骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成和分解基因的表達(dá)研究

陳穎娟 黃慈波 牛素平 張亞軍 楊昕

【摘 要】目的：初步探討合成和分解相關(guān)基因Ⅱ型膠原a1（COL2A1）、聚蛋白多糖（ACAN）、含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序結(jié)構(gòu)的去整合素金屬蛋白酶-5（ADAMTs-5）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3（TIMP-3）在骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和外周血的表達(dá)水平。方法：入選行關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)炎患者3例、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者3例和創(chuàng)傷截肢患者4例，分成骨關(guān)節(jié)炎組、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和創(chuàng)傷對照組，分別取離體關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞；入選骨關(guān)節(jié)炎患者9例、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者10例

和健康對照者10例，分成骨關(guān)節(jié)炎組、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和正常對照組，分別抽取4 mL外周靜脈血提取外周血單個核細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和外周血單個核細(xì)胞COL2A1、ACAN、ADAMTs-5、TIMP-3基因表達(dá)。采用非配對資料t檢驗(yàn)比較各基因分別在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞表達(dá)的組間差異。結(jié)果：骨關(guān)節(jié)炎組與創(chuàng)傷對照組組間比較提示ACAN、TIMP-3、COL2A1基因在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，ADAMTs-5基因表達(dá)上調(diào)，TIMP-3表達(dá)低于創(chuàng)傷對照組（P < 0.05）；各基因在骨關(guān)節(jié)炎外周血單個核細(xì)胞表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：TIMP-3、COL2A1、ACAN和ADAMTs-5基因在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的異常表達(dá)趨勢對骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展有預(yù)警作用，在外周血的表達(dá)無特異性。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；基因

【ABSTRACT】Objective：To study the expression level of synthesis and decomposition genes such as COL2A1，ACAN，ADAMTs-5 and TIMP-3 in articular cartilage cells and peripheral blood.Methods：There were three selected groups：an osteoarthritis group （3 cases for joint replacement），a rheumatoid arthritis group （3 cases with rheumatoid arthritis） and a trauma control group （4 cases of amputation due to trauma）.Cartilage specimens in vitro were taken to culture chondrocytes.In addition，Peripheral blood mononuclear cells were obtained from 4 mL peripheral vein blood taken from the other three groups：an osteoarthritis group （9 cases with osteoarthritis），a rheumatoid arthritis group （10 cases with rheumatoid arthritis） and a health control group （10 healthy people）.RT-PCR method was used to detect the gene expressions of COL2A1，ACAN，ADAMTs-5 and TIMP-3

in articular cartilage cells and peripheral blood.Non-pairing data t was used to test and compare the expression differences of genes in articular chondrocytes and peripheral blood mononuclear cells.Results：The comparison between the osteoarthritis group and the trauma control group suggested that the expression of ACAN，TIMP-3 and COL2A1 had a down regulation in osteoarthritic articular cartilage cells，the expression of ADAMTS-5 was up-regulated，and the expression of TIMP-3 was lower than that of the trauma control group （P < 0.05）.The expression of each gene in peripheral blood mononuclear cells was not statistically significant （P > 0.05）.Conclusion：The abnormal expression of TIMP-3，COL2A1，ACAN and ADAMTs-5 in articular chondrocytes has a warning effect on the occurrence and development of osteoarthritis but no specificity in peripheral blood.

【Keywords】 osteoarthritis；chondrocyte；gene

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是老年人最常見的關(guān)節(jié)疾病，診斷依賴于臨床癥狀和影像學(xué)，缺乏有效的早期診斷生物標(biāo)志，不利于早期防治[1-2]。尋找與關(guān)節(jié)軟骨病變呈“鏡像”關(guān)系的生物標(biāo)志具有重要意義[3]。OA發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。軟骨細(xì)胞合成和分解代謝功能失衡是OA核心事件。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖下降，蛋白水解酶活性增高，內(nèi)源性蛋白水解酶活性降低是啟動惡性循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。選?、蛐湍z原a1（COL2A1）、聚蛋白多糖（ACAN）、含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序結(jié)構(gòu)的去整合素金屬蛋白酶-5（ADAMTs-5）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3（TIMP-3）基因構(gòu)成一個相互關(guān)聯(lián)的整體，能夠早期評估和預(yù)警OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成和分解代謝功能失衡。臨床上關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本取材不易，故筆者同時(shí)探討上述關(guān)聯(lián)基因在OA外周血中是否存在特異性表達(dá)，能否作為OA預(yù)警基因在簡便易獲取的外周血中亦具有生物學(xué)標(biāo)志作用。本研究擬選相關(guān)基因COL2A1、ACAN、ADAMTs-5和TIMP-3，采用Real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證在OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和外周血中的表達(dá)，以明確其早期預(yù)警意義。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本 選取2009年2月至2009年

