OVA基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抗裸鼠肺腫瘤效應(yīng)研究

周 薇， 陳 曉， 王 龍， 何文娟， 趙培林

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，上海 200092)

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OVA基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抗裸鼠肺腫瘤效應(yīng)研究

周 薇， 陳 曉， 王 龍， 何文娟， 趙培林

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，上海 200092)

目的 探討OVA基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗(DC-OVA)在腫瘤模擬抗原OVA(ovabumin)的裸鼠肺癌模型體內(nèi)抗肺腫瘤的效應(yīng)。方法 裸鼠右肺原位接種攜帶OVA的Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung cancer cell-OVA， LLC-OVA)懸液，建立裸鼠肺癌模型。獲取DC，經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)制備DC-OVA疫苗。Western 印跡法檢測(cè)OVA蛋白的表達(dá)。獲取T細(xì)胞，進(jìn)而制備DC疫苗系統(tǒng)(DC-OVA/T)。CCK8試劑檢測(cè)DC-OVA刺激后T細(xì)胞的增殖。模型建立2周后，尾靜脈注射DC-OVA/T。Micro-CT掃描荷瘤裸鼠的胸部，觀察肺部影像。H-E染色觀察肺部及腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。IHC方法觀察脾、淋巴結(jié)、腫瘤組織中CD8的表達(dá)；觀察腫瘤組織中SOX2、BMI1的表達(dá)。ELISA法檢測(cè)血清中IL-12水平。結(jié)果 Western印跡法在樣本中檢測(cè)出清晰的OVA條帶。DC-OVA強(qiáng)有效地刺激了T細(xì)胞的增殖(P<0.05)。DC-OVA/T治療4周，疫苗組裸鼠肺micro-CT未見(jiàn)明顯腫瘤陰影；取材，裸眼可見(jiàn)疫苗組病灶減小，H-E染色顯示疫苗組的腫瘤組織較少，肺組織形態(tài)較完整。疫苗組裸鼠的脾、淋巴結(jié)、腫瘤組織內(nèi)CD8陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05,P<0.05,P<0.01)，腫瘤組織中的SOX2、BMI1陽(yáng)性表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05,P<0.05)；血清中的IL-12含量較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)。結(jié)論 基因修飾的DC疫苗在裸鼠體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗肺癌效應(yīng)，為臨床治療肺癌提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗； 肺腫瘤； 腫瘤干細(xì)胞； 腫瘤免疫治療； 裸鼠

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在過(guò)去的10年里，肺癌的5年生存率仍保持在15%左右[1]。目前，臨床針對(duì)肺癌治療除了傳統(tǒng)的三大治療方法，免疫治療也越來(lái)越受關(guān)注。隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)研究方法的迅速發(fā)展，抗原特異性腫瘤疫苗等腫瘤免疫治療研究陸續(xù)展開(kāi)[2]。樹(shù)突狀細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)專職的抗原提呈細(xì)胞，在激活免疫T細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫抗腫瘤的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)建立裸鼠肺癌模型，構(gòu)建基因修飾的靶向樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗，使其能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并刺激特異性T細(xì)胞活化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，觀察該疫苗在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性裸鼠35只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其中15只用于肺癌模型的建立，其余用于實(shí)驗(yàn)分組。雄性BALB/c小鼠12只，6～ 8周齡，體質(zhì)量18～20g，由上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，用于DC疫苗系統(tǒng)的制備。

1.2 細(xì)胞與質(zhì)粒

攜帶OVA的Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung cancer cell-OVA, LLC-OVA)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；pHR-CMV-EGFP-OVA為基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；pLTR-VSVG為包膜質(zhì)粒、pHIV包裝質(zhì)粒，均由美國(guó)路易斯安那州立大學(xué)王國(guó)順教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增、保存。

1.3 試劑

Matrigel購(gòu)自上海翊圣生物科技公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京天根生化科技公司；細(xì)胞因子mGM-CSF、mIL-4、mIL-2購(gòu)自英國(guó)PeproTech公司；培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；兔抗小鼠CD8、SOX2抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司，兔抗小鼠BMI1抗體購(gòu)自上海澤眾生物有限公司，兔抗雞OVA抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ECL對(duì)比劑購(gòu)自美國(guó)Signalway公司；CCK8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；IL-12 ELISA試劑盒購(gòu)自上海威奧生物有限公司。小動(dòng)物活體Micro-CT系統(tǒng)型號(hào)為Explore Locus，購(gòu)自美國(guó)通用公司。

