膠原酶對兔假體包膜羥脯氨酸含量的影響

申志惠，王　黔，呂曉巖中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心

膠原酶對兔假體包膜羥脯氨酸含量的影響

申志惠，王黔，呂曉巖
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心

目的：應(yīng)用外源性膠原酶制劑作用于假體包膜，通過測定包膜組織的羥脯氨酸含量來反應(yīng)出其膠原代謝狀況，從而探索防止擴(kuò)張器假體包膜過度纖維化而形成攣縮的一個(gè)新途徑。方法：分三組在實(shí)驗(yàn)家兔背部皮下組織埋入同等規(guī)格大小的擴(kuò)張器硅膠壺，實(shí)驗(yàn)組及生理鹽水組每隔一周壺上分別注射同等劑量的膠原酶制劑及生理鹽水，空白組不做任何注射作為對照，14天和35天后分別取出三組硅膠壺等同部位的包膜組織進(jìn)行羥氨酸含量測定。結(jié)果：空白組和生理鹽水組羥脯氨酸含量隨時(shí)間逐慚升高，而膠原酶組呈下降趨勢?？瞻捉M和生理鹽水組羥脯氨酸含量無明顯差異（P>0.05）；空白組和生理鹽水組羥脯氨酸含量明顯高于膠原酶組（P<0.05）。結(jié)論：膠原酶制劑能有效降低家兔假體包膜組織中羥脯氨酸含量，抑制膠原纖維的合成。

膠原酶；實(shí)驗(yàn)家兔；羥脯氨酸；膠原纖維

羥脯氨酸這種氨基酸存在于機(jī)體組織膠原纖維和蛋白質(zhì)中，是膠原特有的一種氨基酸，其含量可以代表反應(yīng)出組織中膠原的含量，和機(jī)體的膠原分子緊密相關(guān)。膠原酶是膠原蛋白溶解酶，對膠原分解代謝起著特殊的功能。纖維包膜的形成過程類似于創(chuàng)傷修復(fù)中瘢痕組織的形成過程，均與膠原的合成與分解代謝有關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過膠原酶藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)家兔制模的硅膠壺上的包膜組織，測定其組織中羥脯氨酸的含量，以探討利用膠原酶降解包膜組織中膠原蛋白含量來防治假體包膜攣縮的可能性。

1.材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康普通級(jí)實(shí)驗(yàn)家兔（北京隆安動(dòng)物養(yǎng)殖中心）20只。雌雄不限，體重2.5~3.5㎏，4~5月齡。

1.2手術(shù)麻醉藥配制

速眠新和氯胺酮按1:1等體積混合配劑，按0.3ml/kg體重肌注麻醉實(shí)驗(yàn)家兔。

1.3膠原酶

注射用膠原酶（collagenase）上海喬源生物制藥有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H31022659。

1.4羥脯氨酸（hydroxyproline）上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

羥脯氨酸應(yīng)用液 10ug/ml:稱1mg羥脯氨酸溶于100ml0.001NHcl中。

1.5分光光度計(jì)（Beckmen,USA）。

2.方法

2.1動(dòng)物模型標(biāo)本的制作

實(shí)驗(yàn)家兔20只，每只家兔麻醉，通過手術(shù)將三個(gè)直徑1.7cm,高0.7cm規(guī)格等同的圓形擴(kuò)張器硅膠壺分前中后埋于實(shí)驗(yàn)家兔背部。前部為實(shí)驗(yàn)用藥組，每周往壺上注射配制好的含不同單位活性的膠原酶制劑1ml。中部為生理鹽水組，每周往壺上注射1ml生理鹽水。后部為空白組，不做任何注射作對照。三組分別于術(shù)后第14天和35天手術(shù)剝?nèi)“诠枘z壺上相同部位的包膜組織，平鋪于無菌沙布上涼干，待作羥脯氨含量測定。

2.2包膜組織樣本的處理及測定

2.2.1水解

稱取各個(gè)部位重量一致的干組織15mg切碎，用6N Hcl進(jìn)行水解。水解在16×150 mm帶帽螺旋管中進(jìn)行，標(biāo)本和鹽酸的最終體積為2 ml，放烤箱中加熱。條件是3小時(shí)，130℃，這是羥脯氨酸回收的最宜時(shí)間和溫度。

