NCI-H358細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗分為對照組（0 μmol/L DPPT）、3 μmol/L DPPT組和6 μmol/L DPPT組。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期NCI-H358細(xì)胞，以2×103個/mL接種到96孔微孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。使用不同濃度的DPPT（0、0.5、1、2、4、6、8、10、15 μmol/L）分別處理細(xì)胞24 h和48 h，每組設(shè)置4個復(fù)孔。按照試劑盒說明書每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的光密度（OD）值。以處理組OD值/對照組OD值×100%作為生存率。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡率取對數(shù)生長期NCI-H358細(xì)胞，以2×105個/mL接種于6孔板中，0、3、6 μmol/L DPPT處理48 h后，用0.25%胰酶消化，2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min后棄上清液，500 μL 70%乙醇4℃固定過夜。加入RNA酶消化，使用碘化丙啶（PI）避光染色30 min，F(xiàn)ACScanTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，重復(fù)實驗3次。細(xì)胞凋亡采用PI/ Annexin V-FITC雙染法，將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer中，加入10 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，使用FACScanTM流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 DCFH-DA法檢測細(xì)胞ROS含量NCI-H358細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，經(jīng)3 μmol/L和6 μmol/L DPPT作用48 h后，PBS洗滌2次，每孔加入經(jīng)無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育20 min，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm下檢測細(xì)胞平均熒光強度，分析細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.7細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移情況NCI-H358細(xì)胞接種于6孔板中直至形成單層融合，待細(xì)胞融合達(dá)95%以上，用200 μL吸頭在細(xì)胞層中劃痕，PBS洗2次，加入0、3和6 μmol/L DPPT放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取0 h和24 h兩時間點在倒置顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計劃痕的間隙距離。遷移率（%）=1-［間隙距離（24 h）/間隙距離（0 h）］×100%。1.8 Western blot檢測腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)NCI-H358細(xì)胞以5×103個/mL密度接種于6孔板，0、3和6 μmol/L DPPT作用48 h后收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，加入40 μg蛋白樣品，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（150 mA，1 h），5%脫脂牛奶封閉1 h后，各目標(biāo)分子特異性一抗4℃過夜。洗去一抗，以HRP連接的二抗溫育1 h，洗滌，以ECL試劑盒顯示免疫反應(yīng)條帶。β-actin作內(nèi)參，檢測各組細(xì)胞中Cyclin B1、Cdc25c、CDK1、Caspase-3、p53、Bcl-2、MMP9的表達(dá)水平，以及ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，多組間比較采用ANOVA分析，組間多重比較用LSD-t法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 DPPT抑制NCI- H358細(xì)胞的增殖NCIH358細(xì)胞經(jīng)DPPT處理，細(xì)胞活性呈濃度依賴性抑制，同一濃度下DPPT處理48 h的細(xì)胞生存率低于24 h，見圖1。DPPT處理24 h和48 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（7.62±0.57）μmol/L和（3.77±0.23）μmol/L（t=14.011，P＜0.01）。后續(xù)實驗均以DPPT處理48 h為準(zhǔn)。2.2 DPPT對NCI-H358細(xì)胞周期分布的影響與對照組相比，DPPT處理后G2/M和S期NCI-H358細(xì)胞的比例顯著升高，而G0/G1期的細(xì)胞比例明顯減少，見表1、圖2。

Fig. 1 The effects of different concentrations of DPPT on the cell proliferation of NCI-H358 cells圖1　DPPT不同濃度和處理時間對NCI-H358細(xì)胞增殖的影響

Tab. 1 The effects of DPPT on the cell cycle of NCI-H358 cells表1　DPPT對NCI-H358細(xì)胞周期分布的影響

Fig. 2 The effects of DPPT on the cell cycle of NCI-H358 cells 圖2　DPPT對NCI-H358細(xì)胞周期的影響

2.3 DPPT誘導(dǎo)NCI-H358細(xì)胞凋亡3、6 μmol/L DPPT作用48 h后，NCI-H358細(xì)胞凋亡率［（43.32± 2.77）%、（56.26±3.18）%］均高于對照組［（10.15± 0.96）%，n=3，F(xiàn)=192.513，P＜0.01］，見圖3，提示DPPT可誘導(dǎo)NCI-H358細(xì)胞凋亡。

Fig. 3 The effects of DPPT on the apoptosis of NCI-H358 cells圖3　DPPT對NCI-H358細(xì)胞凋亡的影響

