診斷用耐熱尿酸氧化酶菌株的篩選及條件優(yōu)化

張玉然，紀(jì)楠楠

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，山東 日照 276826)

診斷用耐熱尿酸氧化酶菌株的篩選及條件優(yōu)化

張玉然Δ，紀(jì)楠楠

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，山東 日照 276826)

目的 分離篩選及鑒定產(chǎn)耐熱尿酸氧化酶的菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件并研究酶學(xué)性質(zhì)。方法 利用透明圈法從高溫酒曲中篩選產(chǎn)耐熱尿酸氧化酶的菌株，擴(kuò)增菌株16S rDNA序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行鑒定，優(yōu)化菌株產(chǎn)尿酸氧化酶的發(fā)酵條件并研究該酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果 篩選獲得一株產(chǎn)耐熱尿酸氧化酶的菌株，經(jīng)分子鑒定命名為BacillussubtilisZX-6。于優(yōu)化后的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件下(30 ℃、初始pH 8.1、4 mL/L玉米漿)尿酸氧化酶水平達(dá)135.9 U/L，比優(yōu)化前提高了133.7%。該酶最適反應(yīng)溫度及pH分別為45 ℃和7.6，于37 ℃保溫48 h后，其剩余酶活仍為17.2%，具備良好的熱穩(wěn)定性。結(jié)論 產(chǎn)耐熱尿酸氧化酶菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化的成功為進(jìn)一步的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

尿酸氧化酶；BacillussubtilisZX-6；篩選；鑒定；條件優(yōu)化；酶學(xué)性質(zhì)

尿酸氧化酶(Urate oxidase，EC 1.7.3.3，UOD)是嘌呤降解代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它以分子氧為電子受體，催化氧化尿酸為尿囊素，其分子結(jié)構(gòu)依來源不同而有所差異。該酶在生物界中分布廣泛，細(xì)菌、真菌、植物、兩棲動物和大多數(shù)非靈長類動物體內(nèi)均含此酶，而在人類及部分高等靈長目動物體內(nèi)，由于UOD基因被提前終止，無法合成該酶。當(dāng)人體嘌呤代謝異常時(shí)，尿酸在血液中過量積累，將引發(fā)高尿酸血癥、痛風(fēng)病及腎病等[1-3]，開發(fā)有效治療此類疾病的藥物已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)難點(diǎn)，UOD則是治療該類疾病的有效藥物之一[4-6]。由于高尿酸血癥的發(fā)生與人們的生活方式、疾病因素密切相關(guān)，亦可定期對人體血清尿酸進(jìn)行監(jiān)測，及時(shí)控制尿酸水平，以預(yù)防高尿酸血癥的發(fā)生[7]。目前臨床多采用UOD-過氧化物酶偶聯(lián)法測定人體血清尿酸的含量[8]，開發(fā)一種熱穩(wěn)定性好、成本低廉的UOD十分必要。

早在1974年，UOD就已在黃曲霉中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)提純應(yīng)用于醫(yī)療[9]。目前，研究者對UOD的研究主要集中于其臨床藥效，對酶熱穩(wěn)定性、發(fā)酵條件等方面的研究則較少。已報(bào)道的可產(chǎn)UOD的微生物有黃曲霉、微桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等[10-12]，且部分生物的UOD基因已在大腸桿菌及酵母中成功表達(dá)[13-14]。

本研究旨在對高溫酒曲進(jìn)行富集培養(yǎng)，涂布于篩選培養(yǎng)基，利用透明圈法篩選產(chǎn)耐熱UOD的菌株。而后，對菌株的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，利用軟件MEGA 7.0進(jìn)行同源比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)優(yōu)化菌株發(fā)酵產(chǎn)UOD的條件，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，為優(yōu)質(zhì)廉價(jià)尿酸檢測劑盒和高尿酸血證治療藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 富集培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖6.0，NaCl 5.0，K2HPO4·3H2O 0.8，CaCl20.1，MgCl2·6H2O 0.2，黃嘌呤2.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 mg/L，Na2MoO4·2H2O 15.0 μg/L，調(diào)節(jié)pH 7.8。

