豬MC4R基因突變體真核表達載體的構(gòu)建及功能研究

韓立強，郭豫杰，魯維飛，張　欣，褚貝貝，王　江，楊國宇，3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點實驗室，鄭州 450002； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，武漢 430070； 3.河南省現(xiàn)代畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002)

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豬MC4R基因突變體真核表達載體的構(gòu)建及功能研究

韓立強1，郭豫杰1，魯維飛1，張欣2，褚貝貝1，王江1，楊國宇1，3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點實驗室，鄭州 450002； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，武漢 430070； 3.河南省現(xiàn)代畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002)

摘要：為研究MC4R基因不同突變體的功能差異，本研究從豬肌肉組織中克隆得到MC4R基因的編碼序列，將克隆片段與pcDNA3.1真核表達載體進行KpnⅠ 和EcoR Ⅰ雙酶切，連接形成重組表達載體MC4R1，將載體轉(zhuǎn)染BHK細胞后Western blotting 檢測蛋白表達。通過點突變法得到MC4R基因在707/892位點的3個突變載體，將突變載體瞬時轉(zhuǎn)染到BHK細胞，采用免疫熒光對細胞進行標(biāo)記，通過激光共聚焦顯微鏡和流式細胞檢測熒光表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆的MC4R1基因序列長度大約1 000 bp，在707/892位點序列為G/G，將構(gòu)建的真核表達載體MC4R1轉(zhuǎn)染BHK細胞，經(jīng)過Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)MC4R1蛋白正常表達；通過點突變法得到在707/892位點突變的突變載體MC4R2(G/A)、MC4R3(A/G)、MC4R4 (A/A)，經(jīng)過激光共聚焦觀察熒光表達后發(fā)現(xiàn)，突變受體在細胞膜上均有正常表達，流式檢測發(fā)現(xiàn)4個突變受體表達的熒光平均強度并沒有顯著差異(P>0.05)。通過構(gòu)建MC4R基因突變載體后發(fā)現(xiàn)，707/892位點突變對于MC4R受體在細胞膜的表達沒有顯著影響，其具體機制作用還需深入研究。

關(guān)鍵詞：豬；黑素皮質(zhì)素受體-4；突變體；表達

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇和全基因選擇育種方式越來越受關(guān)注，而對于控制動物性狀的功能基因的篩選和深入研究也成為熱點，黑素皮質(zhì)素受體-4 (MC4R)基因是豬育種的重要候選基因[1]。MC4R是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類肽類物質(zhì)，屬于含7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體。MC4R是一個單拷貝基因，僅含有一個外顯子，其編碼序列長度為996 bp，編碼322個氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中黑皮素支路的傳導(dǎo)途徑，在機體內(nèi)通過與內(nèi)源性激動劑α-MSH及拮抗劑Agouti蛋白的相互作用，調(diào)控機體的能量代謝和食欲[2-3]。

多項研究發(fā)現(xiàn)，MC4R基因的突變與機體的肥胖癥、胰島素水平及脂代謝水平相關(guān)。人MC4R基因突變與肥胖癥和II型糖尿病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[4]。敲除MC4R基因的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)多食、肥胖、胰島素分泌多等癥狀[5]；有研究發(fā)現(xiàn)，豬MC4R基因序列中892位點的錯義突變A/G(Asp298Asn)能夠?qū)е率荏w與α-MSH親和力下降，與豬脂肪沉積(如背膘厚)和生長速度(如測定期平均日增重)具有顯著關(guān)聯(lián)[6]。這種效應(yīng)在多個不同遺傳背景的豬群中得以驗證，但在其他一些豬群中尚未確證[7]，因此它是否為真正的QTN仍處于爭論之中。B.Fan等在豬MC4R基因內(nèi)識別出5個新的SNPs，新發(fā)現(xiàn)的SNPs亦與脂肪沉積、平均日增重存在顯著關(guān)聯(lián)[8]。這些基因突變特別是其中的707位點的錯義突變(Arg236His)對于MC4R受體的功能又具有什么樣的作用目前還不清楚。

本研究針對MC4R核酸序列的707/892位點的突變，構(gòu)建MC4R突變真核表達載體，通過轉(zhuǎn)染細胞后研究突變載體的功能差異，對于揭示MC4R在豬的基因育種方面的機制具有一定的意義。

