血清miRNA生物標(biāo)志物對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值

陳 昊， 范理宏

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院呼吸科，上海 200072)

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血清miRNA生物標(biāo)志物對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值

陳 昊， 范理宏

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院呼吸科，上海 200072)

目的 探討在可切除的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血清中循環(huán)miRNA的表達(dá)。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)在訓(xùn)練集中檢測(cè)115名患者和69名健康對(duì)照組的術(shù)前血清樣本中的miR-15b-5p的表達(dá)量。用熒光量子點(diǎn)液相微珠在驗(yàn)證集中進(jìn)一步確認(rèn)在91名非小細(xì)胞肺癌患者和66名健康人群的血清樣本中miRNA的差異性表達(dá)。用受試者工作曲線(ROC)分析選擇最佳的截?cái)嘀?。用卡方檢驗(yàn)來分析評(píng)估m(xù)iR-15b-5p關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值。結(jié)果 miR-15b-5p在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示該方法的靈敏度為83.5%，特異度為68.1%。結(jié)論 miR-15b-5p可作為可切除的非小細(xì)胞肺癌中非侵入性的診斷生物標(biāo)志物。

非小細(xì)胞肺腫瘤； 血清miRNA； 非侵入性生物標(biāo)志物； 量子點(diǎn)

肺癌已位居腫瘤相關(guān)死亡原因的首位，高死亡率主要源于缺乏有效的早期篩查和診斷方法。早期確診者可及時(shí)行微創(chuàng)手術(shù)治愈，而中晚期患者開胸手術(shù)創(chuàng)傷大，隨后的放化療痛苦且費(fèi)用高昂、療效極差。尋找有效的肺癌早期篩查手段對(duì)提高肺癌患者的生存至關(guān)重要。近年來，發(fā)現(xiàn)某些特異性miRNA在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。本研究選擇早期非小細(xì)胞肺癌為研究對(duì)象，研究血清中miR-15b-5p表達(dá)與早期非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系，探討其作為早期診斷非小細(xì)胞肺癌的非侵入性的腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年12月至2015年12月在同濟(jì)大學(xué)附屬肺科醫(yī)院接受胸外科手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者共206例。納入標(biāo)準(zhǔn)： (1) 術(shù)前1～2周內(nèi)采集了外周血；(2) 臨床分期ⅠA-ⅢB，接受了胸外科手術(shù)；(3) 切除標(biāo)本經(jīng)病理驗(yàn)證為肺癌；(4) 術(shù)前未接受過放療和化療。將206例肺癌患者分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，其中訓(xùn)練集115例，驗(yàn)證集91例。在訓(xùn)練集中腺癌患者91例(79.13%)，鱗癌患者21例(18.26%)，大細(xì)胞癌3例(2.61%)；在驗(yàn)證集中腺癌患者71例(78.02%)，鱗癌患者17例(18.68%)，大細(xì)胞癌3例(3.30%)。2組病理類型構(gòu)成比例相近。在訓(xùn)練集中Ⅰ期患者為88例(76.52%)，ⅡA-ⅢB期患者為27例(23.48%)；在驗(yàn)證組中Ⅰ期患者64例(70.33%)，ⅡA-ⅢB期患者27例(29.67%)。臨床分期構(gòu)成也相近。對(duì)照組共135例健康人群。入選病例均有完整臨床隨訪資料，全部標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。341例樣本在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中構(gòu)成為訓(xùn)練集中有115例患者和69名健康志愿者，而驗(yàn)證集中有91例患者和66名健康志愿者。