2.4 DPPT促進(jìn)NCI-H358細(xì)胞內(nèi)ROS形成經(jīng)3、6 μmol/L DPPT處理NCI-H358細(xì)胞48 h后，胞內(nèi)的ROS濃度明顯增加［（39.22±1.81）%、（62.53± 2.07）%］，均高于對照組［（9.31±0.72）%，n=3，F(xiàn)= 242.347，P＜0.01］。

2.5 DPPT抑制NCI-H358細(xì)胞的體外遷移3、6 μmol/L DPPT處理48 h后，NCI-H358細(xì)胞的體外遷移明顯受到抑制，其細(xì)胞遷移率均低于對照組［（37.55±0.31）%、（23.49±0.21）%vs.（56.32±0.52）%，n=3，F(xiàn)=169.126，P＜0.01］，見圖4。

Fig. 4 The effects of DPPT on the migration of NCI-H358 cells圖4　DPPT對NCI-H358細(xì)胞體外遷移能力的影響

2.6 DPPT抑制Cyclin B1、Cdc25c和CDK1蛋白的表達(dá)3、6 μmol/L DPPT處理后，NCI-H358細(xì)胞中Cyclin B1、Cdc25c和CDK1的蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯下調(diào)，見圖5。

Fig. 5 The effects of DPPT on the expressions of Cyclin B1，Cdc25c and CDK1 of NCI-H358 cells圖5　DPPT對Cyclin B1、Cdc25c和CDK1蛋白表達(dá)的影響

2.7 DPPT對Caspase-3、p53、Bcl-2和MMP9蛋白表達(dá)的影響經(jīng)3、6 μmol/L DPPT作用48 h后，NCI-H358細(xì)胞中Caspase-3和p53蛋白表達(dá)較對照組顯著上升，而Bcl-2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，見圖6。

Fig. 6 The effects of DPPT on the expressions of Caspase-3，p53，Bcl-2 and MMP9 of NCI-H358 cells圖6　DPPT對Caspase-3、p53、Bcl-2和MMP9蛋白表達(dá)的影響

2.8 DPPT抑制ERK1/2/MAPK信號通路3、6 μmol/L DPPT能明顯降低ERK1/2、p38MAPK和JNK的磷酸化水平，而對ERK1/2、p38MAPK和JNK的作用不明顯，見圖7，提示DPPT可抑制ERK1/2/ MAPK信號通路的活化。

3　討論

3.1 DPPT可以抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞體外增殖DPPT是從天然植物中提取的活性小分子化合物，由于其具有消炎、抗病毒、抗血小板聚集和抗過敏等功效而受到人們的關(guān)注。近年文獻(xiàn)報道，DPPT具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化作用等活性［6］。本研究顯示，DPPT能明顯抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞增殖，且其抑制作用呈濃度依賴性增加。研究還發(fā)現(xiàn)，DPPT具有阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并抑制NCI-H358細(xì)胞的體外遷移。

Fig. 7 The effect of DPPT on the ERK1/2/MAPK signal pathway of NCI-H358 cells圖7　DPPT對ERK1/2/MAPK信號通路的影響

3.2 DPPT可阻滯肺癌NCI-H358細(xì)胞周期Cyclin B1是第一個被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后相關(guān)。Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在細(xì)胞周期，特別是有絲分裂中起重要作用，其參與細(xì)胞周期檢測點調(diào)控，維持基因組的穩(wěn)定［7］。CDK1是蛋白激酶家族的重要一員，通過與Cyclin形成復(fù)合物磷酸化一系列的目標(biāo)底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期循環(huán)的產(chǎn)生［8］。Cdc25c是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，作為M期的誘導(dǎo)物，在控制細(xì)胞周期進(jìn)入M期和G2期檢驗點具有重要作用［9］。本研究顯示，NCI-H358細(xì)胞經(jīng)DPPT處理后，細(xì)胞內(nèi)Cyclin B1、Cdc25c和CDK1的表達(dá)明顯受抑制，因此DPPT抑制肺癌細(xì)胞的增殖可能與抑制Cyclin B1、Cdc25c和CDK1的表達(dá)相關(guān)。