1.1.2 種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，酵母粉1.0，K2HPO4·3H2O 0.8，玉米漿4.0 mL/L，葡萄糖3.0，調(diào)節(jié)pH 7.5。

1.1.3 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，葡萄糖13.0，酵母粉1.0，玉米漿4.0 mL/L，K2HPO4·3H2O 0.8，CaCl20.1，MgCl2·6H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 mg/L，Na2MoO4·2H2O 15.0 μg/L，次黃嘌呤3.0。

1.1.4 主要試劑及儀器：PCR儀(英國Fedbio公司)；核酸電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；酵母粉(英國Oxoid公司)；尿酸(生工生物工程股份有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；高溫酒曲(山東徐旭酒曲有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng)及篩選：吸取10 mL制備好的高溫酒曲菌懸液接入50 mL富集培養(yǎng)基中，于37 ℃180 r/min振蕩培養(yǎng)1～2 d，后將菌液稀釋涂布于固體篩選培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落長勢及透明圈大小。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化:采用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，60 mL發(fā)酵液(500 mL三角瓶)，接種量為3%，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)，優(yōu)化條件如下：

“這些純正糧食酒絕無勾兌，案上各樽不僅酒精度不同，而且釀造年份也不同，按烈度由低到高、年份由短到長依次排列。想必您已品出差別，先是淡雅清香，漸次沁脾芬芳，繼而濃郁醇厚，終于回甘無窮?！?/p>

① 溫度：種子培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接，分別于不同溫度下(30 ℃、37 ℃、45 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)。

② 初始pH：種子培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接至初始pH分別為7.1、7.6、8.1、8.6、9.1的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

③ 玉米漿濃度：種子培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接到含不同濃度玉米漿(0、2.0、4.0、6.0 mL/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

④ 酵母粉濃度：種子培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接到含不同濃度酵母粉(0、0.6、1.2、1.8、2.4 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.3 菌株16S rDNA序列的擴(kuò)增與分析：以提取的基因組DNA為模板，以通用引物1492R及27F為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR設(shè)定程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列的測定。使用NCBI數(shù)據(jù)庫分析測序獲得的菌株16S rDNA序列，并與庫中已存在種屬的16S rDNA序列進(jìn)行比對分析，同時(shí)利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行同源比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)初探

① 最適反應(yīng)溫度及pH：于30 ℃、37 ℃、45 ℃、52 ℃水浴條件下進(jìn)行酶活力的測定，以酶活力最高者為100%，計(jì)算不同溫度下的相對酶活(%)。于45℃，分別在pH 6.4、7.0、7.6、8.2的條件下進(jìn)行酶活力測定，以酶活力最高者為100%，計(jì)算不同pH下的相對酶活(%)。

② 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將酶液于37 ℃保溫，定時(shí)取樣進(jìn)行酶活力測定，以未水浴時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算不同水浴時(shí)間下的相對酶活(%)。

① 菌體干重測定：利用細(xì)胞干重法(DCW)，取150 mL發(fā)酵液，7 500 r/min離心10 min，置于105 ℃烘箱烘干至恒重，稱重后計(jì)算菌體濃度(g/L)。

② 酶偶聯(lián)分光光度法測定UOD酶活力：以尿酸為底物，參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[15-16]。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)耐熱UOD菌株的篩選 將富集培養(yǎng)的高溫酒曲菌懸液涂布于篩選平板，37 ℃培養(yǎng)，根據(jù)透明圈大小進(jìn)行初篩，初篩獲得的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定各菌株產(chǎn)UOD的水平，結(jié)果如圖1所示?？芍?，菌株ZX-6產(chǎn)UOD的能力相對較高，達(dá)58.2 U/L。

圖1 產(chǎn)耐熱UOD菌株的篩選Fig.1 Screening of high thermostable UOD-producing strain

2.2 產(chǎn)耐熱UOD菌株的分子鑒定

2.2.1 菌株16S rDNA序列的擴(kuò)增：利用通用引物1492R及27F對菌株ZX-6的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖2所示。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定該菌株的16S rDNA序列片段大小為1436 bp。

