間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)干燥綜合征模型小鼠治療效應(yīng)的研究

阮光峰, 黃家樹, 黃琬雪, 湯建平

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200065)

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·基礎(chǔ)研究·

間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)干燥綜合征模型小鼠治療效應(yīng)的研究

阮光峰, 黃家樹, 黃琬雪, 湯建平

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200065)

目的 探討MSCs對(duì)晚期干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)模型小鼠的治療效果及血清中細(xì)胞因子濃度的影響。方法 16只雌性NOD/Ltj小鼠隨機(jī)分為疾病對(duì)照組和MSCs治療組，8只雌性C57BL/6小鼠作為健康對(duì)照組。監(jiān)測各組小鼠飲水量和血糖；MSCs治療組小鼠26周齡時(shí)進(jìn)行連續(xù)2周的尾靜脈MSCs注射；測算小鼠唾液流率；計(jì)算小鼠的下頜下腺淋巴細(xì)胞灶積分；ELISA檢測小鼠血清中IL-2、IL-6、HGF、IFN-γ、IL-10、PGE2、TGF-β1、TNF-α的水平。結(jié)果 從第16周齡開始，NOD小鼠飲水量及血糖水平顯著增加；治療后，MSCs治療組唾液流率下降幅度明顯小于同時(shí)期的疾病對(duì)照組；MSCs治療組下頜下腺淋巴細(xì)胞灶積分明顯小于疾病對(duì)照組；3組間多種與SS發(fā)病或MSCs免疫抑制功能相關(guān)的細(xì)胞因子差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 MSCs對(duì)晚期干燥綜合征模型小鼠有一定的治療效果，其可能通過改變血清中多種細(xì)胞因子濃度達(dá)到治療效應(yīng)。

干燥綜合征； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞因子

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)是一種以侵犯淚腺和唾液腺等外分泌腺、具有高度的淋巴細(xì)胞浸潤為特征的彌漫性結(jié)締組織病，最常見的表現(xiàn)是口、眼干燥癥，且常伴有內(nèi)臟損害而出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)[1]。非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠具有淋巴細(xì)胞異常浸潤唾液腺導(dǎo)致唾液腺破壞和分泌功能下降及淋巴細(xì)胞破壞胰腺導(dǎo)致高血糖等特點(diǎn)[2]。雌性NOD小鼠因具有類似于SS患者的唾液腺淋巴細(xì)胞浸潤導(dǎo)致分泌功能下降及血清中存在多種自身抗體等特點(diǎn)而被認(rèn)為是理想的SS模型小鼠[3-4]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，因其具有免疫抑制的功能和無免疫原性等特點(diǎn)，被認(rèn)為有可能用于治療多種自身免疫性疾病[5]。研究[6-8]顯示，MSCs可改善NOD小鼠唾液腺功能，減輕唾液腺淋巴細(xì)胞浸潤，但這些實(shí)驗(yàn)使用的NOD小鼠周齡為7～16周，代表了SS早期的階段(NOD小鼠于7～8周齡開始發(fā)生SS)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)26周齡的NOD小鼠進(jìn)行MSCs的治療，研究MSCs對(duì)晚期干燥綜合征模型小鼠的治療效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

16只6周齡的雌性NOD/Ltj小鼠和8只6周齡的雌性C57BL/6小鼠購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將NOD/Ltj小鼠隨機(jī)分為疾病對(duì)照組8只，MSCs治療組8只，將C57BL/6小鼠作為健康對(duì)照組。

1.2 MSCs的來源與鑒定

MSCs從同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院新生兒臍帶中分離獲得，其具體步驟參照文獻(xiàn)[9]。MSCs培養(yǎng)至3～5代時(shí)用于本實(shí)驗(yàn)。使用人MSC鑒定試劑盒(美國BD公司)流式鑒定MSCs純度。

