鎖陽對大鼠肝纖維化干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

李榮華，林友勝，王航宇，李卉園，黃小梅，唐琳梅，鄧峰美△

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都　610500); 2.石河子大學(xué) 藥學(xué)院(石河子　832000)

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鎖陽對大鼠肝纖維化干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

李榮華1，林友勝1，王航宇2，李卉園1，黃小梅1，唐琳梅1，鄧峰美1△

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都610500); 2.石河子大學(xué) 藥學(xué)院(石河子832000)

【摘要】目的觀察鎖陽對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的預(yù)防及逆轉(zhuǎn)作用。方法將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、鎖陽干預(yù)Ⅰ組、鎖陽干預(yù)Ⅱ組和鎖陽對照組5組，每組各10只。CCl4與花生油混合液造模，根據(jù)分組在不同時(shí)間給予鎖陽灌胃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取血清和肝組織，檢測血清肝功能，HE染色和Masson染色，觀察肝組織病理改變，流式細(xì)胞儀測大鼠血漿 CD3+、CD4+和CD8+水平。結(jié)果模型組大鼠肝組織纖維化分級主要以++++級為主，鎖陽干預(yù)Ⅰ組分級主要以++、+++級為主，鎖陽干預(yù)Ⅱ組分級主要以+、++為主。與正常對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT活性明顯升高，CD3+、CD4+水平降低，CD8+水平升高，肝臟指數(shù)升高。與模型組相比，鎖陽干預(yù)Ⅰ組大鼠血清中ALT活性降低，CD3+、CD4+水平升高，CD8+水平降低；鎖陽干預(yù)Ⅱ組中大鼠血清中AST、ALT活性明顯降低，CD3+水平升高，CD8+水平降低；兩組大鼠肝臟指數(shù)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論鎖陽對肝纖維化有一定的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)作用，同時(shí)能影響肝纖維化大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群，在一定程度上拮抗免疫功能低下。

【關(guān)鍵詞】鎖陽；肝纖維化；四氯化碳

肝纖維化(liver fibrosis,LF)是一種可逆的損傷-修復(fù)反應(yīng)，其特征是肝損傷后的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)異常增生[1]。如果肝損傷是急性或者自限性的，ECM的增生就是暫時(shí)的，肝臟的組織成分、細(xì)胞類型可恢復(fù)至正常狀態(tài)。如果損傷持續(xù)會造成慢性炎癥，進(jìn)而ECM增生，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞被瘢痕組織取代[2]，最終導(dǎo)致肝硬化，死亡率較高[3]。研究[4]表明，阻止或減慢肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，是治愈大多數(shù)慢性肝病患者的關(guān)鍵。因此，阻止肝纖維化的惡變，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)尤為重要。中藥在改善癥狀和減輕肝臟病理改變方面優(yōu)于西藥。鎖陽作為傳統(tǒng)的中藥，對很多疾病有治療效果，被稱為“藥中之寶”[5]。本課題組在對鎖陽的研究基礎(chǔ)[6-7]上，分離出15種單體，發(fā)現(xiàn)單體Songarin A對肝損傷細(xì)胞模型有保護(hù)作用[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用鎖陽對肝纖維化大鼠進(jìn)行干預(yù)，探討鎖陽對大鼠肝纖維化的作用，為今后鎖陽用于臨床治療肝纖維化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

秋水仙堿(每1 mL蒸餾水中加入0.1 mg秋水仙堿粉末，制成水溶液)(云南玉藥生物制藥有限公司)；四氯化碳(CCl4)分析純AR(成都科龍化工試劑廠)；鎖陽(新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院提取配制，濃度為30 mg/mL)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒(南京建成生物公司)；CD4+/CD8+/CD3+抗體(美國BD公司)；蘇木精與伊紅(武漢博士德公司)；二甲苯與酒精(成都迎輝化工有限公司)。Roche Modular D2400 生化分析儀(瑞士Roche公司)；離心機(jī)HC-2518(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；BH-2型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。雄性SD大鼠50只，SPF級別，體質(zhì)量160～180 g，購自成都達(dá)碩公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2013-024。控制室內(nèi)溫度為(20±2) ℃，相對濕度35%～40%，明暗各12 h(明7:00～19:00，暗19:00～7:00)，自來水自由飲用，常規(guī)飼料。大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周，稱重。