1.2 主要試劑和儀器

血清miRNA提取試劑盒(miRNeasy serum kit)，RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量試劑盒均購自德國Qiagen公司。hsa-mir-15b-5p引物，內(nèi)參U6由丹麥Exiqon公司合成。Real-Time PCR儀(ABI 7500)購自美國Ambion公司產(chǎn)品。miRNA的濃度由NanoDrop 1000(NanoDrop， Wilmington， DE)測(cè)定。液相微珠購自Tellgen生物有限公司。流式細(xì)胞分析儀(Accuri C6)購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 miRNA的提取 收集術(shù)前1～2周血清樣本，4℃，離心半徑10cm，3000r/min，離心15min以去除細(xì)胞碎片。將血清樣本保存于-80℃以供使用。每個(gè)血清樣本取200μl，按照血清miRNA提取說明書提取血清中的miRNA，從吸附柱中脫出總miRNA。檢測(cè)miRNA溶液的吸光值(D260，D280)，計(jì)算miRNA的濃度和純度，D260/D280介于1.8～2.2方可用于cDNA的合成。

1.3.2 血清miRNA的qRT-PCR的分析 按照試劑盒的產(chǎn)品說明書，用qRT-PCR來測(cè)定miRNA的量。用U6作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法ΔCt值來測(cè)定。計(jì)算目標(biāo)miRNA的相對(duì)表達(dá)量，質(zhì)控采用miRNA試劑盒質(zhì)控品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.95為合格。

1.3.3 熒光量子點(diǎn)液相微珠陣列驗(yàn)證 特定設(shè)計(jì)miR-15b-5p的DNA探針(QDot-s-s-5′-AAAAAAA-AAAAAAAAAAAAAGTGGAGTGTGAGGTGG-3′)DNA探針的上段為miRNAs的互補(bǔ)序列，下段則為量子點(diǎn)互補(bǔ)序列。探針點(diǎn)樣或原位合成于固相基質(zhì)，列為點(diǎn)陣，成為微芯片。用樣品雜交洗滌。miRNAs結(jié)合在探針上部。采用單鏈核酸外切酶ExoVII消化。未結(jié)合miRNAs的探針將會(huì)被切除，結(jié)合了miRNAs的探針仍然固著于固相基質(zhì)上。然后與DNA-量子點(diǎn)進(jìn)行雜交。量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與miRNAs量存正比例相關(guān)。量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度可用流式細(xì)胞分析儀分析，并用軟件(FlowJoe7.6)分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 患者特征

本研究的所有患者均經(jīng)臨床和病理學(xué)確診為NSCLC。所有患者的臨床特征總結(jié)，見表1。在訓(xùn)練集中，115例患者和69名健康人群的血清樣本做miRNA的表達(dá)分析。隨后在驗(yàn)證集中對(duì)91例肺癌患者和66名健康人群做進(jìn)一步的確認(rèn)分析。研究發(fā)現(xiàn)年齡和性別在肺癌患者和健康對(duì)照組中，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 NSCLC患者在訓(xùn)練組和確認(rèn)組中的臨床特征

變量訓(xùn)練集驗(yàn)證集NSCLC患者對(duì)照組NSCLC患者對(duì)照組n115699166年齡/歲62.44±9.3260.01±6.1359.63±8.7758.72±7.64 <6052(45.22%)39(56.53%)51(56.04%)35(53.03%) ≥6063(54.78%)30(43.47%)40(43.96%)31(46.97%)性別 男62(53.91%)37(53.62%)56(61.54%)35(53.03%) 女53(46.09%)32(46.38%)35(38.46%)31(46.97%)組織學(xué)分型 腺癌91(79.13%)71(78.02%) 鱗癌21(18.26%)17(18.68%) 大細(xì)胞癌3(2.61%)3(3.30%)T <3cm50(43.48%)28(30.77%) ≥3cm65(56.52%)63(69.23%)N 陰性89(77.39%)75(82.42%) 陽性26(22.61%)16(17.58%)分期 Ⅰ88(76.52%)64(70.33%) ⅡA-ⅢB27(23.48%)27(29.67%)

2.2 miRNA的表達(dá)

在訓(xùn)練集中對(duì)血清中miR-15b-5p的表達(dá)水平用qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在肺癌組中miR-15b-5p的ΔCt值要低于對(duì)照組，(P<0.01)