1.3 小鼠飲水量、血糖和唾液流率的測定

間隔24h測量小鼠飼養(yǎng)籠盒中水瓶的重量，其差值即為該籠中小鼠當(dāng)日的總飲水量。使用血糖儀測量小鼠血糖。具體方法為用75%的酒精消毒后的刀片切割小鼠尾靜脈，將流出的血液滴到血糖儀試紙上，用血糖儀讀取并記錄結(jié)果。測量小鼠唾液流率前，以10ml/kg體質(zhì)量的劑量使用4%的水合氯醛使小鼠麻醉，以0.5mg/kg體質(zhì)量的劑量皮下注射毛果蕓香堿刺激唾液分泌。將稱重后的棉條塞入小鼠口中，10min后取出棉條再次稱質(zhì)量，其兩次體質(zhì)量之差即為小鼠該時(shí)段內(nèi)分泌的唾液量。

1.4 MSCs的治療

MSCs治療組小鼠在其26周齡時(shí)接受注射MSCs治療，將0.4ml含有5×105個(gè)MSCs的磷酸鹽緩沖液通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，每周2次，連續(xù)2周。

1.5 下頜下腺淋巴細(xì)胞灶積分

30周齡時(shí)處死全部3組小鼠，取出其下頜下腺，放入多聚甲醛中，置于4℃固定24h，用乙醇脫水和二甲苯透明后用石蠟包埋，將組織切成 10mm 薄片后H-E染色。顯微鏡下觀察切片，進(jìn)行淋巴細(xì)胞灶計(jì)數(shù)，4mm2腺泡組織內(nèi)淋巴細(xì)胞聚集數(shù)在50個(gè)以上記為一個(gè)病灶，計(jì)算淋巴細(xì)胞灶積分。

1.6 ELISA檢測血清細(xì)胞因子

心臟穿刺法取出小鼠血液，離心獲得血清，用ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)分別檢測血清中IL-2、IL-6、HGF、IFN-γ、IL-10、PGE2、TGF-β1、TNF-α的水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

流式鑒定結(jié)果顯示： FITC抗人CD90(+)，PerCP-CyTM5.5抗人CD105(+)，APC抗人CD73(+)，而PE抗人CD45、PE抗人CD34、PE抗人CD11b、PE抗人CD19、PE抗人HLA-DR(-)。MSCs陽性率為97.5%，表明分離培養(yǎng)得到的MSCs純度較高(圖1)。

圖1 人臍帶來源MSCs流式鑒定結(jié)果Fig.1 Flow cytometric analysis of human umbilical cord mesenchymal stem cells

2.2 NOD小鼠的飲水量和血糖變化

本研究監(jiān)測了NOD小鼠從10～25周齡飲水量及從10～24周齡血糖的變化情況。NOD小鼠日飲水量和血糖在其16周齡后呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(圖2)。飲水量和血糖一定程度上反映了NOD小鼠疾病的嚴(yán)重程度，以上結(jié)果顯示NOD小鼠16周齡后病情不斷地加重。

圖2 不同周齡的NOD小鼠的飲水量和血糖Fig.2 Water consumption and blood glucose levels of NOD mice at different ages

2.3 NOD小鼠唾液流率的下降

測量各組小鼠的26周齡時(shí)(MSCs治療前)和30周齡時(shí)(MSCs治療結(jié)束2周后)的唾液流率。健康對(duì)照組小鼠在其26周齡和30周齡的唾液流率幾乎沒有變化(P=0.933)；疾病對(duì)照組小鼠的唾液流率明顯下降(P=0.001)；而MSCs治療組小鼠唾液流率在這一期間下降較為緩慢(P=0.039)，見圖3。

圖3 三組小鼠在26、30周齡時(shí)的唾液流率Fig.3 Salivary flow rates of the three groups inat 26 weeks and 30 weeks of age*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 MSCs治療組小鼠與疾病對(duì)照組小鼠下頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤情況

MSCs治療結(jié)束2周后，取下頜下腺進(jìn)行H-E染色，顯微鏡下觀察腺體淋巴細(xì)胞浸潤情況。健康對(duì)照組小鼠下頜下腺幾乎無淋巴細(xì)胞浸潤，而疾病對(duì)照組和MSCs治療組小鼠下頜下腺則均有明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(圖4)。健康對(duì)照組、疾病對(duì)照組和MSCs治療組小鼠下頜下腺淋巴細(xì)胞灶積分分別為0±0、2.44±0.48和1.52±0.66，MSCs治療組較疾病對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。