1材料與方法

1.1材料

Lipofectamine2000(Invitrogen)，Star XL擴增 酶、DNA A-Tailing 試劑盒(TaKaRa)，DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Tigen)，DPNⅠ、KpnⅠ、EcoR Ⅰ內(nèi)切酶(Thermo)，pcDNA3.1(+)真核表達載體(實驗室自有)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青)，Opti-mem無血清培養(yǎng)基(Gibco)，0.25%胰酶(上海吉泰)，c-MYC Antibody(9E10)(Santa Cruz)，Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(Invitrogen)，抗熒光封片淬滅液(碧云天)，細胞培養(yǎng)板(Corning)，二氧化碳培養(yǎng)箱、PCR儀(Thermo)，ImageQuantLAS4000生物分子成像儀(GE)，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 5 PASCAL)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2方法

1.2.1豬MC4R基因的克隆采用DNA提取試劑盒從成年大白豬的肌肉組織中提取總DNA，設(shè)計引物(表1)，引物序列中含有c-Myc標(biāo)簽蛋白的核酸序列及KpnⅠ和EcoR Ⅰ的酶切位點，用高保真Star XL擴增酶進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，將回收核酸片段采用加A試劑盒加polyA尾巴后，連接到pMD18T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，進行篩選，獲得陽性克隆，送上海生工測序，獲得MC4R序列。

1.2.2MC4R基因真核載體的構(gòu)建將測序正確的MC4R質(zhì)粒分別進行KpnⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切，酶切體系為酶各0.5 U，質(zhì)粒1 μg，Buffer 1 μL，超純水6 μL，在37 ℃酶切過夜，切膠回收，同時將pcDNA3.1(+)真核表達載體進行同樣的雙酶切回收，將目的基因的回收片段與載體回收片段在T4 連接酶的作用下進行連接，將連接片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后篩選陽性克隆，將陽性克隆擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行酶切驗證，將驗證正確的質(zhì)粒測序，獲得序列正確的重組載體MC4R1，準(zhǔn)備進行細胞轉(zhuǎn)染表達。

表1MC4R基因克隆引物及點突變引物

Table 1Primers for theMC4Rgene clone and mutation

基因Gene引物(5'-3')PrimerMC4R-cloneF-GGGGGTACCGCCACCATGGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGAACTCAACCCATCACR-CCGGAATTCTTAATATCTGCTAGACAAATCMC4R-muta-tion(707)F-GGCACTGGCACCATCCACCAAGGTGCCAACATGR-CATGTTGGCACCTTGGTGGATGGTGCCAGTGCCMC4R-muta-tion(892)F-GTAATTCCATCATCAATCCCCTGATTTATGCACTCR-GAGTGCATAAATCAGGGGATTGATGATGGAATTAC

引物序列中酶切位點用方框表示，c-Myc標(biāo)簽序列用下劃線表示

In primer sequences，the boxes represent restriction sites and underlines represent c-Myc tag sequences

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染將培養(yǎng)好的BHK細胞經(jīng)胰酶消化后，按比例分散培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)板中，等到細胞達到80%的融合度時，棄去培養(yǎng)基，配置轉(zhuǎn)染試劑(Opti-mem+質(zhì)粒+Lipofectamine2000)，室溫孵育20 min后，加入24孔板，轉(zhuǎn)染6 h后，棄去轉(zhuǎn)染試劑，更換新鮮培養(yǎng)基，同時以空載體作為對照組，培養(yǎng)過夜后進行Western blotting 檢測。

1.2.4Western blotting 檢測MC4R蛋白表達將轉(zhuǎn)染后的細胞板中細胞用PBS洗 3遍，然后每孔加入裂解液150 μL RIPA(1%PMSF)，吹打細胞，收集到離心管中，冰浴30 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清加入20%的蛋白上樣buffer在100 ℃煮10 min，得到細胞蛋白提取液，進行Western blotting檢測蛋白表達，以GAPDH作為內(nèi)參，ECL顯影后在生物分子成像儀內(nèi)成像分析。