為了驗(yàn)證將mir-15b-5p作為NSCLC的診斷標(biāo)志物的準(zhǔn)確性和特異性，另外一個(gè)獨(dú)立的研究組中用熒光量子點(diǎn)液相微珠做一個(gè)效度研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-15b-5p的表達(dá)水平在肺癌組中為18742.32±16302.34，在對(duì)照組中表達(dá)為4204.33±5920.82(P<0.0001)。可見mir-15b-5p的表達(dá)水平在肺癌組中明顯高于對(duì)照組。

2.3 mir-15b-5p的ROC分析

為了評(píng)估血清中mir-15b-5p的診斷有效性，計(jì)算訓(xùn)練集的ROC曲線，mir-15b-5p的曲線下面積(AUC)是0.784，見圖2，mir-15b-5p高表達(dá)提示肺癌發(fā)生。

圖2 mir15b-5p的ROC曲線Fig.2 The receiver operating characteristic(ROC) for the miR15b-5p

2.4 評(píng)測(cè)mir-15b-5p的診斷價(jià)值

為了確定mir-15b-5b診斷非小細(xì)胞肺癌的最佳參考閾值，依據(jù)ROC曲線各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的靈敏度和誤判率，對(duì)上述mir-15b-5p的約登指數(shù)進(jìn)行了列表計(jì)算，約登指數(shù)計(jì)算公式為： 約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1。當(dāng)約登指數(shù)最大時(shí)，所對(duì)應(yīng)的miR表達(dá)值為最佳診斷界值(及cutoff值)。通過列表計(jì)算得出hsa-miR-15b-5p的最佳診斷界值為4108，約登指數(shù)為0.549。當(dāng)miR-15b-5p高于最佳診斷界值判定為陽性。做卡方檢驗(yàn)可以得出靈敏度為83.5%，特異度為68.1%，診斷符合率77.4%，見表2。

表2 miR-15b-5p與金標(biāo)準(zhǔn)比較的χ2檢驗(yàn)

3 討 論

肺癌的高死亡率主要由于缺乏有效的早期診斷方法，而早期肺癌患者如果立即進(jìn)行手術(shù)治療可以顯著提高生存率。因此，建立有效的篩查和早期檢測(cè)技術(shù)對(duì)提高肺癌患者的生存至關(guān)重要。目前臨床上常用的早期診斷方法為腫瘤標(biāo)志物、胸部CT和PET/CT等。肺癌的血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)如CEA、Cyfra21-1等[2]敏感性和特異性均不理想，只能作為治療監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)。胸部CT是肺癌最主要的無創(chuàng)性診斷方法，然而肺癌的影像學(xué)征象常與某些肺部疾病相似或并存，且直徑1cm以下的病灶不易顯示，會(huì)產(chǎn)生漏診。PET/CT能反映分子代謝的顯像，有助于區(qū)分病變的良惡性，但尚無法鑒別1cm左右病灶的良惡性。因此上述的診斷方法對(duì)肺癌的早期診斷均存在局限性。

MicroRNAs已經(jīng)被公認(rèn)為是生物體內(nèi)最重要的調(diào)控分子之一[1-4]。腫瘤組織中的miRNA已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5-6]。當(dāng)前研究提示循環(huán)miRNA對(duì)于NSCLC有潛在的診斷作用[7-8]。

