LC-MS/MS 測定小鼠腎臟中甘草次酸的含量

封　聰，霍韜光，王守云，張穎花，吳　輝，姜　泓*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110122；　2. 中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122)

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LC-MS/MS 測定小鼠腎臟中甘草次酸的含量

封聰1，霍韜光1，王守云2，張穎花1，吳輝1，姜泓1*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110122；2. 中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122)

摘要：建立LC-MS/MS測定小鼠腎臟中甘草次酸含量的方法. 本法以原兒茶酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，對腎臟中甘草次酸進(jìn)行定量研究. 結(jié)果所建方法靈敏、精確、快速、線性范圍寬，可用于甘草次酸與雄黃聯(lián)合用藥小鼠腎臟中甘草次酸的含量測定.

關(guān)鍵詞：液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；甘草次酸；原兒茶酸；含量測定

甘草次酸(glycyrrhetinic acid)是甘草的主要有效成分甘草酸及其鹽(即甘草甜素)的代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝細(xì)胞、抗氧化及腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，具有明顯增強(qiáng)肝腎的解毒功能和腦保護(hù)作用[1-3]. 近年來，對生物樣品中甘草次酸含量測定方法的研究時(shí)有報(bào)道，但多集中在對血漿樣品中甘草次酸含量測定上[4-6]，而有關(guān)組織樣品中測定甘草次酸含量的方法少有報(bào)道. 本研究將采用二級質(zhì)譜掃描的方法對腎臟中甘草次酸進(jìn)行定量分析，并首次選用原兒茶酸作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，建立LC-MS/MS測定小鼠腎臟中甘草次酸含量的方法. 并將該法應(yīng)用于甘草次酸對雄黃解毒的研究中，為甘草與雄黃配伍機(jī)制的研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

1290液相色譜-6420 三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國，Agilent)，ER-182A全自動(dòng)電子天平(十萬分之一) (日本A&D公司)；3K-18型超速低溫冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Easypure純水系統(tǒng)(美國，Barnstead公司).

甘草次酸(上海源葉生物科技有限公司)，原兒茶酸(中國藥品生物制品檢定所，809-9201)，甲醇(質(zhì)譜純，美國Sigma公司)，乙腈(質(zhì)譜純，美國Sigma公司).

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取甘草次酸對照品適量，用甲醇溶解，得濃度為322.6 mg/L的甘草次酸儲(chǔ)備液. 精密量取儲(chǔ)備液適量，配成濃度為67.20、134.4、336.0、672.0、1 344、6 720 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)對照溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?

精密稱取原兒茶酸適量，用甲醇溶解，得濃度為920.0 μg/L的原兒茶酸儲(chǔ)備液. 臨用前精密量取儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度為184.0 μg/L溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2色譜條件和質(zhì)譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(Agilent 4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水(體積比80∶20)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL.

電噴霧(ESI)離子源，負(fù)離子模式，掃描方式為多反應(yīng)檢測(MRM)，甘草次酸m/z為469.4→425.4，原兒茶酸m/z為153.1→109.1. 毛細(xì)管電壓為3 500 V，離子源溫度為330 ℃，甘草次酸和原兒茶酸的毛細(xì)管出口電壓分別為200 V和100 V，碰撞電壓(CE)分別為38 V和15 V；保護(hù)氣流量10 L/min.

1.2.3樣品溶液的制備

精密稱取腎臟組織200 mg，加入乙腈1.0 mL，超聲破碎2 min，然后加入濃度為184 μg/L的原兒茶酸內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，混勻，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)10 min. 取上清液，濃縮至干，殘?jiān)?0 μL乙腈-水(體積比80∶20)復(fù)溶，離心5 min (4 ℃，12 000 r·min-1)，取上清液進(jìn)樣分析.

1.2.4應(yīng)用

SPF級雄性ICR小鼠50只，體重(20±2) g，均由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，小鼠自由攝食及飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w. 按照體重隨機(jī)分為5組，每組10只. 第1組為對照組，灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液；第2組為雄黃對照組，灌胃給予雄黃1.35 g/kg；第3組為甘草次酸對照組，灌胃給予甘草次酸48 mg/kg；第4組為甘草次酸干預(yù)低劑量組灌胃給予甘草次酸(16 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)；第5組為甘草次酸干預(yù)高劑量組灌胃給予甘草次酸(48 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg). 每日灌胃1次，連續(xù)8 w. 每隔3 d稱量體重1次，調(diào)節(jié)灌胃容量. 于末次給藥24 h后，無水乙醚麻醉，冰浴取小鼠腎臟組織，用冷0.9%生理鹽水沖洗干凈，待用.