8月在北京大學(xué)第一醫(yī)院和武警北京總隊(duì)第二醫(yī)院骨科因OA或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）行關(guān)節(jié)置換術(shù)、因創(chuàng)傷截肢的住院患者。OA患者3例，男2例，女1例；中位年齡60.5歲；診斷符合1986年美國風(fēng)濕病學(xué)會原發(fā)性O(shè)A分類標(biāo)準(zhǔn)。RA患者3例，男1例，女2例；中位年齡69歲；診斷符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會RA標(biāo)準(zhǔn)。創(chuàng)傷截肢患者4例，均為男性；中位年齡34歲；無關(guān)節(jié)炎病史。研究分成OA組、RA組和創(chuàng)傷對照組。

1.1.2 外周血單個核細(xì)胞 選取2010年10月至2011年10月在北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的住院和門診患者，以及健康體檢者。OA患者9例，男3例，

女6例；中位年齡46歲。RA患者10例，男3例，女7例；中位年齡57.5歲。健康查體10例，男3例，

女7例；中位年齡21歲。研究分成OA組、RA組和正常對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和總RNA提取 Trizol一步法提取原代培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞總RNA，過柱純化，分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。

1.2.2 外周血單個核細(xì)胞分離和總RNA提取 分別抽取入選者4 mL靜脈血，EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度離心法分離單個核細(xì)胞，總RNA提取和質(zhì)檢步驟同前。

1.2.3 熒光定量PCR法對所選4個目的基因及

1個內(nèi)參基因進(jìn)行相對定量分析 ①引物設(shè)計(jì)：根據(jù)Gene Bank基因序列分別設(shè)計(jì)引物。COL2A1（Forwardprimer：5 AGACCTTCGGGTCAAGGCAGAG3，Reverseprimer：5 CCATTGTGTAGGACACACACAGTTCC 3）、ACAN（Forwardprimer：5TCGGAACCGCAGCTGAATGTAT 3，Reverseprimer：5GGTCCCTCTGATGGCTCTCTCC 3）、ADAMTs5（Forwardprimer：5 CCCTCAATTTTCCAGAAGCAATGG 3，Reverseprimer：5 TTTGAAGGTTGCCAAAGCTGAGA 3） 、TIMP-3（Forwardprimer：5 GTCACTCGGCCCTGGGTAGTCT 3，Reverseprimer：5AGAGATGCCCAAAGGAGGAAGC 3）。②熒光定量PCR反應(yīng)體系：ddH2O 5 μL，2XSYBR（Qiagen QuantiTech） 10 μL，引物（2 μM）3 μL，模板（cDNA）2 μL，總量 20 μL。

③管家基因GAPDH作為內(nèi)參照。④熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min→40個循環(huán)×[94 ℃ 15 s → 60 ℃1 min（數(shù)據(jù)采集）]→95 ℃15 s →60 ℃1 min →95 ℃ 15 s →60 ℃ 15 s。⑤染色信號收集和資料分析：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定目的基因循環(huán)閾值，最終計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用非配對資料t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和外周血單個核細(xì)胞提取的總RNA質(zhì)量檢測合格 總RNA吸光度A260/A280均在1.9～2.1，甲醛變性膠電泳見電泳條帶清晰。

2.2 3組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞各基因的表達(dá)比較 OA組與創(chuàng)傷對照組比較，OA組ACAN、TIMP-3、COL2A1基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢，ADAMTs-5基因呈上調(diào)表達(dá)趨勢，TIMP-3表達(dá)低于創(chuàng)傷對照組