1.4 裸鼠肺癌模型的建立

1.4.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 LLC-OVA復(fù)蘇后種于含10%FBS、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，計(jì)數(shù)7×106/160μl，與Matrigel以2∶1體積比置于冰上混合、冰浴，待接種。

1.4.2 接種 裸鼠共15只(每組5只，分別于注射腫瘤細(xì)胞2、3、4周后取材)，擺直立體位，頭頸固定。1ml注射器吸取細(xì)胞混合液(240μl)靜置約2min，于裸鼠右肺第五、六肋間垂直穿刺，進(jìn)針約7mm，勻速緩慢注入。

1.5 DC疫苗制備

1.5.1 DC細(xì)胞分離培養(yǎng)及疫苗制備 提取分離3只BALB/c小鼠的股骨與脛骨，沖洗出骨髓腔內(nèi)骨髓，裂解紅細(xì)胞,離心半徑16.5cm，1500r/min，離心10min，細(xì)胞種于含有25ng/ml GM-CSF和4ng/ml IL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。3d后半量換液。于第6天收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入濃縮的慢病毒顆粒，離心半徑16.5cm，3000r/min，室溫離心4h。重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，72h后顯微鏡下觀察，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。

1.5.2 Western印跡法檢測(cè)OVA蛋白的表達(dá) 分別裂解DC-OVA、LLC-OVA細(xì)胞制備蛋白樣品，測(cè)定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，一抗(OVA濃度1∶1000；GAPDH濃度1∶2000)4℃ 孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶2000)和HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(1∶2000)室溫孵育2h，最后經(jīng)ECL顯影，化學(xué)發(fā)光成像儀觀察、攝片。

1.6 尼龍毛柱法提取T細(xì)胞

尼龍毛柱高壓蒸汽滅菌，研磨小鼠脾臟用紅細(xì)胞裂解，過(guò)濾、離心后置于尼龍毛柱上，37℃孵育45min，收集濾液。細(xì)胞經(jīng)離心洗并計(jì)數(shù)后，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。

1.7 CCK8檢測(cè)經(jīng)DC-OVA刺激后T細(xì)胞增殖

T細(xì)胞與DC-OVA細(xì)胞分別計(jì)數(shù)1×104/ml，96孔板中各加入100μl細(xì)胞懸液，另設(shè)3行分別加入200μl 培養(yǎng)液、200μl DC-OVA細(xì)胞懸液、200μl T細(xì)胞懸液，均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置細(xì)胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)。分別于6、24、48、72h加入等量的CCK8試劑，暗室中靜置90min后，用酶標(biāo)儀在450mm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的D450值。比較兩組細(xì)胞增殖指數(shù)的差異。增殖指數(shù)SI=[DC-OVA/T組D450值-DC-OVA組D450值/T組D450值-空白對(duì)照組D450值][4]。

1.8 實(shí)驗(yàn)分組

建立穩(wěn)定模型后，將動(dòng)物分為對(duì)照組、治療1次組、治療2次組，共計(jì)20只裸鼠。治療1次組4只裸鼠，于腫瘤細(xì)胞接種2周后尾靜脈注射8×106/200μl DC-OVA/T，同期有4只裸鼠注射PBS作為對(duì)照，腫瘤細(xì)胞接種后第4周取材；治療2次組共4只裸鼠，腫瘤細(xì)胞接種后第2周和第3周，分別尾靜脈注射上述劑量的DC-OVA/T，治療1次組共4只鼠，腫瘤細(xì)胞接種后第3周尾靜脈注射上述劑量的DC-OVA/T，4只裸鼠在同時(shí)間注射PBS作為對(duì)照。

1.9 Micro-CT掃描

腫瘤細(xì)胞接種后第6周進(jìn)行Micro-CT掃描。將受試裸鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(濃度1%、30mg/kg)麻醉后，仰臥平放于CT掃描床上，小鼠胸部用繃帶固定。Micro-CT機(jī)的掃描軟件以Fluro方式選擇胸部區(qū)域進(jìn)行掃描，具體掃描參數(shù)如下，電壓： 50kVp，電流： 450μA，曝光時(shí)間： 300ms，掃描技術(shù)： 360度，探測(cè)器bin模式： 4×4，平均幀數(shù)： 2，掃描時(shí)間： 16min。掃描完成后將生成的原始圖像經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的體模校正后重建至精度為0.092mm的高分辨率，拍片。

1.10 脾、淋巴結(jié)、腫瘤等組織的病理學(xué)檢測(cè)