2.5 三組小鼠血清中可溶性因子水平

與健康對(duì)照組相比，疾病對(duì)照組IL-2、IL-6、IFN-γ、TGF-β1表達(dá)上調(diào)，而HGF、IL-10表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與疾病對(duì)照組相比，MSCs治療組IL-6、HGF、IL-10、PGE2、TGF-β1表達(dá)上調(diào)，而IL-2、IFN-γ表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖4 三組小鼠下頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤情況Fig.4 Lymphocyte infiltration in submandibular glands in three groupsA： 健康對(duì)照組；B： 疾病對(duì)照組；C： MSCs治療組

組別IL-2IL-6HGFIFN-γIL-10PGE2TGF-β1TNF-α疾病對(duì)照組5.11±2.8736.62±27.11115.49±50.547.00±2.33117.23±50.37819.12±235.89904.89±66.59211.49±32.40健康對(duì)照組2.48±1.44*19.77±7.97*279.32±138.65**2.25±0.83***164.16±80.83**739.27±137.52697.72±54.54**159.11±36.51MSCs治療組1.78±0.94*168.36±68.37***343.95±76.63**3.68±1.50*248.82±51.93*1465.91±220.51***1044.14±41.78*171.71±41.56

與疾病對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

MSCs具有免疫抑制功能，可能被用以治療多種自身免疫性疾病。研究[6-8]顯示，MSCs可改善NOD小鼠SS的臨床和病理學(xué)表現(xiàn)。然而這些研究使用的NOD小鼠均在其SS早期的階段就接受了MSCs的治療。SS的眼干、口干的癥狀是淋巴細(xì)胞浸潤及破壞淚腺和唾液腺導(dǎo)致的[10]。MSCs通過抑制淋巴細(xì)胞的活化和增殖從而發(fā)揮其治療作用[6]。隨著SS病情的發(fā)展，越來越多的淚腺及唾液腺細(xì)胞被破壞，在病情發(fā)展到一定程度后MSCs的治療是否仍然有效尚不清楚。本研究監(jiān)測NOD小鼠飲水量和血糖，發(fā)現(xiàn)其在小鼠16周齡后均出現(xiàn)明顯的上升趨勢，表明NOD小鼠在這期間病情不斷的加重。本研究將26周齡的NOD小鼠作為晚期SS模型小鼠接受MSCs的注射治療。在治療前及治療結(jié)束兩周后，檢測MSCs治療組和相同周齡的健康對(duì)照組及疾病對(duì)照組小鼠的唾液流率，結(jié)果顯示26周齡和30周齡的健康對(duì)照組小鼠唾液流率明顯高于其對(duì)應(yīng)周齡的MSCs治療組和疾病對(duì)照組小鼠。在 26～30周齡，疾病對(duì)照組小鼠唾液流率下降明顯，而MSCs治療組小鼠唾液流率下降幅度則較小。下頜下腺淋巴細(xì)胞灶積分結(jié)果也顯示MSCs治療組小鼠積分明顯低于疾病對(duì)照組小鼠。以上結(jié)果表明，MSCs治療對(duì)相對(duì)晚期SS的NOD小鼠仍有一定作用。之前幾個(gè)相對(duì)早期SS的NOD小鼠接受MSCs治療的實(shí)驗(yàn)顯示MSCs治療可逆轉(zhuǎn)NOD小鼠下降的唾液流率，其療效優(yōu)于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果(只能延緩?fù)僖毫髀实南陆?。原因可能是由于在SS早期，唾液腺浸潤的淋巴細(xì)胞僅僅影響了唾液腺細(xì)胞的狀態(tài)，注射MSCs抑制了淋巴細(xì)胞后唾液腺細(xì)胞又可恢復(fù)其功能。而在SS晚期，相當(dāng)部分的唾液腺細(xì)胞已經(jīng)死亡，此時(shí)注射MSCs只能延緩疾病進(jìn)程。這一結(jié)果也提示SS患者早期接受MSCs的治療可能會(huì)有更好的療效。

