柚皮苷對人臍帶間充質干細胞成骨分化的影響

張帆 司文騰 白玉 鄒士平

【摘 要】目的：研究柚皮苷對人臍帶間充質干細胞的生物學作用，以及對干細胞成骨分化的影響。方法：體外分離、培養(yǎng)及擴增HUCMSC，流式細胞技術檢測HUCMSC表面特異標志物。取第3代細胞，設立2組，對照組加入地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸，柚皮苷組加入地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸、柚皮苷。觀察細胞形態(tài)，進行堿性磷酸酶活性測定、鈣沉積半定量分析。結果：流式細胞術檢測實驗中增殖培育的細胞表面白表達CD29、CD44，不表達CD34、CD45，證實了實驗中培育增殖的細胞為人臍帶間充質干細胞。柚皮苷組比對照組細胞液中堿性磷酸酶活性高。柚皮苷組細胞內堿性磷酸酶含量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；茜素紅染色半定量分析見柚皮苷組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。結論：HUCMSC可以在體外采用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)成功，柚皮苷對HUCMSC成骨分化有促進作用。

【關鍵詞】 人臍帶間充質干細胞；柚皮苷；成骨分化；促進作用

【ABSTRACT】 Objective：To study the biological effect of naringin on human umbilical cord mesenchymal stem cell（HUCMSC）and its differentiation into osteoblasts.Methods：HUCMSC was isolated，cultured and amplified in vitro，and the surface specific markers of it were detected by flow cytometry technique.Cells of the third generation were taken to establish two groups：a naringin group and a control group，adding dexamethasone，ascorbic acid，β-glycerophosphate to the control group，adding dexamethasone，ascorbic acid，β-glycerol phosphate and naringin to the naringin group，observing the cell morphology，determining the alkaline phosphatase activity and quantitatively analyzing of calcium deposition.Results：The expression of CD29，CD44 and non-expression of CD34 and CD45 showed that the proliferation of HUCMSC was confirmed in the experiment.The activity of alkaline phosphatase was higher in the naringin group than that of the control group.The difference of the content of alkaline phosphatase between the two groups was statistically significant（P < 0.05）.Alizarin red staining and semi quantitative analysis showed that there was a statistical significance between the two groups （P < 0.05）.Conclusion：HUCMSC can be successfully cultured in vitro by tissue adherent culture and naringin can promote the differentiation of HUCMSC into osteoblasts.

【Keywords】 human umbilical cord mesenchymal stem cells；naringin；osteogenic differentiation；

promoting effect

關節(jié)置換手術中，處理骨缺損一直是個難題，阻擋了關節(jié)外科的發(fā)展。對于髖膝關節(jié)置換中出現(xiàn)的骨缺損的處理，由同種異體骨、自體骨移植發(fā)展到3D打印骨缺損來修補[1]。但是由于只有支撐骨架缺少成骨干細胞這個種子，所以植骨效果差，易發(fā)生骨移植失敗。本研究出發(fā)點是從各種中藥提取物中尋找一種能夠刺激細胞成骨分化的成分，從而找到能夠誘導細胞分化的物質，解決骨缺損問題。本實驗從2014年6月至2015年12月分別用柚皮苷和傳統(tǒng)骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞（HUCMSC），對比研究柚皮苷是否具有促進HUCMSC成骨分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 38～41周健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后切除2 h內的臍帶，低糖復合氨基酸葡萄糖培養(yǎng)基（DMEM，Gibco公司），胎牛血清（FBS，Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），抗壞血酸（Sigma公司），β-甘油磷酸（Sigma公司），地塞米松（Sigma公司），柚皮苷（天津天一生物制藥公司），BCM-100型超凈工作臺、茜素紅（ARS，上海源葉生物公司），ALP檢測試劑盒（BD公司），CD29、CD44、CD34、CD45單克隆抗體（BD公司），細胞培養(yǎng)瓶（Gibco公司），培養(yǎng)板（Gibco公司），硫化銨（天津化工），倒置相差顯微鏡等（理光），流式細胞儀（BD公司）。

1.2 臍帶間充質干細胞的制備 剖腹產(chǎn)后從手術臺上取下臍帶并浸入制備的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）之中，用外科剪去除臍帶的外膜和臍帶中的動靜脈，將剩余的華爾通膠[2]用PBS溶液沖洗2次后，使用組織剪分成1～2 mm3大小的組織塊[3]，