1.10.1 H-E染色 受試裸鼠常規(guī)取材，經(jīng)石蠟切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟，蘇木精染胞核、伊紅染胞質(zhì)，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.10.2 IHC法觀察 受試裸鼠常規(guī)取材，行石蠟切片。IHC觀察脾、腋窩淋巴結(jié)、腫瘤組織中CD8的表達(dá)以及腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2、BMI1的陽(yáng)性分布、強(qiáng)弱變化。二甲苯、梯度乙醇脫蠟，3%H2O2浸15min，5%山羊血清封閉30min，一抗4℃孵育過(guò)夜。二抗孵育1h，DAB顯色，蘇木素滴染、脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.11 ELISA法檢測(cè)裸鼠血清IL-12水平

將各濃度標(biāo)準(zhǔn)品取100μl依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液作為零孔。小鼠血清用樣品稀釋液稀釋后每孔加100μl，室溫孵育90min；生物素抗小鼠IL-12抗體工作液按每孔加入100μl，室溫孵育60min，ABC工作液按每孔加入100μl，室溫反應(yīng)30min。每孔依次加入TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)25min。每孔加入TMB終止液。用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定D450值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Prism5、SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行繪制和分析，組間比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠肺癌模型的建立

受試裸鼠肺部接種腫瘤細(xì)胞后分時(shí)段取材。第2周取材，大體標(biāo)本觀察，可見(jiàn)其右上肺葉體積約 0.5cm3大小的瘤塊；第3周取材，可見(jiàn)裸鼠均穩(wěn)定荷瘤，右側(cè)肺葉的中、上肺葉長(zhǎng)有界限分明的瘤體；第4周取材，可見(jiàn)右肺幾乎完全已被腫瘤組織所占據(jù)，正常肺組織僅存少量，左側(cè)肺部亦見(jiàn)累及，裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，甚至死亡(圖1A、圖1B，箭頭所示為腫瘤)。H-E染色顯微鏡下可見(jiàn)典型腫瘤組織特征，低倍鏡下腫瘤區(qū)域呈較強(qiáng)的嗜堿性，高倍鏡下有較多的核分裂相(圖1C)。

圖1 裸鼠肺原位瘤模型Fig.1 The orthotopic lung tumor model in nude miceA： 裸鼠右肺癌病灶；B： 病灶的局部解剖；C： 肺癌組織光鏡像(H-E，×100)

2.2 DC疫苗的鑒定

三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝，產(chǎn)生慢病毒顆粒，經(jīng)濃縮后，轉(zhuǎn)導(dǎo)DC，72h后顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光，見(jiàn)圖2。

圖2 DC疫苗檢測(cè)Fig.2 Detection of DCs by fluorescence microscopyA： 常規(guī)顯微鏡觀察DC-OVA；B： 熒光顯微鏡觀察DC-OVA

2.3 OVA蛋白的鑒定

Western印跡法檢測(cè)OVA蛋白在DC-OVA中的表達(dá)，結(jié)果可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約35000的蛋白條帶，表明OVA蛋白成功在DC中表達(dá)，見(jiàn)圖3。

2.4 T細(xì)胞經(jīng)DC-OVA疫苗刺激后的增殖曲線

CCK8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，DC-OVA刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯優(yōu)于無(wú)疫苗刺激的T細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)，表明疫苗刺激后T細(xì)胞增殖分化的能力進(jìn)一步提高，見(jiàn)圖4。

圖3 Western印跡法結(jié)果Fig.3 Western Blotting analysis

圖4 T細(xì)胞增殖曲線Fig.4 Proliferation of T cells

2.5 DC-OVA對(duì)裸鼠肺原位腫瘤的治療作用

對(duì)6周組受試裸鼠進(jìn)行Micro-CT活體掃描，選取冠狀位圖片進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，治療組肺葉輪廓清晰，未見(jiàn)明顯腫瘤陰影(圖5A)；對(duì)照組右側(cè)肺部見(jiàn)異于正常組織的陰影，左側(cè)則多發(fā)感染(圖5B)。6周組裸鼠行病理解剖，裸眼觀察治療組裸鼠病灶體積明顯小于對(duì)照組，H-E病理組織染色顯示，治療組腫瘤細(xì)胞壞死，邊緣有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5C)；對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列無(wú)序、大小不一，核多分裂相(圖5D)。

圖5 DC-OVA對(duì)裸鼠肺癌的治療作用Fig.5 The anti-lung tumor effects of DC-OVA in nude miceA： 正常裸鼠CT掃描；B： 攜有腫瘤的裸鼠CT掃描；C： 正常肺組織光鏡像(H-E，×100)；D： 肺癌組織光鏡像(H-E，×100)