本研究測量了小鼠血清中與SS發(fā)病或MSCs治療效應(yīng)有關(guān)的一些細(xì)胞因子水平，如IL-10、HGF、PGE2和TGFβ1等[11]。這些細(xì)胞因子在MSCs治療組中較疾病對(duì)照組均有所升高，表明MSCs在NOD小鼠中較好地發(fā)揮了免疫抑制作用。INF-γ、TNF-α和IL-6等促炎因子在SS患者體內(nèi)高表達(dá)[12-14]。在本研究中，INF-γ、TNF-α和IL-6在疾病對(duì)照組小鼠血清中的濃度均高于健康對(duì)照組(TNF-α在各組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，證明了動(dòng)物模型的可靠性。MSCs治療組血清中INF-γ和TNF-α的濃度低于疾病對(duì)照組。MSCs治療組IL-6濃度顯著高于疾病對(duì)照組，這一結(jié)果與Jurewicz等[15]的報(bào)道結(jié)果一致。IL-6一般被認(rèn)為是一種可促進(jìn)T細(xì)胞增殖和活化及B細(xì)胞分化的促炎因子[16]，然而也有報(bào)道[17]顯示IL-6與MSCs抑制單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化有關(guān)，所以IL-6在MSCs免疫抑制功能中所發(fā)揮的整體作用仍有待進(jìn)一步的研究。IL-2是一種多效性細(xì)胞因子，低劑量的IL-2可通過促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖而抑制炎癥反應(yīng)，而高劑量的IL-2則可通過促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞的分化而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[18-19]。在本研究中，疾病對(duì)照組小鼠血清中IL-2水平高于健康對(duì)照組和MSCs治療組，然而本實(shí)驗(yàn)各組間不同的IL-2水平在SS發(fā)生發(fā)展及緩解中發(fā)揮的作用仍不清楚，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，MSCs對(duì)較晚期的SS模型小鼠有一定療效，但其療效不如較早期接受MSCs治療的SS模型小鼠顯著。多種細(xì)胞因子可能在MSCs治療SS的過程中發(fā)揮了作用，但這些細(xì)胞因子在這一過程中發(fā)揮作用的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Therapeutic effect of mesenchymal stem cells on mice with Sj?gren’s syndrome

RUANGuang-feng,HUANGJia-shu,HUANGWan-xue,TANGJian-ping

(Dept．of Rheumatology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the therapeutic effect of mesenchymal stem cells (MSCs) on mice with Sj?gren’s syndrome. Methods Sixteen female NOD/Ltj mice were randomized into disease group and MSC treated group, and 8 female C57BL/6 mice served as normal control group. The mice in MSC treated group received MSCs injection at 26 weeks of age for 2 consecutive weeks. Water intake, blood glucose and salivary flow rate were measured; the lymphocyte infiltration score of submandibular glands was calculated; serum levels of IL-2, IL-6, HGF, IFN-γ, IL-10, PEG2, TGF-β1 and TNF-α were measured by ELISA. Results Water consumption and blood glucose of NOD mice were increased rapidly after 16 weeks of age. MSCs treatment prevented the decline of salivary flow rate and lymphocytes infiltration in submandibular glands of NOD mice. There were significant differences in serum concentrations of cytokines among 3 groups. Conclusion MSCs treatment is effective for NOD mice with Sj?gren’s syndrome, which may be associated with the alteration of cytokines levels.

Sj?gren’s syndrome; mesenchymal stem cells; cytokines

10.16118/j.1008-0392.2016.01.002

2015-10-12

國家自然科學(xué)基金(81273295)

阮光峰(1989—)，男，碩士研究生.E-mail： ruan1989.ok@163.com

湯建平.Email： tangjp6512@126.com

R 593

A

1008-0392(2016)01-0007-05