準備細胞培養(yǎng)瓶，放入含有質量分數(shù)為10%的FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的量以超過組織塊厚度2 mm為準，放入無菌培養(yǎng)箱中，恒溫37 ℃、CO2飽和度為5%。每3天更換培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液的同時在顯微鏡下觀察細胞融合情況，當達到70%以上后去除組織塊。繼續(xù)每3天換培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察到細胞達到90%融合時，準備質量分數(shù)為0.20%的胰蛋白酶使細胞懸浮。在顯微鏡下觀察細胞90%懸浮后，按照1∶2分瓶培養(yǎng)并傳代。擴增細胞以備后期細胞分組培養(yǎng)。

1.3 形態(tài)學及特異抗原檢測 細胞光鏡下檢查：可見細胞呈旋渦狀，螺旋狀增殖排列。細胞表型采用流式細胞技術檢測[4]，對第3代細胞表面特異抗原檢測，將2.5 g·L-1胰蛋白酶消化待檢細胞PBS洗滌3次，制成細胞懸濁液，待檢驗細胞每管

0.1 mL加入第一抗體；4 ℃冰育30 min后，PBS清洗，加入熒光標記第二抗體；4 ℃冰育30 min，流式細胞檢測儀檢測CD29、CD44、CD34、CD45。

1.4 臍帶間充質干細胞分組培養(yǎng) HUCMSC增殖并繁育3代以后，蓋玻片放入培養(yǎng)瓶中讓細胞爬片，待蓋玻片上爬滿細胞后，采用隨機余數(shù)分組法將其分為2組。對照組加入地塞米松（10-8 mol·L-1）、抗壞血酸（50 μg·mL-1）、β-甘油磷酸（10 mmol·L-1）；柚皮苷組加入地塞米松（10-8 mol·L-1）、抗壞血酸（50μg·mL-1）、β-甘油磷酸（10 mmol·L-1）、柚皮苷（20 ng·mL-1）誘導。

1.5 成骨細胞誘導后鑒定

1.5.1 光鏡下觀察 對照組：可見大量臍帶間充質干細胞向心旋渦狀排列。柚皮苷組：干細胞由漩渦狀向多邊形、立方形細胞發(fā)展。

1.5.2 鈣沉積的鑒定 柚皮苷組誘導培養(yǎng)28 d后，進行ARS染色。染色方法為2組細胞PBS沖洗2遍后，使用質量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，蒸餾水沖洗2次，然后加質量分數(shù)為0.1%的ARS（pH = 8.8）保持恒溫37 ℃染色5 min，胞漿內鈣化顆?？梢员籄RS染色成為棕紅色或橘黃色[5]。

1.5.3 細胞內堿性磷酸酶（ALP）檢測 2組細胞培養(yǎng)7 d后，開始測定ALP值，每次間隔24 h，共4次，每次裂解培養(yǎng)板內8個孔內增殖的細胞。步驟：吸走培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每孔加200 μL質量分數(shù)為0.1%的細胞裂解液（覆蓋孔底即可），反復凍溶3次，12 h以上。中間可震動培養(yǎng)板。2000 r·min-1離心10 min，進行裂解使胞漿內的ALP釋放出來，ALP試劑盒測定裂解液。顏色的深淺和ALP呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD），通過標準曲線計算樣品ALP濃度，通過OD值可以換算出ALP含量[6]。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9.3軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用獨立樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HUCMSC的形態(tài)特點及鑒定 通過華爾通膠放入培養(yǎng)瓶后，恒溫箱靜置培養(yǎng)3 d，就可見少量細胞游出。隨著時間延長，可見細胞由單一散在分布，逐步匯集成為放射狀生長，形態(tài)統(tǒng)一，貼壁生長。培養(yǎng)15 d后傳代，免疫組化結果顯示，間充質干細胞（MSC）特異性標志CD29、CD44，不表達CD34、CD45。見圖1。

2.2 HUCMSC誘導后光鏡檢測 HUCMSC在柚皮苷誘導劑的作用下，在倒置的顯微鏡下可見胞質內結晶反光點，對照組無此現(xiàn)象。柚皮苷組細胞融合率高于對照組。

2.3 HUCMSC誘導后ARS染色 細胞在ARS染色后，光鏡下可見胞漿內出現(xiàn)棕紅色的結節(jié)，周邊有星芒裝凸起。柚皮苷組胞漿內出現(xiàn)礦化結節(jié)并且有聚集趨勢，成片狀，數(shù)量多；而對照組少量礦化結節(jié)形成。見圖2。

2.4 ARS染色及鈣化顆粒的半定量分析 成骨誘導14，28 d后，在倒置顯微鏡下能觀察到礦化顆粒的形成，并且柚皮苷組所形成的顆粒數(shù)量多，而對照組礦化顆粒少。礦化顆粒經(jīng)氯化十六烷基吡啶溶解后，2組OD值：柚皮苷組1.1506±0.0571，2.3569±0.0825（P < 0.05）；對照組0.6826±0.0125，1.3528±0.0584（P < 0.05）。2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05，n = 4）。

