不同檢測方法在吸毒人群篩查丙肝中的應用價值

劉振專 楊紅梅 蔡常輝 陳述文 梁連輝

[摘要] 目的 探討不同檢測方法在吸毒人群篩查丙肝中的應用價值。 方法 選取2014年1～8月中山市第二人民醫(yī)院“美沙酮門診”定點收治的吸毒史部分患者194例，采用HCV-cAg ELISA試劑盒，HCV-Ab ELISA試劑盒，HCV-RNA PCR試劑盒分別檢測。 結(jié)果 194例吸毒患者血樣，HCV-RNA PCR陽性率為58.76%（114/194），HCV-Ab陽性率為63.92%%（124/194），HCV-cAg陽性檢出率為32.47%（63/194）。HCV-Ab標志物陽性率顯著高于HCV-cAg（χ2=38.411，P<0.01）。在HCV-Ab陰性樣本中，有5例HCV-cAg陽性，其中4例HCV-RNA PCR結(jié)果陽性。 結(jié)論 不同檢測方法的檢測效果略有差異，臨床上可考慮HCV-cAg與HCV-Ab聯(lián)合檢測優(yōu)勢互補，對吸毒高危人群聯(lián)合篩查，將有效防止漏檢。

[關(guān)鍵詞] 丙型肝炎病毒；丙肝病毒核心抗原；丙肝病毒抗體；聯(lián)合檢測

[中圖分類號] R512.6+3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（c）-0129-03

[Abstract] Objective To explore the application value of different determination method in screening hepatitis C in drug users. Methods 194 patients with history of drug use sentinel treated by "adanon outpatient"in the Second People′s Hospital of Zhongshan City from January to August 2014 were selected.HCV-cAg ELISA kit，HCV-Ab ELISA kit and HCV-RNA PCR kit was respectively used to detect. Results Among 194 samples from drug users，the positive rate of HCV-RNA PCR was 58.76% （114/194），the positive rate of HCV-Ab was 63.92% （124/194），the positive detection rate of HCV-cAg was 32.47% （63/194）.The positive rate of HCV-Ab markers was obviously higher than t of HCV-cAg （χ2=38.411，P<0.01）.Among HCV-Ab negetive samples，5 cases were HCV-cAg positive and 4 cases with HCV-RNA PCR positive results among that. Conclusion The detection effect of different determination method has lightly difference，HCV-cAg and HCV-Ab of combination detection may be considered for their complement each other′s advantages.Using combination screening to high-risk drug users can prevent missed detection effectively.

[Key words] Hepatitis C virus；HCV-cAg；HCV-Ab；Combined detection

丙型肝炎（丙肝）在我國屬乙類傳染病[1]，其病原體是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）[2]。據(jù)文獻報道全球約有2億人感染，感染率為3%，每年因HCV相關(guān)疾病死亡人數(shù)達35萬之多，中國約有4000萬人感染，感染率為3.2%，略高于全球平均水平[3-4]，而這些感染者中，>60%為吸毒人員[5-6]。號稱“沉默殺手”的丙肝具有隱匿性、慢性化特征，并可發(fā)展為肝硬化、肝癌，但因HCV具有高度變異性，目前尚無理想的預防性疫苗和特效藥物治療，只能采取保肝護肝治療[7-8]，因此，建立早期、快速、準確、價廉的篩查方法，選擇合適的檢測策略，對HCV的防控和預后有重大意義。丙肝病毒抗體（HCV-Ab）、HCV-RNA、丙肝病毒核心抗原（HCV-cAg）是近年來應用較廣的檢測方法，其中HCV-cAg檢測是新近發(fā)展的一項檢測技術(shù)，其窗口期（PWP）較短，為13～15 d[9-10]，且不受機體免疫狀態(tài)的影響。本文對中山市第二人民醫(yī)院“美沙酮門診”194名吸毒人員分別采集樣本，同時進行HCV-cAg、HCV-Ab、HCV-RNA 檢測，以探討HCV-cAg聯(lián)合HCV-Ab檢測在吸毒高危人群中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1～8月，選取中山市第二人民醫(yī)院“美沙酮門診”定點收治的吸毒史部分患者194例，其中男性為152例，女性為42例，年齡為20～65歲，平均（39.2±5.4）歲。入選標準：男女不限；精神狀況正常；肝腎等重要臟器無嚴重并發(fā)癥者；參與者知情并同意本次研究；經(jīng)中山市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。參照中山衛(wèi)計局立項編號：2015A020183的立項要求開展本研究。