1.2.5MC4R基因4個不同突變體真核載體的構(gòu)建針對MC4R克隆序列，分別在707、892位點處設(shè)計點突變引物(表1)，以克隆質(zhì)粒20倍稀釋為模板進行PCR，Star XL 0.4 μL，buffer 4 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.2 μL，模板1 μL，加水體積到20 μL，PCR循環(huán)數(shù)為15，同時做陰性對照(加模板不加引物)，反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物1 μL，加入DpnⅠ酶1 μL，37 ℃酶切過夜，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，鋪板挑選陽性菌(陰性對照板上不長菌)。將陽性菌送上海生工測序，驗證突變效果。將測序突變正確的序列分別進行KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切，切膠回收后與pcDNA3.1載體回收片段在T4 連接酶的作用下進行連接，形成不同突變序列的MC4R真核表達載體，將連接片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后篩選陽性克隆，將陽性克隆擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，測序驗證序列的正確性，獲得正確的突變序列，準(zhǔn)備進行細胞轉(zhuǎn)染表達和免疫熒光觀察。

1.2.6MC4R基因不同突變載體的免疫熒光觀察在24孔板中加入細胞爬片，接種BHK細胞，細胞培養(yǎng)過夜后，將4種突變載體質(zhì)粒MC4R1～MC4R4分別轉(zhuǎn)染細胞，24 h后將細胞用PBS洗3次，每次5 min；棄去PBS，4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗3次，每次5 min；棄去PBS，對細胞直接用封閉液(90%PBS+10%胎牛血清)封閉1 h；棄封閉液，一抗c-MYC Antibody(9E10)(1∶250)4 ℃過夜，PBS洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(1∶500)室溫避光孵育1 h；PBS洗3次，在熒光顯微鏡下檢測是否有熒光表達；暗室中將細胞爬片夾出，在載玻片上滴加一滴抗熒光封片淬滅液，將細胞爬片有細胞一側(cè)扣在淬滅液上，爬片周圍用封片劑進行封片，晾干放4 ℃，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達。1.2.7流式細胞法檢測不同突變載體的熒光表達將4種突變載體質(zhì)粒MC4R1～MC4R4分別轉(zhuǎn)染細胞，以空載體作為對照，培養(yǎng)48 h后用胰酶消化，將細胞移入1.5 mL離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，加入預(yù)冷的PBS洗滌1次，離心，1 mL 4%多聚甲醛室溫固定20 min，離心洗滌，加入封閉液室溫封閉1 h，離心洗滌，加入一抗c-MYC Antibody(9E10)，4 °C過夜孵化，離心洗滌細胞，標(biāo)記熒光二抗Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)，輕輕吹打混勻，室溫避光孵育1 h，洗滌細胞，將細胞重新懸浮于500 μL PBS中，輕輕混勻，置流式管中上機檢測，試驗重復(fù)3次，計算陽性細胞數(shù)和平均熒光強度數(shù)值，利用SPSS軟件對各個突變體間的熒光強度差異進行顯著性檢驗。

2結(jié)果

2.1MC4R1基因的克隆

以提取的豬肌肉組織DNA作為模板進行PCR，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳后發(fā)現(xiàn)，在大約1 000 bp處有明顯的目的條帶(圖1)，回收后經(jīng)測序確認所得條帶的序列與MC4R1基因標(biāo)準(zhǔn)序列相符，其中在707/892位點的序列為G/G。

圖1　MC4R基因的PCR結(jié)果Fig.1　PCR amplification result of MC4R gene

2.2MC4R1基因真核載體的構(gòu)建

將獲得的真核表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行酶切驗證，形成大約5 400 bp 的pcDNA3.1載體片段和大約1 000 bp的MC4R1目的基因片段(圖2)，表明載體構(gòu)建成功。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.原質(zhì)粒；2.質(zhì)粒雙酶切M.Marker；1.MC4R1 vector；2.Digestion of MC4R1 vector by KpnⅠand EcoR Ⅰ圖2　MC4R1真核載體質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2　Double restriction enzyme digestion and identification of MC4R1 eukaryotic expression vector

+.MC4R1組；-.對照組+.Group of MC4R1 vector；-.Group of pcDNA3.1圖3　MC4R1蛋白表達的Western blotting檢測Fig.3　The protein expression of MC4R1 by Western blotting

2.3Western blotting 檢測MC4R1蛋白表達

對轉(zhuǎn)染后的細胞提取蛋白進行Western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)參GAPDH在試驗組和對照組細胞內(nèi)都有正常表達，MC4R1蛋白在試驗組細胞內(nèi)正常表達，在對照組細胞(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體)內(nèi)沒有檢測到MC4R1蛋白的表達(圖3)，結(jié)果表明真核載體MC4R1構(gòu)建成功。