（P = 0.029）；ACAN、ADAMTs-5和COL2A1表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1、圖1。

2.3 3組外周血單個核細(xì)胞各基因的表達(dá)比較 經(jīng)組間各候選預(yù)警基因在OA外周血單個核細(xì)胞表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2、圖2。

3 討 論

在力學(xué)和生物學(xué)等多因素共同作用下，OA軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡，導(dǎo)致不可逆病變[4]。COL2A1、ACAN、ADAMTs-5、TIMP-3作為預(yù)警基因參與一系列相互關(guān)聯(lián)的基因事件，明確上述基因的表達(dá)特點(diǎn)，有利于早期監(jiān)測和診治。

正常人關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和ECM組成。軟骨細(xì)胞具有合成和分解代謝ECM功能；ECM合成和降解處于動態(tài)平衡，維持軟骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。ECM主要成分是聚蛋白多糖與膠原網(wǎng)絡(luò)，通過基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和ADAMTs的分化和互補(bǔ)而被降解[2]。Ⅱ型膠原是軟骨的基本結(jié)構(gòu)，早期OA患者膠原代謝標(biāo)志物的變化，提示Ⅱ型膠原降解增加。聚蛋白多糖在軟骨細(xì)胞間信息傳遞、維持細(xì)胞表型及與其他基質(zhì)相互作用方面發(fā)揮生物學(xué)功能。聚蛋白多糖的進(jìn)行性喪失是OA的特點(diǎn)，聚蛋白多糖酶活性增高是啟動病變的關(guān)鍵酶之一[5]。聚蛋白多糖酶-2即ADAMTs-5，最初從白細(xì)胞介素（IL）-1誘導(dǎo)的牛鼻軟骨中提取，是OA早期主要的蛋白聚糖降解酶。抑制ADAMTs-5可阻止OA軟骨聚蛋白多糖降解，防止軟骨退行性變[6]。人TIMP-3的重組N末端抑制序列可抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5，其抑制常數(shù)（Ki值）低于納摩爾，明顯小于對MMPs抑制所需濃度，表明TIMP-3是ADAMTs-5強(qiáng)大內(nèi)源性抑制劑[7]。TIMP-3具有成為新治療靶標(biāo)的

潛能[8]。

OA軟骨處于重建或修復(fù)狀態(tài)，ECM降解一旦啟動一系列事件將序貫發(fā)生[9-10]。蛋白水解酶活性增高是早期病變的基本步驟，關(guān)鍵第一步是ADAMTs-5介導(dǎo)軟骨聚蛋白多糖丟失，多種MMPs持續(xù)降解ECM主要成分，引起軟骨細(xì)胞分解產(chǎn)物釋放入滑膜液導(dǎo)致滑膜炎癥，被刺激的滑膜釋放炎癥介質(zhì)，關(guān)節(jié)腔炎癥細(xì)胞聚集，分泌IL-1和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），抑制TIMPs表達(dá)。惡性循環(huán)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞蛋白水解酶表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。最終，OA關(guān)節(jié)軟骨ECM、MMPs、ADAMTs、TIMPs形成一個特異性循環(huán)模式，結(jié)局為蛋白水解酶顯著增多、軟骨破壞加速直至關(guān)節(jié)畸形。參與軟骨細(xì)胞這一循環(huán)模式的主要基因COL2A1、ACAN、ADAMTs-5、TIMP-3對OA病變起預(yù)警調(diào)控作用，針對預(yù)警基因的靶向治療將成為打破這一特異模式的突破點(diǎn)[11-13]。