圖2 菌株ZX-6 16S rDNA序列擴(kuò)增的凝膠電泳條帶Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA sequence from strain ZX-6

2.2.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建：將菌株ZX-6 16S rDNA序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，同時(shí)利用軟件MEGA 7.0進(jìn)行同源比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3和表1所示。與不同種屬菌株的模式菌株進(jìn)行比對分析后，發(fā)現(xiàn)菌株ZX-6與B.subtilisstrain ATCC 6051親緣關(guān)系較近而聚成一支。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序進(jìn)一步同源比對，發(fā)現(xiàn)菌株ZX-6與B.subtilisstrain BAB-448、B.subtilisstrain J2和B.subtilissubsp.subtilisstrain I35的同源性最高，親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)100%。結(jié)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，可知菌株ZX-6為B.subtilis下的菌株，由此將菌株ZX-6命名為B. subtilis ZX-6。

圖3 基于16S rDNA序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree based on the analysis of 16S rDNA gene sequences

圖3 基于16S rDNA序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree based on the analysis of 16S rDNA gene sequences

菌株名稱相似度(%)ZX?6100B subtilisstrainBAB?448100B subtilisstrainJ2100B subtilissubsp subtilisstrainI35100B subtilisstrainB1199

2.3 發(fā)酵產(chǎn)UOD的條件優(yōu)化

2.3.1 溫度及pH對UOD發(fā)酵合成的影響：將菌株B.subtilisZX-6于不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖4所示?？芍罴寻l(fā)酵產(chǎn)酶溫度為30 ℃，達(dá)84.3 U/L，產(chǎn)酶水平比37 ℃發(fā)酵時(shí)提高了57.0%。

圖4 發(fā)酵溫度對菌株B. subtilis ZX-6合成UOD的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on UOD biosynthesis from B. subtilis ZX-6

分析不同初始pH值條件下B.subtilisZX-6 UOD的發(fā)酵合成情況(見圖5)，確定最佳發(fā)酵初始pH值為8.1，達(dá)113.9 U/L，產(chǎn)酶水平比pH 7.1時(shí)提高了25.4%。

圖5 發(fā)酵初始pH值對菌株B. subtilis ZX-6合成UOD的影響Fig.5 Effect of initial culture pH on UOD biosynthesis from B. subtilis ZX-6

2.3.2 氮源對UOD發(fā)酵合成的影響：大多數(shù)微生物嘌呤降解代謝的終產(chǎn)物為NH3、CO2和H2O等，參與此過程的降解酶的發(fā)酵合成與培養(yǎng)基中氮源的供給息息相關(guān)[17]，UOD參與嘌呤降解代謝中間產(chǎn)物尿酸的降解。圖6展示了添加不同濃度的玉米漿對B.subtilisZX-6生長及產(chǎn)UOD的影響，確定玉米漿最佳添加濃度為4 mL/L，產(chǎn)酶水平達(dá)114.5 U/L，比未添加時(shí)提高了170倍。

圖6 添加玉米漿對菌株B. subtilis ZX-6合成UOD的影響Fig.6 Effect of corn steep liquor on UOD biosynthesis from B. subtilis ZX-6

添加不同濃度的酵母粉對B.subtilisZX-6長勢及產(chǎn)酶的影響如圖7所示?？芍罴呀湍阜厶砑訚舛葹? g/L，這可能是由于酵母粉添加后會導(dǎo)致培養(yǎng)基中氮源富足，氮源消耗后產(chǎn)生的大量NH3將反饋抑制嘌呤的降解代謝，從而抑制相關(guān)降解酶的合成，后續(xù)發(fā)酵不再添加。

圖7 添加酵母粉對菌株B. subtilis ZX-6合成UOD的影響Fig.7 Effect of yeast extract on UOD biosynthesis from B. subtilis ZX-6

2.4 酶學(xué)性質(zhì)初探

2.4.1 UOD的最適反應(yīng)溫度及pH ：酶分子只在一定pH和溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，對B.subtilisZX-6 UOD的最適反應(yīng)溫度及pH進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示。由圖可知，該酶最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為7.6。