1.2 方法

采集患者的靜脈血兩支，1支為無抗凝管，用于檢測HCV-cAg和HCV-Ab；1支為EDTA-K2管，及時分離血漿，低溫-20℃保存，用于檢測HCV-RNA。

1.2.1 HCV-Ab檢測 試劑由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，采用ELISA，嚴格按試劑說明書操作，陽性結(jié)果均雙孔進行復檢。檢測過程：包被微孔中加入100 μl樣品稀釋液，再加入10 μl樣品，充分混勻，置入37℃水浴箱30 min，取出依次反復洗滌5次，拍干，加入50 μl酶標志物，置入37℃水浴箱20 min，取出同上洗滌5次，拍干，待顯色。

1.2.2 HCV-cAg檢測 試劑由湖南康潤制藥股份有限公司提供，采用雙抗夾心ELISA，嚴格按試劑說明書操作，陽性結(jié)果均進行雙孔復檢。檢測過程：微孔條固定在支架，加入100 μl樣品稀釋液，充分混勻，加入封板膜，置于30℃中溫育30 min，洗滌液洗滌5次，扣干，加入顯色劑50 μl，輕輕混勻，37℃避光顯色10 min，每孔加入50 μl終止液，輕輕混勻，測量。

1.2.3 HCV-RNA檢測 試劑由中山大學基因股份有限公司提供，采用熒光定量PCR儀進行病毒定量檢測，觀察HCV-RNA水平，嚴格按說明書操作。

1.3 丙肝診斷陽性標準

①ELISA檢測HCV-Ab的陽性標準：樣品OD值≥臨界值為HCV-Ab陽性。②ELISA檢測HCV-cAg的陽性標準：樣品OD值≥臨界值為HCV-cAg陽性。③熒光定量PCR法檢測HCV-RNA的陽性標準：拷貝數(shù)>1.0×103判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，計數(shù)資料以百分率表示，采取χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

194例吸毒患者血樣，HCV-RNA PCR定量檢測，陽性率為58.76%（114/194）。HCV-Ab陽性率為63.92%（124/194）；HCV-cAg陽性檢出率為32.47%（63/194），HCV-Ab標志物陽性率顯著高于HCV-cAg（χ2=38.411，P<0.01），提示兩種檢測方法的診斷水平有差異。HCV-Ab的陽性檢出率更高，但對HCV-Ab陰性樣本，有5例HCV-cAg陽性，其中4例HCV-RNA PCR結(jié)果陽性，出現(xiàn)病毒復制（表1）。HCV-cAg與HCVAb在人體體內(nèi)的濃度轉(zhuǎn)換過程見圖1。

3 討論

目前，我國對HCV的篩查主要是ELISA檢測HCV-Ab[11]，初篩結(jié)果陰性，報告HCV-Ab陰性，不再進行復檢。初篩結(jié)果陽性，才進行后續(xù)的復檢程序。然而，ELISA檢測HCV-Ab具有一定的局限性，尤其是吸毒高危人群極易漏檢，原因有以下幾點[12-15]：①HCV-Ab檢測的PWP較長，平均為70 d；②與機體免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫缺陷、器官移植、血液透析、使用免疫抑制劑治療等免疫虛損患者，產(chǎn)生抗體的濃度極低，超出現(xiàn)有試劑ELISA的檢測下限；③為了防止高IgG血癥及類濕因子等的干擾，一般ELISA檢測HCV-Ab需稀釋樣本，加血清量較少，加樣器不準確也是可能漏檢的原因之一。

HCV-cAg與HCV-Ab是篩查HCV感染的兩種標志物，兩者在體內(nèi)的濃度存在相互主導轉(zhuǎn)換的一個過程，如圖1所示，感染早期，HCV-cAg幾乎與HCV-RNA同時出現(xiàn)，機體內(nèi)一定量的HCV-cAg不斷刺激機體產(chǎn)生抗體，幾乎所有的HCV-Ab全部與HCV-cAg結(jié)合，此時HCV-cAg過量，而ELISA只能檢測游離狀態(tài)的HCV-Ab或HCV-cAg，因此會出現(xiàn)HCV-Ab陰性，HCV-cAg陽性的情況，這也是兩者檢測PWP不同的原因之一[16]。隨著病情的發(fā)展，機體產(chǎn)生HCV-Ab濃度逐步升高，與HCV-cAg結(jié)合后，游離HCV-cAg濃度逐步下降，在病程的中后期，患者體內(nèi)的HCV-cAg全部被HCV-Ab結(jié)合形成免疫復合物，游離的HCV-cAg濃度低于檢測下限為陰性，而HCV-Ab濃度進一步升高，檢測則為陽性，因此，從患者感染HCV全程來看，單純依靠HCV-Ab或HCV-cAg標志物來檢測，極易可能造成漏檢或誤診。