1.2造模與給藥

大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、鎖陽干預(yù)Ⅰ(提前給藥)組、鎖陽干預(yù)Ⅱ(邊造模邊給藥)組和鎖陽對照組5組，每組10只。正常對照組與鎖陽對照組大鼠前6周3 mL/kg，2次/周，皮下注射花生油；后6周，正常對照組大鼠給予生理鹽水，鎖陽對照組大鼠給予鎖陽(200 mg/kg)灌胃，1次/d，持續(xù)6周；模型組大鼠以3 mL/kg(實(shí)驗(yàn)首次5 mL/kg)，2次/周，皮下注射由CCl4和花生油按照4∶6配成的混合液，復(fù)制肝纖維化模型，后6周等容生理鹽水灌胃，1次/d；鎖陽干預(yù)Ⅰ組大鼠前6周以200 mg/kg，1次/d，灌胃鎖陽；后6周復(fù)制模型；鎖陽干預(yù)Ⅱ組大鼠邊造模邊以200 mg/kg，1次/d， 灌胃鎖陽。

在喂食大鼠飼料、造模操作和給藥操作的時(shí)候稱重，并對大鼠的毛色、精神、行為、飲食量和攝水量等一般情況進(jìn)行觀察記錄。

1.3取材

取材前24 h禁食不禁水，所有動物稱重。取大鼠靜脈血3 mL放置于1 mL靜脈血加20 μL 7.5%EDTA混合的抗凝管中，混勻，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測；將大鼠固定，腹腔注射水合氯醛麻醉，開腹后用5 mL注射器腹主動脈取血，2 mL注入血常規(guī)無菌真空采血管；剩余血液分裝到1.5 mL EP管中，靜置至血液凝固后離心分裝放置于-20 ℃冰箱。采血時(shí)避免血液滴到EP管壁，發(fā)生溶血。轉(zhuǎn)移血液時(shí)，盡量減少震蕩，以免溶血。離心機(jī)提前15 min預(yù)熱；將肝臟取出后，去除系膜，用冷生理鹽水沖盡殘血，濾紙吸干。

觀察大鼠肝臟光滑度、顏色和硬度等。稱重，并按照下述公式計(jì)算肝臟指數(shù)。

1.4肝功能檢測

按照試劑盒說明，測AST和ALT的活性。

1.5流式細(xì)胞術(shù)

取抗凝靜脈全血3 mL，加于等量淋巴細(xì)胞分層液上層(注意不要破壞液體的交界面)。2 500 r/min離心10 min后，液體分為4層，用吸管小心吸取中間白色細(xì)胞層于新的離心管中。加入pH 7.2～7.4的PBS 3 mL混勻后1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μLPBS混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整各待測管細(xì)胞濃度。取100 μL上述抗凝血加入流式管中，加入5 μL CD4+/CD8+/CD3+抗體。加入2 mL的1×溶血素后輕輕搖動，并在室溫下避光孵育15 min。離心15 min，力度200 g，取上清(注意不要觸動下面的沉淀)。加入2 mL的1×PBS，洗滌淋巴細(xì)胞。離心5 min，力度200 g。輕輕吸出上清液，加入0.5 mL的1×PBS，重新懸浮細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.6HE染色與Masson染色

取肝組織，進(jìn)行常規(guī)脫水，包埋。連續(xù)冠狀位切片，切片厚度4 μm，進(jìn)行HE和Masson染色。HE染色后，肝組織中細(xì)胞核呈現(xiàn)出藍(lán)紫色，細(xì)胞漿呈紅色。Masson染色后，肝組織中膠原纖維呈藍(lán)色。用顯微鏡觀察拍照，觀察肝臟組織學(xué)變化并對大鼠肝組織進(jìn)行評分。