2.5 誘導后的ALP定量檢測分析 ALP染色后可見柚皮苷組細胞表達ALP強陽性，對照組弱陽性，2組對比可以推測出柚皮苷組在誘導劑對成骨分化有明顯促進作用。見圖3。細胞內ALP含量測定，按照ALP試劑盒操作流程，酶標儀560 nm處測定OD值計算含量，細胞內ALP含量測量結果見表1，柚皮苷組胞漿內ALP含量較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

3 討 論

干細胞的研究能夠幫助處理臨床中出現(xiàn)的各種問題，其中種子細胞的選擇至關重要[7]，目前研究較多的是骨髓中提取[8]，量太少，還要提前制備。Erices等[9]發(fā)現(xiàn)，臍帶血中可以提取干細胞，但臍血干細胞同樣提取困難并且量少。臍帶MSC比臍帶血干細胞有著先天優(yōu)勢：①來源問題好解

決；②華爾通膠內干細胞儲備量很大；③沒有倫理上的問題。因此，臍帶MSC有廣闊的前景[10]。本實驗的目的是采用誘導培養(yǎng)液與基礎培養(yǎng)液對照的方法，比較不同培養(yǎng)劑條件對臍帶MSC向成骨細胞分化的影響。

中藥骨碎補，別名崖姜、巖連姜、爬巖姜、肉碎補，骨碎補科蕨類植物，中醫(yī)古籍中記載：“入腎，兼入心，療骨中邪毒?！惫撬檠a中可以提純出柚皮苷，以往的研究表明骨碎補能夠促進大鼠骨折愈合[11]，但是骨碎補中提純的物質在體外是否能促進MSC向成骨細胞分化還是一個未知數(shù)。本研究結果顯示，柚皮苷可以促進臍帶MSC向成骨細胞分化，成骨誘導28 d后，通過對比細胞ALP染色以及ARS染色，表明柚皮苷對干細胞的成骨分化具有促進作用。本實驗結果與文獻報道的研究結果相似。實驗證實了3個問題：①人臍帶間中能夠分離增殖出MSC。②骨碎補的提取物柚皮苷能夠體外誘導MSC向成骨細胞發(fā)展。胞漿內ALP的含量，比對照組高出很多，證明了誘導因子的有效性。③實驗過程中只用了一種誘導劑，盡量減少了干擾因素，找到了體外促進干細胞分化的方案。

本實驗從骨碎補中提純出的柚皮苷屬于植物類雌激素，而雌激素在體內可以抑制骨吸收，促進成骨作用，這與本文的結論是相同的。ALP是一種與鈣離子結合的蛋白，主要分布于細胞膜上，負責轉運鈣離子向胞內，促進細胞的礦化，同時也是促進細胞的成熟，ALP活性越高，則細胞的成骨性越強，越成熟。因此，ALP的檢測作為本次實驗的重點觀察方向，結果也與目前實驗相互吻合，柚皮苷組ALP活性明顯高于對照組。柚皮苷是β-羥-β-β-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，最近的體外和動物實驗均顯示，該類藥物能作用影響骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）因子，從而促進骨生長、增強骨骼強度。這可能與柚皮苷對干細胞成骨誘導有促進作用有關。柚皮苷促進干細胞成熟并成骨分化，考慮是有多種因子作用在其中，推測其分子過程為：①轉錄因子的逆表達，柚皮苷作用于干細胞后，上調轉錄因子Runx2和OSX的表達。miR-17-5p家族，尤其是miR-20a，能決定人間充質干細胞成骨分化的命運和調控成骨分化的過程。②改變胞內信號通路，柚皮苷可通過細胞外信號調節(jié)激酶信號通路的活性，結合IL-6調控，ERK5信號通路參與了成骨細胞的增殖分化，促進了干細胞成骨分化后，成骨干細胞的增殖。③胞質蛋白調控，柚皮苷具有促進IL-17F因子的分泌，IL-17F對成骨細胞的增殖能力、BMP-2的促進作用，同時

IL-17F還對抗BMP-2抑制因子Noggin mRNA對成骨細胞內的負反饋調節(jié)作用，促進成骨細胞的增殖；但是具體的機制有待于進一步實驗驗證[12]。

從中藥提取的單一物質作為刺激因子能夠使干細胞具有成骨細胞的活性，在后期人造骨架中能否增殖是關鍵，還有移植到人體后，能否繼續(xù)發(fā)育成活，有待今后進一步研究和證實。

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收稿日期：2016-01-26；修回日期：2016-03-21