實時熒光PCR定量檢測HCV-RNA 是診斷HCV感染的“金標準”，但由于其耗時長，實驗條件要求高，儀器和試劑貴，且RNA室溫易降解，結(jié)合我國國情，作為常規(guī)篩查手段，難以全面推廣。

綜上所述，不同檢測方法的檢測效果略有差異，臨床上可考慮HCV-cAg與HCV-Ab聯(lián)合檢測優(yōu)勢互補，對吸毒高危人群聯(lián)合篩查，將有效防止漏檢。

[參考文獻]

[1] 張艷輝，鮑宇剛，孫江平，等.我國15個城市吸毒人群HIV、梅毒螺旋體、丙型肝炎病毒感染現(xiàn)況[J].中華預防醫(yī)學雜志，2010，44（11）：969-974.

[2] Liang M，Wang L，Ma CX，et al.Sandwich immunoassay for hepatitis C virus non-structural 5A protein using a glassy carbon electrode modified with an Au-MoO3/chitosan nanocomposite[J].Anal Lett，2013，46（8）：1241-1254.

[3] Martins T，Narciso-Schiavon JL，Schiavon Lde L.Epidemiology of hepatitis C virus infection[J].Rev Assoc Med Bras，2011，57（1）：107-112.

[4] Chevaliez S.Virological tools to diagnose and monitor hepatitis C virus infection[J].Clin Microbiol Infect，2011，17（2）：116-121.

[5] 文育鋒，張振，齊少波，等.吸毒人群行為特征與梅毒、丙肝感染的相關(guān)性分析[J].皖南醫(yī)學院學報，2014，33（4）：362-364.

[6] 陳培杰，黃奇峰，謝玉程，等.蒼南縣吸毒者丙型肝炎感染狀況調(diào)查[J].浙江預防醫(yī)學，2010，22（6）：33-34.

[7] Xing XK，Li SJ，He JL，et al.Inhibition of hepatitis C virus replication by single and dual small interfering RNA using an HCV-infected cell model[J].Biotechnol Lett，2012，34（2）：295-301.

[8] Jiang L，Gu Y，Ye J，et al.Resveratrol prevents hepatic steatosis induced by hepatitis C virus core protein[J].Biotechnol Lett，2012，34（12）：2205-2212.

[9] Ergunay K，Sener B，Alp A，et al.Utility of a commercial quantitative hepatitis C virus core antigen assay in a diagnostic laboratory setting[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2011，70（4）：486-491.

[10] Lee SR，Peterson，J，Niven P，et al.Effficacy of a hepatitis C virus，core antigen enzyme-linked immuosorbent assay for the identification of 'window-phase' blood donations[J].Vox Sang，2001，80（1）：19-23.

[11] 劉艷明.ELISA與CMIA檢測血清中抗-HCV的比較[J].中國當代醫(yī)藥，2013，20（32）：104-105.

[12] 涂業(yè)桃.膠體金法與ELISA法在檢測丙型肝炎病毒抗體中的比較[J].醫(yī)學綜述，2014，20（20）：3836-3837.

[13] 朱紅艷，畢勝，楊曦，等.丙型肝炎病毒核酸和抗體檢測方法在人群篩查中的比較及應用[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2014，35（20）：2811-2812，2815.

[14] 胡芳.抗體ELISA檢測聯(lián)合丙肝病毒核心抗原檢測在丙肝治療中的意義[J].中外醫(yī)療，2014，33（25）：185-186.

[15] 王政.ELISA法和化學發(fā)光法對臍血中HIV-1/HIV-2抗體、梅毒抗體和丙肝抗體的檢測比較[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2014，30（36）：144-145.

[16] 王少敏，陳杰，謝圣高.慢性丙型病毒性肝炎患者血清sICAM-1與肝組織病理變化的相關(guān)性研究[J].中國當代醫(yī)藥，2009，16（25）：124-125.

（收稿日期：2015-11-30 本文編輯：許俊琴）