《肝纖維化分期半定量評估系統(tǒng)，Ishak》方法：-：無纖維化；+：有些匯管區(qū)纖維化，纖維隔短；++： 匯管區(qū)纖維化，纖維隔形成；+++：多數(shù)匯管區(qū)纖維化，偶有匯管區(qū)橋接纖維化；++++：匯管區(qū)纖維化，伴有明顯的匯管-匯管橋接纖維化和匯管-中央橋接纖維化。評估大鼠纖維化情況。按-為0分， +為1分，++為2分， +++為3分，++++為4分計(jì)，按積分制標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行比較。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1一般情況比較

正常對照組大鼠皮毛保持光滑有亮澤，喜歡活動，經(jīng)常打斗，飲食正常，無死亡，10只；鎖陽對照組較正常對照組大鼠體格更健壯，反應(yīng)更靈敏，活動度更高，無死亡，10只；模型組大鼠則出現(xiàn)不同程度的精神不振，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食飲水逐漸減少，毛色晦暗，毛發(fā)略顯紊亂，尿黃臭，糞便稀薄，缺乏光澤，死亡2只，余8只；鎖陽干預(yù)Ⅰ組與模型組大鼠相比，飲食、毛色等狀態(tài)好，皮膚潰爛后愈合較快，死亡1只，余9只；鎖陽干預(yù)Ⅱ組大鼠給藥后食欲、精神狀態(tài)亦隨之好轉(zhuǎn)，余9只。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的體質(zhì)量變化情況：正常對照組大鼠體質(zhì)量基本屬于穩(wěn)定增長；模型組大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降；鎖陽干預(yù)Ⅰ組大鼠在進(jìn)食鎖陽后體質(zhì)量上升，在隨后的造模期間，體質(zhì)量下降；鎖陽干預(yù)Ⅱ組大鼠在造模期間體質(zhì)量下降，給藥和造模結(jié)束后，體質(zhì)量平穩(wěn)，變化不大；鎖陽對照組大鼠在進(jìn)食鎖陽后，體質(zhì)量上升(圖1)。

圖15組大鼠的體質(zhì)量變化比較

2.2大鼠血清肝功能指標(biāo)的變化

與正常對照組相比，模型組大鼠血清中AST、ALT活性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，鎖陽干預(yù)Ⅰ、Ⅱ組大鼠血清中ALT活性降低，鎖陽干預(yù)Ⅱ組大鼠血清中AST活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3大鼠血清中CD3+、CD4+、CD8+水平的變化

與正常對照組比較，模型組大鼠的血清中T淋巴亞群CD3+、CD4+比例降低，CD8+比例提高，存在明顯的免疫功能低下，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鎖陽對照組大鼠血清中的CD3+、CD4+比例與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鎖陽各組大鼠血清中的CD3+、CD4+水平提高，CD8+水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.4大鼠肝臟大體觀察

正常對照組大鼠肝臟顏色鮮艷，表面光滑，質(zhì)地柔軟；鎖陽對照組大鼠肝臟表面更加鮮亮，質(zhì)地更加松軟；模型組大鼠肝臟顏色明顯發(fā)白，邊緣鈍，表面粗糙，呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地僵硬；鎖陽干預(yù)Ⅰ組大鼠肝臟比模型組稍好，但有很多結(jié)節(jié)，光滑度弱；鎖陽干預(yù)Ⅱ組大鼠肝臟光澤恢復(fù)，邊緣銳圓(圖2)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖25組大鼠肝臟大體標(biāo)本比較

注：A：正常對照組；B：模型組；C：鎖陽干預(yù)Ⅰ組；D：鎖陽干預(yù)Ⅱ組；E：鎖陽對照組

2.5大鼠肝臟指數(shù)的變化

與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鎖陽各組肝臟指數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.6大鼠肝臟病理組織學(xué)的變化