2.4MC4R基因突變真核載體的構(gòu)建

將T載體上的MC4R序列經(jīng)過點突變后，用KpnⅠ、EcoR Ⅰ進行雙酶切，獲得大約1 000 bp的目的片段和大約2 600 bp的T載體片段(圖4)，然后分別將目的片段回收后與pcDNA3.1真核表達載體酶切片段進行連接，轉(zhuǎn)化后得到陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行測序驗證后獲得在707/892位點突變的3個突變載體MC4R2 (G/A)、MC4R3 (A/G)、MC4R4 (A/A)。

2.5MC4R基因不同突變載體的免疫熒光觀察

將構(gòu)建好的MC4R基因4個突變真核載體分別轉(zhuǎn)染BHK細胞后，進行免疫熒光標(biāo)記，標(biāo)記后采用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)熒光主要在細胞膜上顯示(圖5)，表明此時MC4R受體基因在細胞膜上正常表達。

2.6流式細胞法檢測不同突變載體的熒光表達

通過流式細胞儀檢測MC4R1～MC4R4載體染后陽性細胞的平均熒光強度(圖6)，與MC4R1、MC4R2和MC4R4相比，MC4R3的陽性細胞平均熒光強度有所增加，但通過顯著性檢驗后發(fā)現(xiàn)4種受體的陽性細胞熒光強度之間無顯著性差異(P>0.05)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.突變體MC4R2；2.突變體MC4R3；3.突變體MC4R4M.Marker；1.Mutations of MC4R2；2.Mutations of MC4R3；3.Mutations of MC4R4圖4　MC4R不同突變體雙酶切鑒定圖Fig.4　Double restriction enzyme digestion and identification of MC4R mutations by KpnⅠ and EcoR Ⅰ

3討論

自從I.Gantz在1993年克隆了人的MC4R基因[9]，MC4R已經(jīng)分別從大鼠、小鼠、豬、羊、牛和一些其他的靈長類動物組織中克隆到序列，比對發(fā)現(xiàn)氨基酸序列在這些物種間是高度保守的[10]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有5種黑皮質(zhì)素受體(MCRs)介導(dǎo)黑皮質(zhì)素的作用，根據(jù)它們的序列被發(fā)現(xiàn)的次序，分別命名為MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R[11]，MC4R主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達，能夠調(diào)控能量平衡和攝食[12]。本研究中，通過設(shè)計引物對豬MC4R基因進行克隆，經(jīng)測序獲得正確的豬MC4R基因序列，轉(zhuǎn)染細胞后經(jīng)過Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)MC4R1蛋白表達正常，表明載體構(gòu)建成功。

圖5　MC4R1～MC4R4的免疫熒光觀察Fig.5　Fluorescence observation of MC4R1-MC4R4 vectors

A.陽性細胞；B.平均熒光強度A.Positive cells;B.MFI圖6　MC4R1～MC4R4的熒光強度檢測Fig.6　Fluorescence intensity of MC4R1-MC4R4 vectors

真核細胞內(nèi)基因的編碼序列發(fā)生突變可能會引起基因功能的改變。MC4R作為一種膜蛋白受體，突變基因的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物可能通過以下幾種方式影響受體功能：①受體在細胞表面表達缺陷；②受體與配體親和力下降；③受體與配體結(jié)合后與G蛋白偶聯(lián)過程異常，無法產(chǎn)生相應(yīng)cAMP[13-14]。在本研究中，針對豬MC4R基因的主要突變位點，通過點突變的方法獲得4個MC4R的錯義突變真核表達載體，這4個突變體在707/892位點的基因序列分別為G/G、G/A、A/G、A/A，相對應(yīng)的氨基酸序列改變?yōu)锳rg/Asp、Arg/Asn、His/Asp、His/Asn。本研究對這4種突變體在細胞上的表達進行了功能鑒定。MC4R作為一種膜受體，抗體主要對細胞膜上的表達蛋白進行標(biāo)記，所以當(dāng)細胞膜顯示綠色熒光(圖5)時，即表明載體表達出的MC4R蛋白受體在細胞膜上都能夠正常表達。通過流式細胞儀檢測受體的表達量，發(fā)現(xiàn)4種突變體轉(zhuǎn)染后的陽性細胞在細胞膜上的熒光表達值沒有差異(圖6)，表明707/892位點突變沒有對細胞表面的受體表達產(chǎn)生缺陷，因此其引起的功能差異可能更傾向于與配體結(jié)合及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。