3.3 DPPT可誘導(dǎo)肺癌NCI-H358細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白質(zhì)家族是控制線粒體致凋亡因子釋放的主要調(diào)節(jié)因子，Bcl-2基因是Bcl-2家族的重要成員，也是迄今研究得最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一［10］。研究表明，p53是重要的抑癌基因［11］，在細(xì)胞周期捕獲、DNA修復(fù)、細(xì)胞衰老、分化、凋亡等過程中均起著重要的作用，其能修復(fù)損傷細(xì)胞或除去嚴(yán)重?fù)p傷的細(xì)胞，從而避免這些細(xì)胞對機(jī)體的危害。Caspase是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分，主要通過干擾DNA修復(fù)過程參與細(xì)胞凋亡［12］。本研究中Western blot結(jié)果顯示，DPPT作用NCI-H358細(xì)胞后，Caspase-3 和p53的表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)。研究表明，ROS參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，少量的ROS可以誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，而過量的ROS反而會對細(xì)胞內(nèi)的脂類、蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷［13］。ROS可作為第二信使通過上調(diào)促凋亡蛋白Caspase等的表達(dá)而參與凋亡調(diào)控。本研究顯示，DPPT可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。MMP9是MMPs中的重要成員之一，在高浸潤性肺癌細(xì)胞中大量表達(dá)，與肺癌的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切［14］。本研究還發(fā)現(xiàn)，MMP9的表達(dá)水平在DPPT處理后明顯下調(diào)。因此，DPPT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制NCI-H358細(xì)胞體外遷移與Caspase-3、p53、Bcl-2和MMP9的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

3.4 DPPT可抑制肺癌NCI-H358細(xì)胞ERK1/2/ MAPK信號通路ERK1/2信號通路是最早發(fā)現(xiàn)的Ras/Raf/MAPK經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞遷移調(diào)控過程。p38MAPK可通過增強c-myc表達(dá)、激活c-Jun和c-fos、誘導(dǎo)bax轉(zhuǎn)位等途徑，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。而活化的JNK能通過激活內(nèi)源性通路，使Bcl-2參與促凋亡分子的釋放（如細(xì)胞色素C），從而導(dǎo)致Caspase的激活和細(xì)胞凋亡［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，DPPT可下調(diào)NCI-H358細(xì)胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK的磷酸化水平。因此，DPPT抑制細(xì)胞增殖和體外遷移與抑制其上游ERK1/2/MAPK信號通路有關(guān)。

在今后的研究中，本課題組將進(jìn)一步驗證DPPT對其他肺癌細(xì)胞系的抑制作用，并考察其對正常上皮細(xì)胞的毒性，探討其對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性的差別，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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（2016-02-15收稿2016-03-23修回）

（本文編輯李鵬）

Research on mechanisms of deoxypodophyllotoxin-induced inhibition of cell proliferation and migration in human lung cancer NCI-H358 cells

CHEN Zhenhua，QIU Xincai ，LIN Shufang，GAN Zhenyong
Department of Respirology，The Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical University，F(xiàn)oshan 528200，China Corresponding Author E-mail：xincq6512@126.com

Objective To investigate the effects and mechanism of deoxypodophyllotoxin on cell proliferation and migration of human lung cancer NCI-H358 cells in vitro. Methods CCK-8 assay，flow cytometry assay，wound healing assay and DCFH-DA assay were used to detect the effects of deoxypodophyllotoxin on the proliferation，cells cycle，apoptosis，migration and reactive oxygen species（ROS）. The protein expressions of Cyclin B1，Cdc25c，CDK1，Caspase-3，p53，Bcl-2，MMP9，ERK1/2，p38MAPK and JNK were measured by Western blot assay，respectively. Results Deoxypodophyllotoxin inhibited cell proliferation and reduced migration in human lung cancer NCI-H358 cells. Flow cytometry analysis showed that treatment with deoxypodophyllotoxin resulted in cell cycle G2/M and S phase arrest，cell apoptosis and ROS production. The result of Western blot assay showed that protein expressions of Cyclin B1，Cdc25c，CDK1，Bcl-2 and MMP9 were downregulated while Caspase-3 and p53 were up-regulated. Moreover，Deoxypodophyllotoxin treatment decreased the phosphorylated levels of ERK1/2，p38MAPK and JNK obviously. Conclusion Deoxypodophyllotoxin could suppress the proliferation and migration of human lungcancer NCI-H358 cells in vitro，which is apotential anti-tumor drug.

podophyllotoxin；lungneoplasms；cell proliferation；cell movement；deoxypodophyllotoxin

R734.2，R349.5

A

10.11958/20160058

廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院呼吸科（郵編528200）

陳振華（1971），男，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究

E-mail：xincq6512@126.com