1.3方法學(xué)考察

1.3.1專屬性

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，除不加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，按“1.2.3”項(xiàng)下依法操作；將一定濃度的甘草次酸和內(nèi)標(biāo)溶液加入混合腎組織勻漿液中，依同法操作；取雄黃對照組、甘草次酸對照組、甘草次酸聯(lián)合用藥低劑量組和聯(lián)合用藥高劑量組大鼠腎組織樣品，依同法操作，進(jìn)樣10 μL，得色譜圖.

1.3.2線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，分別加入甘草次酸系列對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各200 μL，得濃度為9.600、19.20、48.00、96.00、192.0、960.0 μg/L的甘草次酸腎組織樣品，按“1.2.3”項(xiàng)操作處理，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線. 以甘草次酸和內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)，以甘草次酸濃度為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法線性回歸，求得回歸方程.

1.3.3精密度和準(zhǔn)確度

按“1.3.2”項(xiàng)下操作，制備甘草次酸低、中、高三個(gè)濃度(50.00、250.0、800.0 μg/L)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度樣本平行制備5份，重復(fù)三個(gè)分析批，連續(xù)測定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的測定濃度，與配制的濃度對照，求得精密度和準(zhǔn)確度.

1.3.4提取回收率

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，按“1.3.2”項(xiàng)下操作，制備甘草次酸低、中、高三個(gè)濃度(50、250、800 μg/L)的QC樣品，每一濃度樣本平行制備5份；另取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，除不加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)外，按“1.3.2”項(xiàng)下操作，向獲得的殘?jiān)屑尤雰?nèi)標(biāo)溶液和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各200 μL，渦旋混合，濃縮至干，殘?jiān)?0 μL乙腈-水(體積比80∶20)復(fù)溶，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液進(jìn)樣分析，獲得峰面積，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比計(jì)算甘草次酸和內(nèi)標(biāo)的提取回收率.

1.3.5樣品穩(wěn)定性

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，按“1.3.2”項(xiàng)下操作，制備甘草次酸低、中、高三個(gè)濃度(50、250、800 μg/L)的QC樣品，每一濃度樣本平行制備5份，分別考察樣品經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)后(-20到20 ℃)、室溫放置24 h及-20 ℃儲(chǔ)存30 d的穩(wěn)定性.

1.3.6基質(zhì)效應(yīng)

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，除不加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)外，按“1.3.2”項(xiàng)下操作，向獲得的殘?jiān)屑尤雰?nèi)標(biāo)溶液和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各200 μL，渦旋混合，濃縮至干，殘?jiān)?0 μL乙腈-水(體積比80∶20)復(fù)溶，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液進(jìn)樣分析. 另精密吸取低、中、高三個(gè)濃度的甘草次酸對照品溶液200 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μL濃縮至干，殘?jiān)?0 μL乙腈-水(體積比80∶20)復(fù)溶，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液進(jìn)樣分析，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比計(jì)算甘草次酸和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng).

1.4統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行各指標(biāo)組間差異的顯著性檢驗(yàn)，以P< 0.05作為檢驗(yàn)的顯著性差異.

2結(jié)果與討論

2.1LC-MS/MS條件優(yōu)化

近年來，采用LC-MS測定甘草次酸含量的研究報(bào)道多采用一級質(zhì)譜掃描方式進(jìn)行測定[4]，這種掃描方式無法減小因生物基質(zhì)效應(yīng)給測定結(jié)果造成的干擾. 本研究采用電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式，掃描方式為多反應(yīng)檢測對腎臟中甘草次酸的含量進(jìn)行測定. 在保證提高檢測靈敏度、準(zhǔn)確度的同時(shí)，可有效的減小生物基質(zhì)效應(yīng)給測定結(jié)果造成的干擾. 本研究對二級質(zhì)譜掃描進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，甘草次酸m/z為469.4→425.4，原兒茶酸為153.1→109.1. 毛細(xì)管電壓3 500 V，離子源溫度330 ℃，甘草次酸和原兒茶酸的毛細(xì)管出口電壓分別為200 V和100 V，碰撞電壓(CE)分別為38 V和15 V；保護(hù)氣流量10 L/min. 并對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈-水(體積比80∶20)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL.