圖8 溫度(A)及pH(B)對UOD酶活力測定的影響Fig.8 Effect of temperature (A) and pH (B) on determination of UOD activity

2.4.2 UOD熱穩(wěn)定性分析：為考察B.subtilisUOD的熱穩(wěn)定性，將UOD酶液于37 ℃保溫，測定不同時(shí)間處的剩余酶活，結(jié)果如圖9所示。發(fā)現(xiàn)，水浴10 h后的剩余相對酶活為52.0%，水浴48 h后剩余相對酶活仍保留17.2%，表明所篩選的B.subtilisUOD熱穩(wěn)定良好。

圖9 37 ℃下UOD的熱失活曲線Fig.9 Thermal inactivation of UOD from B. subtilis at 37 ℃

3 討論

UOD是生物體內(nèi)嘌呤降解途徑中的一種酶，可催化尿酸降解為尿囊素、CO2和H2O2。該酶作為一種重要的醫(yī)藥用酶，在臨床上廣泛用于尿酸含量的測定[18]，又可作為藥物緩解痛風(fēng)以及尿酸水平過高引發(fā)的其他并發(fā)癥[4-6]，這就要求UOD必須具備良好的熱穩(wěn)定性。目前，研究者對來自于酵母菌和黃曲霉的UOD研究較多，并通過多種方法篩選獲得了產(chǎn)UOD的菌株。

高溫酒曲是在50 ℃～60 ℃的高溫下制備而成，其中富含多種耐熱微生物。本研究利用透明圈法從高溫酒曲的菌懸液中篩選獲得了一株產(chǎn)耐熱UOD的菌株，擴(kuò)增其16S rDNA序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，將該菌株命名為BacillussubtilisZX-6。發(fā)酵條件優(yōu)化是提高菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力的重要手段[19-20]，對影響菌株BacillussubtilisZX-6發(fā)酵產(chǎn)UOD的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，最佳產(chǎn)酶條件下(30 ℃、初始pH 8.1、4 mL/L玉米漿)UOD水平達(dá)135.9 U/L，比優(yōu)化前提高了133.7%。進(jìn)一步研究表明，該酶最適反應(yīng)溫度及pH分別為45 ℃和7.6，于37 ℃保溫48 h后，其剩余酶活仍為17.2%，具備良好的熱穩(wěn)定性。本研究可為優(yōu)質(zhì)廉價(jià)尿酸檢測劑盒和高尿酸血證治療藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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(編校：吳茜)

Screening of the diagnostic and thermostable urate oxidase-producing strain and optimization of the fermentation conditions

ZHANG Yu-ranΔ, JI Nan-nan

(College of Life Sciences, Ji’ning Medical University, Rizhao 276826, China)

ObjectiveTo screen a thermostable urate oxidase-producing strain, optimize the fermentation conditions and study the enzymatic properties.MethodsA urate oxidase-producing strain was screened from high temperature starter based on transparent circle method. Its 16S rDNA sequence was then amplified and analyzed. Meanwhile, the phylogenetic trees were built. Optimization of the fermentation conditions from this strain was carried out. The enzymatic properties of urate oxidase were studied.ResultsA urate oxidase-producing strain, namedBacillussubtilisZX-6 by molecular identification, was obtained. The production of urate oxidase under the optimized conditons (135.9 U/L) was 133.7% higher than before. The optimum reaction temperature and pH were 45 ℃ and 7.6 respectively. The residual activity of urate oxidase at 37 ℃ for 48 h was still 17.2%.ConclusionThe successful screening of a thermostable urate oxidase-producing strain and optimization of the fermentation conditions will lay a foundation for the further research.

urate oxidase;BacillussubtilisZX-6; screening; identification; optimization of conditions; enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.045

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015WS0416)；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金項(xiàng)目(JY2015BS12)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510443008)

張玉然，通信作者，女，博士，講師，研究方向：醫(yī)藥用生物活性物質(zhì)的篩選研究，E-mail：sheng666wu@163.com。

Q554

A