HE染色可以觀察到正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞正常，匯管區(qū)及匯管區(qū)周圍未見小膽管及纖維組織增生；模型組大鼠正常肝小葉結(jié)構(gòu)有破壞，肝細(xì)胞脂肪沉積，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)空泡狀，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝纖維化明顯；鎖陽給藥組大鼠肝組織病理情況好轉(zhuǎn)，僅有部分細(xì)胞脂肪空泡；鎖陽對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，小葉內(nèi)肝細(xì)胞基本正常，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰(圖3)。Masson染色可以看到正常對照組大鼠肝組織在匯管區(qū)有極少膠原纖維的表達(dá)，細(xì)胞索排列非常整齊；模型組大鼠肝組織有假小葉生成，纖維間隔著色明顯，膠原沉積，肝纖維化明顯；鎖陽給藥干預(yù)后，變性細(xì)胞和膠原沉積減少，肝纖維化程度減輕；鎖陽對照組大鼠肝組織基本上沒有膠原的表達(dá)，細(xì)胞排列整齊(圖4)。

2.7大鼠肝纖維化程度分級

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織纖維化評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鎖陽干預(yù)Ⅰ組和干預(yù)Ⅱ組大鼠肝組織纖維化評分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖35組大鼠肝組織 HE 染色結(jié)果比較(×10)

注：A:正常對照組；B:模型組；C:鎖陽干預(yù)Ⅰ組；D:鎖陽干預(yù)Ⅱ組；E:鎖陽對照組

圖45組大鼠肝組織 Masson染色結(jié)果比較(×10)

注：A：正常對照組；B：模型組；C：鎖陽干預(yù)Ⅰ組；D：鎖陽干預(yù)Ⅱ組；E：鎖陽對照組

3討論

肝纖維化的發(fā)生是由多種致病因子共同介導(dǎo)的病理過程。本實(shí)驗(yàn)研究鎖陽對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用。CCl4在肝臟中產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對大鼠肝臟造成損傷。取材后，計(jì)算肝臟指數(shù)，它是動物功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，且根據(jù)肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)可以判斷肝臟病變的性質(zhì)和程度。選取可準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞炎癥活動和壞死的AST、ALT肝功能指標(biāo)進(jìn)行檢測。HE染色技術(shù)染色穩(wěn)定，是最常用且可靠的診斷方法。Masson染色常用于膠原纖維和肌纖維的鑒別，對肝纖維化程度的判斷具有直觀性，因此本研究對各組大鼠肝組織進(jìn)行了這兩種方法的染色。其結(jié)果顯示：模型組大鼠肝臟指數(shù)增大，大鼠肝臟顏色發(fā)黃，表面粗糙，呈顆粒狀，極其僵硬；AST、ALT的活性高于正常組；病理切片顯示其組織發(fā)生細(xì)胞變性、纖維組織生成等改變，造模成功。

淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。成熟的T細(xì)胞分布于外周免疫器官的胸腺依賴區(qū)，并可經(jīng)淋巴管、外周血和組織液等進(jìn)行再循環(huán)，發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)的功能。T細(xì)胞的再循環(huán)有利于廣泛接觸進(jìn)入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，加強(qiáng)免疫應(yīng)答，較長期保持免疫記憶。T細(xì)胞的細(xì)胞膜上有許多不同的標(biāo)志，主要是表面抗原和表面受體。這些表面標(biāo)志都是結(jié)合在細(xì)胞膜上的巨蛋白分子[9]。CD3+、CD4+和CD8+是T淋巴細(xì)胞的3個(gè)主要亞群。CD3+分子表達(dá)在T細(xì)胞上，是T細(xì)胞的重要標(biāo)記物；輔助T細(xì)胞的主要表面標(biāo)志是CD4+，CD4+細(xì)胞可協(xié)助B細(xì)胞分泌抗體和調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞的免疫應(yīng)答；細(xì)胞毒T細(xì)胞的主要表面標(biāo)志是CD8+，也被稱為殺手T細(xì)胞，它常表現(xiàn)為細(xì)胞毒活性，是主要的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞[10]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性病毒性肝炎患者多出現(xiàn)機(jī)體免疫功能失調(diào)，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞減少，CD8+T細(xì)胞增多。CD8+T細(xì)胞在攻擊病原體感染肝細(xì)胞同時(shí)加重肝組織損傷[11]。本研究部分實(shí)驗(yàn)表明，與模型組比較，鎖陽各組大鼠CD3+、CD4+水平提高，CD8+水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，鎖陽干預(yù)Ⅰ組的CD4+水平高于干預(yù)Ⅱ組，鎖陽對照組的結(jié)果優(yōu)于正常對照組，提示在一定程度上，鎖陽能影響大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例。