2.6 裸鼠組織IHC檢測(cè)結(jié)果

裸鼠的脾臟、淋巴結(jié)、腫瘤組織經(jīng)常規(guī)石蠟切片后，IHC方法檢測(cè)CD8在DC-OVA疫苗組脾臟、淋巴結(jié)、腫瘤組織中的表達(dá)，顯微鏡下可見(jiàn)CD8多分布于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或黃褐色，見(jiàn)圖6、表1。6周后取材病理檢測(cè)，SOX2多定位于細(xì)胞核中，呈黃褐色，見(jiàn)圖7。BMI1陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，在胞質(zhì)中呈棕黃色，多分布于腫瘤的邊緣處，見(jiàn)圖8。對(duì)照組裸鼠腫瘤組織中SOX2、BMI陽(yáng)性表達(dá)較DC-OVA疫苗組高(t=22.94,P=0.001<0.05;t=2.81，P=0.03<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 CD8在各組織中陽(yáng)性表達(dá)的IOD值

組織DC-OVA/CTL疫苗組對(duì)照組t值P值脾臟0.601±0.0530.266±0.0499.1750.04淋巴結(jié)0.372±0.0160.051±0.05610.3250.01腫瘤0.662±0.16108.2290.001

圖6 CD8在脾臟、淋巴結(jié)、腫瘤組織中的表達(dá)Fig.6 Expressions of CD8 in spleen, lymph nodes and tumor tissue(IHC,×400)

2.7 血清中IL-12的分泌水平檢測(cè)

ELISA檢測(cè)表明，DC-OVA/CTL疫苗系統(tǒng)4周組血清中IL-12的含量顯著高于PBS對(duì)照組(t=5.872，P=0.02<0.05)，6周組血清中IL-12含量也顯著高于對(duì)照組(F=121.54，P<0.001)，其中治療2次組的IL-12含量比治療1次組的IL-12高(圖9)。這表明，DC-OVA疫苗不僅在數(shù)量上促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，而且在功能上促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化成CTL，增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。

圖7 SOX2在腫瘤組織中的表達(dá)Fig.7 Expression of SOX2 in tumor tissues(IHC,×400)A： DC-OVA疫苗組；B： PBS對(duì)照組

圖8 BMI1在腫瘤組織中的表達(dá)Fig.8 Expression of BMI1 in tumor tissues(IHC,×400)A： DC-OVA疫苗組；B： PBS對(duì)照組

圖9 腫瘤治療過(guò)程中血清IL-12的含量差異Fig.9 Differences of content of IL-12 in Serum during tumor therapy*P<0.05，**P<0.001

3 討 論

鼠肺癌模型是與機(jī)體肺癌發(fā)生發(fā)展及其腫瘤微環(huán)境最為相近的一種模型，建立穩(wěn)定有效的鼠肺癌模型是研究肺癌體內(nèi)治療效應(yīng)的基礎(chǔ)[5]。目前，小鼠肺癌模型的建立主要包括以下幾種： (1) 化學(xué)致癌物質(zhì)通過(guò)吸入或口服的方式讓小鼠患癌，但該方式患癌周期比較長(zhǎng)，且在給予小鼠致癌物質(zhì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員也同樣暴露在致癌環(huán)境中，常此以往會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生不良后果[6]。(2) 通過(guò)給小鼠腹腔麻醉，行氣管切開(kāi)術(shù)，向其注入腫瘤細(xì)胞懸液，該方法易引起小鼠感染，術(shù)后并發(fā)癥、死亡率較高；且肺癌的部位、大小都不太好確定[7]。本實(shí)驗(yàn)室采取細(xì)胞懸液與Matrigel混合，行肺原位穿刺直接注入腫瘤細(xì)胞，建立鼠肺原位瘤模型。Matrigel是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出來(lái)的可溶性基底膜制備物，其主要成分有層粘連蛋白，Ⅳ型膠原等，可模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)和功能[8]。Matrigel的特性能使接種的腫瘤細(xì)胞固定在注射部位，使腫瘤形成單一病灶。該方法感染率低、成瘤率高，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)，大幅度地提升了肺癌原位模型的成功率。較前幾種方法，更適合裸鼠等免疫缺陷類小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