2.2內(nèi)標(biāo)物的選擇及方法的專屬性

采用內(nèi)標(biāo)法測定甘草次酸含量時(shí)，有研究報(bào)道熊果酸、格列喹酮、潑尼松龍作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[4-6]. 根據(jù)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇原則，本實(shí)驗(yàn)選擇原兒茶酸、齊墩果酸、沒食子酸為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行比較，原兒茶酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與甘草次酸類似，能完全溶解于待測組織勻漿液中，不與甘草次酸發(fā)生化學(xué)作用，并與甘草次酸色譜峰完全分離，甘草次酸和原兒茶酸的保留時(shí)間分別為3.265和0.897 min(見圖1)，且甘草次酸m/z為469.4→425.4，原兒茶酸為153.1→109.1. 所選3種內(nèi)標(biāo)物中原兒茶酸響應(yīng)最高，穩(wěn)定性最好，所以選用原兒茶酸作為內(nèi)標(biāo)物. 目前，有關(guān)選用原兒茶酸作為甘草次酸含量測定的研究未見報(bào)道.

在分析復(fù)雜的生物組織樣品時(shí)，生物基質(zhì)效應(yīng)對測量結(jié)果的影響不容忽視. 由圖1可見，小鼠腎臟組織中其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾甘草次酸和原兒茶酸的測定. 結(jié)果表明，該方法具有良好的專屬性.

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、穩(wěn)定性及基質(zhì)效應(yīng)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用建立的LC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析. 甘草次酸回歸方程為Y=0.123 03X+1.036 7(r=0.998 9)，結(jié)果表明，在9.600～960.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

精密度、準(zhǔn)確度、回收率、穩(wěn)定性與基質(zhì)效應(yīng)見表1. 實(shí)驗(yàn)證明，日內(nèi)及日間精密度、準(zhǔn)確度和回收率較好，并且基質(zhì)效應(yīng)不會(huì)對甘草次酸的含量測定結(jié)果造成影響.

此外，對樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果在室溫條件下穩(wěn)定24 h，-20 ℃冰凍條件下穩(wěn)定30 d，反復(fù)凍融3次均不影響樣品中甘草次酸的含量.

表1　甘草次酸的精密度、準(zhǔn)確度、回收率及基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

2.4應(yīng)用及討論

結(jié)果表明，甘草次酸對照組、甘草次酸聯(lián)合用藥低劑量組、甘草次酸聯(lián)合用藥高劑量組中甘草次酸的含量分別為(4 992.6±719.7) ng/g、(337.18±119.16) ng/g和(862.70±251.96) ng/g，對照組和雄黃組未檢出甘草次酸. 甘草次酸高劑量組、甘草次酸對照組與甘草次酸低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05).

雄黃是含砷礦物藥，雄黃及其制劑中含有大量砷[7-8]，在給予雄黃的大鼠血、腦及腎臟中均檢測到砷[9-11]，而長期服用含雄黃制劑易引起藥源性慢性砷中毒，造成腎臟損害[12-15]. 臨床上，雄黃常與甘草配伍使用. 甘草為國老藥，具有調(diào)和諸要的作用，對雄黃的毒性也有一定的解毒作用[16]. 本研究結(jié)果表明，甘草次酸干預(yù)后，腎臟中甘草次酸含量明顯降低，可能與甘草次酸對雄黃的解毒作用有關(guān)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探討.

3結(jié)論

以原兒茶酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用二級質(zhì)譜掃描的方法建立了LC-MS/MS測定腎臟中甘草次酸含量的方法，該法具有較高的專屬性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和回收率，可用于甘草與雄黃配伍機(jī)制的研究.

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[責(zé)任編輯：吳文鵬]

收稿日期：2016-01-11.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473417).

作者簡介：封聰(1989-), 男, 碩士生, 研究方向?yàn)榉治龆纠韺W(xué). *通訊聯(lián)系人, E-mail: jianghong@mail.cmu.edu.cn.

中圖分類號：R286.02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1011(2016)03-0318-05

Glycyrrhetinic acid content in kidney of mouse determined by LC-MS/MS

FENG Cong1, HUO Taoguang1, WANG Shouyun2, ZHANG Yinghua1,WU Hui1, JIANG Hong1*

(1.CollegeofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China;2.CollegeofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

Abstract:LC-MS/MS method was established for the determination of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse. Multiple reaction monitoring scanning mode was used for the quantification of glycyrrhetinic acid using protocatechuic acid as the internal standard. The method has the advantages of sensitive, accurate, rapid and a wide linear range. The method was successfully used for the quantification of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse treated combination with glycyrrhetinic acid and realgar.

Keywords:LC-MS/MS; glycyrrhetinic acid; protocatechuic acid; content determination