本研究初步嘗試將COL2A1、ACAN、TIMP-3

和ADAMTs-5基因的異常表達(dá)作為一個惡性循環(huán)整體來探討對OA的預(yù)警。結(jié)果表明，ACAN、TIMP-3、COL2A1基因在OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)呈下調(diào)趨勢，ADAMTs-5表達(dá)呈上調(diào)趨勢，TIMP-3表達(dá)顯著低于創(chuàng)傷對照組（P < 0.05）；但各預(yù)警基因在OA外周血單個核細(xì)胞表達(dá)無特異性。已知中老年RA為繼發(fā)性O(shè)A，在關(guān)節(jié)軟骨退行性變的基礎(chǔ)上，存在復(fù)雜的免疫炎癥背景。本研究設(shè)立RA組，結(jié)果提示，4個基因在RA組和OA組表達(dá)趨勢相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。是否提示OA與RA在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)病機(jī)制上有一定程度交叉？上述4個基因是否對促使OA炎癥持續(xù)進(jìn)展亦具有預(yù)警？有待明確。由于關(guān)節(jié)軟骨取材不易，研究樣本量小，筆者觀察到OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ACAN、TIMP-3、COL2A1和ADAMTs-5基因的異常表達(dá)趨勢，提示作為相互關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)可早期評估和預(yù)警OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成和分解代謝功能失衡。但上述基因在OA外周血的表達(dá)不具有特異性，能否在簡便易獲取的外周血中作為OA預(yù)警基因廣泛應(yīng)用，仍需進(jìn)一步探討。推測原因：基因的表達(dá)可能受DNA甲基化調(diào)控，而RT-PCR檢測技術(shù)存在局限性，不排除采用DNA甲基化研究能證實(shí)上述預(yù)警基因OA外周血表達(dá)調(diào)控具有特異性，故仍可作為候選基因，需進(jìn)一步證實(shí)。

本研究不足之處是小樣本體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不一定完全代表疾病的發(fā)展規(guī)律。今后可進(jìn)一步深入研究的方向包括：增加病例樣本，在性別匹配基礎(chǔ)上進(jìn)行OA年齡分層研究（60歲以上和以下）；因影響疾病的最終物質(zhì)是蛋白類物質(zhì)，增加與OA預(yù)警基因?qū)?yīng)的蛋白類指標(biāo)，研究基因與蛋白的變化關(guān)系，在蛋白水平探討OA軟骨細(xì)胞合成和分解代謝功能的失衡。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會.骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010，14（6）：416-419.

[2] Kimura T.Progress of research in osteoarthritis.An overview of the recent knowledge on osteoarthritis：pathogenesis，evaluation and therapies[J].Clin Calcium，2009，19（11）：1565-1571.

[3] 菲爾斯坦.凱利風(fēng)濕病學(xué)[M].8版.栗占國，唐福林，譯.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2011：121-144.

[4] Bay-Jensen AC，Hoegh-Madsen S，Dam E，et al.Which elements are involved in reversible and irreversible cartilage degradation in osteoarthritis[J].Rheumatol Int，2010，30（4）：435-442.

[5] Huang K，Wu LD.Aggrecanase and Aggrecan Degradation in Osteoarthritis：a Review[J].J Int Med Res，2008，36（6）：1149-1160.

[6] Verma P，Dalal K.ADAMTS-4 and ADAMTS-5：Key Enzymes in Osteoarthritis[J].J Cell Biochem，2011，112（12）：3507-3514.

[7] Kashiwagi M，Tortorella M，Nagase H，et al.TIMP-3 is a potent inhibitor of aggrecanase 1（ADAMTS-4）and aggrecahase 2（ADAMTS-5）[J].J Biol Chem，2001，276（16）：12501-12504.

[8] Morris KJ，Cs-Szabo G，Cole AA.Characterization of TIMP-3 in human articular talar cartilage[J].Connect Tissue Res，2010，51（6）：478-490.

[9] Houard X，Goldring MB，Berenbaum F.Homeostatic Mechanisms in Articular Cartilage and Role of Inflammation in Osteoarthritis[J].Curr Rheumatol Rep，2013，15（11）：375.

[10] Berenbaum F.Osteoarthritis as an inflammatory disease （osteoarthritis is not osteoarthrosis?。J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21（1）：16-21.

[11] Troeberg L，Nagase H.Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis[J].Biochim Biophys Acta， 2012，1824（1）：133-145.

[12] Kevorkian L，Young DA，Darrah C，et al.Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in cartilage[J].Arthritis Rheum，2004，50（1）：131-141.

[13] Renge Y，Ospelt C，Gay S.Proteinases in the joint： clinical relevance of proteinases in joint destruction[J].Arthritis Res Ther，2007，9（5）：221.

收稿日期：2016-01-20；修回日期：2016-03-02