DC作為抗原提呈細(xì)胞，能有效激活T細(xì)胞分化。現(xiàn)階段制備DC疫苗多采用腫瘤細(xì)胞的裂解產(chǎn)物負(fù)載DC、重組腫瘤相關(guān)抗原致敏DC、腫瘤細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)DC。上述抗原都是取自腫瘤細(xì)胞，并不能確保只針對(duì)腫瘤組織表達(dá)，而對(duì)機(jī)體的正常組織無(wú)不良影響。本實(shí)驗(yàn)選用雞卵清蛋白(ovabumin, OVA)作為模擬抗原，其作為一種疫苗佐劑本身不具備抗原性，DC負(fù)載OVA蛋白，能夠靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞LLC-OVA，有效激活疫苗組裸鼠體內(nèi)共回輸?shù)腡淋巴細(xì)胞，促進(jìn)了T細(xì)胞活化并促進(jìn)其進(jìn)一步分化成CTL，有效殺傷腫瘤細(xì)胞。

腫瘤干細(xì)胞是指一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞群體。目前尚缺乏醫(yī)學(xué)界高度認(rèn)可的肺腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。BMI1是多梳基因(polycomb of genes， PcP) 家族的一員，作為原癌基因，BMI1在多種惡性腫瘤組織中都有過(guò)表達(dá)且與腫瘤預(yù)后相關(guān)[9]。本研究顯示，BMI1在DC-OVA/CTL疫苗組的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。研究[10]表明，SOX2在肺癌組織中有較高的表達(dá)，且該表達(dá)同腫瘤體積呈正相關(guān)。SOX2可能是參與肺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，有望成為肺癌新的標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，SOX2抗體表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈深棕黃色，其在DC-OVA/CTL疫苗組的表達(dá)也低于對(duì)照組。IL-12又稱為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子(cytotoxic lymphocyte maturation factor, CLMF)，是由DC、巨噬細(xì)胞等抗原提呈類細(xì)胞分泌產(chǎn)生，刺激T細(xì)胞增殖分化生成CTL細(xì)胞，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗組裸鼠血清中的IL-12含量高于對(duì)照組，發(fā)揮了其免疫調(diào)節(jié)功能，提高疫苗組小鼠T細(xì)胞的免疫殺傷能力。

DC-OVA/CTL疫苗不僅能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，也能夠殺傷部分腫瘤干細(xì)胞。其療效與腫瘤抗原的選擇、腫瘤抗原的負(fù)載方式、DC疫苗數(shù)量、DC注射方式及次數(shù)等多種因素有關(guān)。

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Anti-lung cancer effect of dendritic cell vaccine modified with OVA gene in nude mice

ZHOUWei,CHENXiao,WANGLong,HEWen-juan,ZHAOPei-lin

(Dept. of Histology & Embryology, School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the anti-tumor effect of dendritic cell vaccine with OVA gene in nude mice. Methods The lung cancer model was induced by injection of Lewis lung cancer (LLC) cells with OVA suspension in the right lung of nude mice. The OVA gene was transducted into DC to prepare the DC vaccine (DC-OVA). Expression of OVA protein in DC-OVA was detected by Western blotting. The T cells were gained to construct DC-OVA/T vaccine system. T cell proliferation stimulated by DC-OVA vaccines was detected by Cell Counting Kit-8. Two weeks after the model was established, the mice were injected with DC-OVA/CTL through tail vein. The chest of mice was scanned by micro-CT to observe lung images. The lung specimens were stained by H-E Staining for pathological examination. The expressions of CD8 in spleen, lymph nodes and tumor tissue were detected by immunohistochemistry (IHC); the expressions of SOX2, BMI in tumor tissue were also detected by IHC; serum IL-12 was detected by ELISA kit. Results OVA stripes were observed clearly detected by Western blotting. The proliferation of T cell stimulated by DC-OVA was increased significantly (P<0.05). Micro-CT did not show the image of lung cancer after 4 weeks DC vaccine treatment. Macro and micro morphological examination showed attenuated lesions of lung cancer in DC-OVA group. The expressions of CD8 in spleen, lymph nodes, and tumor tissues of nude mice in DC vaccine group were higher than those in control group (P<0.05,P<0.05,P<0.01). The expressions of SOX2, BMI1 in tumor tissue were lower in DC vaccine group than in control group (P<0.05,P<0.05). The serum levels of IL-12 was higher in DC vaccine group than that in control group (P<0.001).Conclusion DC vaccines modified by OVA can target lung cancer in nude mice to elicit anti-cancer effect.

DC vaccine; lung cancer; tumor stem cell; tumor immunotherapy; nude mice

10.16118/j.1008-0392.2016.04.003

2016-03-04

上海市教委科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目( 08ZZ19)

周 薇(1990—)，女，碩士研究生.E-mail： zhouweiyang1991@163.com

趙培林.E-mail： plzhao@yahoo.com

R 73

A

1008-0392(2016)04-0012-07