本研究的目的是提高那些術(shù)前有肺部小結(jié)節(jié)的較早期NSCLC患者的診斷。本研究結(jié)果顯示mir-15b-5p在NSCLC的表達(dá)明顯上調(diào)，即高表達(dá)。在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中，腫瘤的大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和組織分型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNA在血清中濃度很低，因此有必要采取高靈敏度的方法去檢測(cè)它。本研究采取了2種不同的量化分析方法，并使用了2個(gè)獨(dú)立的患者組。本研究用qRT-PCR法檢測(cè)血清中mir-15b-5p表達(dá)水平以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性，用熒光量子點(diǎn)液相微珠加以驗(yàn)證。由于qRT-PCR的方法是基于一個(gè)莖環(huán)引物[9]和引物延伸[10]，故有可能導(dǎo)致假陽性。量子點(diǎn)由于具有高淬滅效率和高量子產(chǎn)率，故可以提高檢測(cè)的靈敏度。熒光量子點(diǎn)液相微珠使miRNA直接貼在半導(dǎo)體上并與DNA探針雜化互補(bǔ)然后由熒光量子點(diǎn)檢測(cè)，從而提高敏感性和特異性。相對(duì)于qRT-PCR，此方法有良好的重復(fù)性，并使miRNA分析更有效率。因此，本研究認(rèn)為熒光量子點(diǎn)對(duì)于miRNA的檢測(cè)具有更好的應(yīng)用價(jià)值。

將miRNA的表達(dá)量化定義陽性與陰性，并將結(jié)果與病理金標(biāo)準(zhǔn)做卡方檢驗(yàn)。結(jié)果顯示檢測(cè)外周miRNA的表達(dá)情況對(duì)于診斷非小細(xì)胞肺癌的靈敏度為83.5%，特異度為68.1%，診斷符合率為77.4%，具有一個(gè)非侵入性腫瘤生物標(biāo)志物的性質(zhì)。

本研究還有一些不足之處，盡管總的結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而樣本量并不很充足且都來自同一家醫(yī)院。考慮到種群的差異，此研究結(jié)果是否在全世界具有良好的普遍性還有待進(jìn)一步研究。雖然血清中miRNA的表達(dá)水平的檢測(cè)被認(rèn)為是一個(gè)很有前景的診斷NSCLC的方法，但是這仍需要進(jìn)一步的調(diào)查和研究才能確定是否可以作為一個(gè)可靠的診斷指標(biāo)并應(yīng)用于臨床。本課題組未來會(huì)在多中心、隨機(jī)、前瞻性的試驗(yàn)中進(jìn)一步的確認(rèn)此結(jié)果并做出評(píng)估。

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Serum microRNA as biomarker for detection of early non-small cell lung cancer

CHENHao，F(xiàn)ANLi-hong

(Dept. of Respiration， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China)

Objective To investigate expression of circulating miRNA in patients with resectable non-small cell lung cancer(NSCLC). Methods The expression of miR-15b-5p was detected by using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(qRT-PCR) in preoperative serum samples of 115 NSCLC patients and 69 healthy controls. The differential expression of miRNA was validated by using fluorescence quantum dots liquid bead array in 91 cases of NSCLC and 66 cases of healthy subjects. Receiver operating characteristic(ROC) analysis was performed and the cut off value of miRNA for diagnosis of NSCLC was selected. The diagnostic value of the miR-15b-5p for NSCLC was analyzed by chi-square test. Results The expression of circulating miR-15b-5p was significantly unregulated in NSCLC patients(P< 0.05). The cut-off value of miR-15b-5p predicted NSCLC with a specificity of 83.5% and sensitivity of 68.1%. Conclusion miR-15b-5p may potentially serve as noninvasive diagnostic biomarkers for diagnosis of resectable NSCLC.

non-small cell lung cancer； serum microRNA； noninvasive biomarker； quantum dots

10.16118/j.1008-0392.2016.04.000

2016-04-27

上海市科委納米專項(xiàng)基金(12NM0500800)；同濟(jì)大學(xué)“中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)-重點(diǎn)學(xué)科交叉類項(xiàng)目”;同濟(jì)大學(xué)“中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)-學(xué)科交叉類項(xiàng)目”

陳 昊(1990—)，男，碩士研究生.E-mail： 348562653@qq.com

范理宏.E-mail： Fanlih@aliyun.com

R 734.1

A

1008-0392(2016)04-0051-04