其他研究中對人MC4R基因中20個位點進行基因突變，激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，其中很多位點在細胞膜上的表達正常，而在配體偶聯(lián)和信號傳導(dǎo)方面功能異常[15]。MC4R受體作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，與其配體結(jié)合能夠啟動G蛋白偶聯(lián)的信號系統(tǒng)，活化腺苷酸環(huán)化酶，引起細胞內(nèi)cAMP上升，介導(dǎo)細胞的一系列生理生化活動，而突變MC4R蛋白此能力可能會有所變化。關(guān)于豬MC4R突變體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究，K.S.Kim等[6]采用I標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)豬MC4R在892位點的突變能夠減少MC4R受體產(chǎn)生cAMP的功能，而其他研究在293細胞上分析了892位點的突變對于MC4R受體的結(jié)合性及與G蛋白偶聯(lián)產(chǎn)生cAMP的功能影響，發(fā)現(xiàn)這兩種突變對于MC4R受體的功能沒有影響[16]，這些相互矛盾的結(jié)果還需要后續(xù)的研究進行辨別，特別是其中的差異是不是由于在707位點(Arg236His)的突變引起的連鎖變化，現(xiàn)在還不得而知。顯然，構(gòu)建707/892位點突變載體來研究這些突變對于MC4R受體與配體的結(jié)合及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，對于更加深入的理解豬MC4R基因突變在基因組和遺傳方面的功能差異具有一定的科學(xué)價值。

致謝：本研究在試驗條件方面得到了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室的大力支持，在此表示感謝。

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(編輯郭云雁)

Construction and Function Confirmation of MC4R Gene Eukaryotic Expression Vector with Different Mutations

HAN Li-qiang1，GUO Yu-jie1，LU Wei-fei1，ZHANG Xin2，CHU Bei-bei1，WANG Jiang1，YANG Guo-yu1，3*

(1.KeyLaboratoryofAnimalBiochemistryandNutritionofMinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.KeyLaboratoryofAgriculturalAnimalGenetics，BreedingandReproductionofMinistryofEducation，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China；3.HenanCollaborativeInnovationCenterofModernAnimalHusbandry，Zhengzhou450002，China)

Abstract:To investigate the function difference of the different Melanocortin-4 receptor (MC4R) gene mutants，the complete coding sequence( CDS) ofMC4Rgene were cloned from pig muscle tissues.The CDS sequence was linked with pcDNA3.1 vector by digested with restriction endonuclease ofKpnⅠ andEcoR Ⅰ and the recombinant eukaryotic expression vectorMC4R1 was constructed.After recombinantMC4R1 plasmid transfected into BHK cells，the protein expression of MC4R1 was confirmed by Western blotting.Simultaneously，3 site-directedMC4RcDNA mutant (707/892 site) vectors were generated.The protein expression of MC4R mutations vector was observed in transiently transfected BHK cell by Laser Scanning Confocal Microscopy and Flow Cytometry ananlysis.The results indicated that the CDS sequence ofMC4R1 gene was about 1 000 bp and the sequence of 707/892 site was G/G.The protein expression of MC4R1 was confirmed in BHK cells using Western blotting.Three site-directed mutant eukaryotic vectorMC4R2，MC4R3，MC4R4 were constructed and the sequence of 707/892 site was G/A，A/G，A/A，respectively.Confocal microscopy showed that every mutant ofMC4Rreceptor were expressed well on the cell surface by the Immunofluorescence.There were no significant difference of the fluorescence intensity between mutants of MC4R receptors(P>0.05)by FCM.The construction and functional research ofMC4Rvector suggest that the mutants of 707/892 site has no significant impact on the expression of MC4R receptor on cell surface.This will provide technological platform for further research in the role ofMC4Rgene.

Key words:pig；MC4R；mutation；expression

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.006

收稿日期：2015-05-04

基金項目：農(nóng)業(yè)部“引進國際先進農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”(948)重點項目(2011-G35)；國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX0801015B)；鄭州市科技攻關(guān)項目(141PPTGG430)

作者簡介：韓立強(1979-)，男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事動物基因功能的研究，Tel：0371-63558180，E-mail: qlahn2001@126.com *通信作者：楊國宇，教授，博士，主要從事動物生物化學(xué)研究，E-mail：haubiochem@163.com

中圖分類號：S828；S813.3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0679-07