2.2.2水解產(chǎn)物的中和

(1)取水解試管加2滴0.02%甲基紅指示劑。

(2)然后加2.4 ml 2.5N NaoH于每管中進(jìn)行中和。

(3)用1N,0.1N NaoH和1N,0.1N Hcl精細(xì)調(diào)至淡黃色出現(xiàn)，手振動(dòng)試管混勻，PH調(diào)為7左右。

(4)然后將調(diào)好的水解液用蒸餾水稀釋至15ml過濾待用。

2.2.3氧化抽提（顯色反應(yīng)）

(1)吸取2ml水解濾液。

(2)加1ml0.05M氯胺T溶液于各管中充分混合，在室溫下放置20分鐘。

(3)依次在每管中加1ml對二甲氨基苯甲醛溶液混合，然后放60℃水浴20分鐘，取出后冷卻。

2.2.4測定

空白調(diào)零，于561nm分光光度計(jì)比色。參照石冰[1]的方法，我們在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立空白管和標(biāo)準(zhǔn)管，標(biāo)準(zhǔn)管中加入10ug/ml羥脯氨酸應(yīng)用液。計(jì)算公式為：Hpr含量（mg/g）=T/S×10ugml-1×10/1000(T：被測管光密度，S：標(biāo)準(zhǔn)管光密度)

2.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS.17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±S表示，組間比較采用方差分析檢測，α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)果

將測得的吸光度值代入公式計(jì)算出各標(biāo)本的羥脯氨酸含量。各組羥脯氨酸含量隨時(shí)間呈逐漸升高，而膠原酶組羥脯氨酸含量在各時(shí)間點(diǎn)均低于空白組及生理鹽水組（植入后14天，p<0.05；植入后35天，p<0.01）。空白組和生理鹽水組羥脯氨酸含量無明顯差異（p>0.05）。

4.討論

整形外科假體法乳房再造術(shù)和假體隆胸術(shù)中，硅凝膠假體的植入對于人體來說是一種異物，植入人體后引起局部組織的反應(yīng)，形成纖維組織包裹。本研究利用膠原酶對膠原蛋白降解作用這一特性，用膠原酶制劑減少假體包膜組織中的膠原蛋白的含量，從而達(dá)到減輕硅膠假體纖維囊攣縮的作用。樣本羥脯氨酸含量檢測結(jié)果顯示，術(shù)后14天，生理鹽水組羥脯氨酸含量比空白組的略有增加，可能是注射鹽水操作刺激所引起的成纖維細(xì)胞增生或膠原蛋白沉積略有增加所致，但兩組間無顯著性差異。膠原酶組羥脯氨酸含量低于生理鹽水和正常對照組（P<0.05），說明藥物在早期已經(jīng)開始發(fā)揮作用。術(shù)后21天到30天是創(chuàng)傷愈合瘢痕增生期，一般認(rèn)為這是由成纖維細(xì)胞異常增生，膠原大量合成，過度沉積所致，此期用藥有望明顯降解膠原蛋白。術(shù)后35天，膠原酶組羥脯氨酸含量明顯低于空白組及生理鹽水組，進(jìn)一步顯示膠原酶對假體包膜組織中的膠原蛋白的降解作用。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：膠原酶制劑可以使假體包膜組織中膠原蛋白含量明顯減少，從而緩解包裹假體周圍纖維包膜的緊張度，對預(yù)防假體包膜攣縮可能具有一定的防治作用。

[1]石冰,柳大烈,馬小峰.胎免皮膚在正常發(fā)育及創(chuàng)傷愈合過程中羥脯氨酸的含量比較[J]沈陽部隊(duì)醫(yī)藥,1999,12(4)295-298

[2]宋儒耀,方彰林.美容整形外科學(xué)（增訂版）.北京:北京出版社，1990.

[3]Brody Gs.On the safety of breast implants.Plastic and recon?structive surgery[J].1997,100:1314-21.