本研究觀察到提前給藥組比模型組的大鼠肝臟外觀光滑，邊造模邊給藥組大鼠肝臟更優(yōu)；在提前給藥組和邊造模邊給藥組，其大鼠血清中AST和ALT的活性均有減弱；HE和Masson染色結(jié)果顯示，相比模型組，提前給藥組和邊造模邊給藥組大鼠肝細(xì)胞變性與大鼠肝纖維增生情況明顯改善，說明鎖陽對肝纖維化存在一定的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)作用。2009年有研究[12]發(fā)現(xiàn)鎖陽可以通過增加血液端粒長度使小鼠長壽；3年后，有一項(xiàng)在果蠅上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的研究[13]稱，鎖陽能延緩衰老，延長壽命。

綜上所述，提前給大鼠灌胃鎖陽能保護(hù)肝臟；在造模過程中用鎖陽干預(yù)能逆轉(zhuǎn)肝纖維化，減弱肝纖維化的進(jìn)程；鎖陽對照組結(jié)果說明：正常大鼠對鎖陽不會出現(xiàn)異常反應(yīng)，甚至能提高免疫細(xì)胞的比例。

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Experimental Study of Intervention Effects of Cynomorium Songaricum on Liver Fibrosis of Rats

LiRonghua1,LinYousheng1,WangHangyu2,LiHuiyuan1,HuangXiaomei1,TangLinmei1,DengFengmei1△.

1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

【Key words】Cynomorium songaricum; Liver fibrosis; Carbon tetrachloride

【Abstract】ObjectiveTo observe the preventive and reversal effects of Cynomorium songaricum on liver fibrosis of rats induced by carbon tetrachloride (CCl4). MethodsSD rats were randomly divided into the normal control group, the model group, the Cynomorium songaricum intervention Ⅰ group, the Cynomorium songaricum intervention Ⅱ group and the Cynomorium songaricum control group. Each group consisted of 10 rats, which were injected subcutaneously with the mixture of carbon tetrachloride and peanut oil to make the models of liver fibrosis. Then the rats were given Cynomorium songaricum via intragastric administration at different time in the different groups respectively. Serum and livers were collected after all the rats were sacrificed at the end of the experiment. Hematoxylin and eosin red (HE) staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of liver tissue, and flow cytometry was used to measure the levels of CD3+, CD4+and CD8+in the plasma. Results According to the grading of liver fibrosis, liver tissue of the rats in the model group mainly belong to grade ++++, the liver tissue of the rats in the Cynomorium songaricum intervention Ⅰ group were mainly in grade ++ and grade +++ and the liver tissue of the rats in the Cynomorium songaricum intervention Ⅱ group were mainly in grade + and grade ++. Compared with the normal control group, the activities of AST and ALT in the serum of the rats in the model group were significantly increased, the levels of CD3+and CD4+were reduced, the level of CD8+was increased, and the liver index was elevated. Compared with the model group, the activities of ALT in the serum of rats in the Cynomorium songaricum intervention Ⅰ group was lower, the levels of CD3+and CD4+were higher,and the level of CD8+was lower; The activities of AST and ALT in the serum of rats in Cynomorium songaricum intervention Ⅱ group was lower, the levels of CD3+and CD4+were higher, and the level of CD8+was lower; The liver index of rats in both intervention groups were decreased. All the differences mentioned above were statistically significant (P<0.05). ConclusionCynomorium songaricum has good preventive and reversal effects on liver fibrosis. Meanwhile, it has certain effects on T lymphocyte subgroups in peripheral blood of rats with liver fibrosis and it can improve their immune hypofunction to a certain degree.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.002

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81560566)

通信作者：△鄧峰美，E-mail: dengfm2004@163.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1645.038.html

·論著·