利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)分析溫度及pH值對(duì)H1N1亞型流感病毒增殖的影響

賈瀟瀟，李蕓，范文輝，孫清嵐，周鐵忠，劉文軍，李晶

1 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京　100049 3 中國科學(xué)院微生物研究所 網(wǎng)絡(luò)信息中心，北京　100101 4 遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州　121001

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利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)分析溫度及pH值對(duì)H1N1亞型流感病毒增殖的影響

賈瀟瀟1,2，李蕓1，范文輝1，孫清嵐3，周鐵忠4，劉文軍1,2，李晶1

1 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049 3 中國科學(xué)院微生物研究所 網(wǎng)絡(luò)信息中心，北京100101 4 遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001

賈瀟瀟, 李蕓, 范文輝, 等. 利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)分析溫度及pH值對(duì)H1N1亞型流感病毒增殖的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 447–456.

Jia XX, Li Y, Fan WH, et al. Effects of temperature and pH on the growth of H1N1 subtype of influenza A virus by surface-enhanced Raman spectroscopy. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 447–456.

摘要:表面增強(qiáng)拉曼光譜 (SERS) 是一種基于納米顆粒的拉曼光譜，可以高靈敏度地檢測流感病毒等重要病原微生物，鑒定不同毒株間的差異。為了建立一種快速檢測流感病毒SERS的方法，本實(shí)驗(yàn)利用SERS技術(shù)對(duì)流感病毒H1N1亞型不同毒株在不同溫度和pH值的條件下進(jìn)行了病毒毒價(jià)強(qiáng)弱的檢測，將流感病毒樣品與金納米顆粒混合靜置后用拉曼共聚焦顯微鏡進(jìn)行激光掃描。結(jié)果顯示在pH為7.2、溫度為37 ℃的條件下3 個(gè)H1N1亞型的毒株SERS檢測結(jié)果顯示均出現(xiàn)至少1個(gè)大于 (或等于) 3 000的峰值，該狀態(tài)下病毒毒價(jià)最強(qiáng)，最適合病毒生長。另外，細(xì)胞生物學(xué)方法與SERS技術(shù)結(jié)果一致，檢測中均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞:表面增強(qiáng)拉曼光譜，流感病毒，溫度，pH值

Received: August 9, 2015; Accepted: September 17, 2015

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB955501), National Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2013ZX10004-610), National Natural Science Foundation of China (No. 31100644).

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB955501)，“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng) (No.

流感病毒屬正粘病毒科，含有單股負(fù)鏈RNA基因組，是在世界范圍內(nèi)流行并引發(fā)疾病和死亡的一種病毒。至今正粘病毒科包括：A型流感病毒[1]、B型流感病毒[2]、C型流感病毒、托高土病毒[3]和蜱媒病毒[4]。A型流感病毒(Influenza A virus，IAV) 根據(jù)其表面血凝素蛋白(HA) 和神經(jīng)氨酸酶 (NA) 的變異情況分為不同的亞型，HA分16個(gè)亞型，NA分9個(gè)亞型，以HxNx方式組合，從H1N1至H15N9，目前共有135種亞型。絕大多數(shù)的A型流感病毒都分離自鳥類，歷史上易引起人或禽類間大范圍傳播的主要是H1N1[5]、H3N2[6]等亞型，H5N1、H7N9[7]等亞型的流感病毒致死率較高。然而，目前涉及環(huán)境因子 (如溫度、pH值等) 與流感病毒粒子毒價(jià)相互影響及作用關(guān)系的報(bào)道較少。

1928年，印度科學(xué)家 (Raman C.V.) 發(fā)現(xiàn)了由光子的非彈性碰撞產(chǎn)生的一種光散射現(xiàn)象——拉曼散射并因此命名[8]。這種非彈性碰撞的原理是在碰撞過程中光子與分子之間發(fā)生不完全碰撞，從而光子與分子之間進(jìn)行能量的傳遞，使得光子既改變了運(yùn)動(dòng)方向也改變了運(yùn)動(dòng)的頻率[9]。拉曼光譜被發(fā)現(xiàn)后主要應(yīng)用于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定。表面增強(qiáng)拉曼光譜作為拉曼光譜的一種，其主要原理是利用納米金屬顆粒與被測分子間的相互作用來提高圖譜的信噪比，增強(qiáng)不同樣品之間的峰圖差異[10]。近年來研究人員利用SERS技術(shù)對(duì)一些常見病原菌進(jìn)行了快速檢測鑒定，并對(duì)混合菌種進(jìn)行了區(qū)分[11-13]，本文旨在構(gòu)建表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)檢測不同溫度及pH值條件下H1N1亞型流感病毒毒價(jià)強(qiáng)弱的方法，并初步探究與細(xì)胞生物學(xué)方法的關(guān)聯(lián)性。

1　材料與方法

1.1病毒株

流感病毒A/WSN/33 (H1N1) (以下簡稱為WSN)、A/PR/8 (H1N1) (以下簡稱為PR8)、A/California/04/2009 (以下簡稱為CA04)，由中國科學(xué)院微生物研究所分離、鑒定和保藏。

1.2細(xì)胞株及雞胚

犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代和保藏。SPF雞胚 (10日齡) 購自 (北京) 梅里亞動(dòng)物保健有限公司。

1.3主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自英濰捷基 (上海) 貿(mào)易有限公司；青鏈霉素混合液 (儲(chǔ)存濃度107U/mL、終濃度104U/mL)、TPCK-Trypsin(儲(chǔ)存濃度2 mg/mL、終濃度2 μg/mL) 購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司；0.1 mol/L檸檬酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用的KlariteTM金納米基底購自D3技術(shù) (英國)有限責(zé)任公司，由國家納米科學(xué)中心合成并惠贈(zèng)。

1.4病毒樣品的收集與純化

將流感病毒毒株WSN、CA04、PR8分別接種于SPF雞胚，72 h收集尿囊液以5 000 r/min離心20 min，取上清液；將上清液以105×g (Ti40)離心2 h，將沉淀物用1 mL 0.01 mol/L PBS (pH 7.4) 懸浮，振蕩均勻；加至依次由30%、 40%、50%、60%蔗糖制成的密度梯度上，以105×g (SW40) 離心2 h，取沉淀?xiàng)l帶；取沉淀?xiàng)l帶加10倍量PBS懸浮、振勻。再次以105×g (Ti40) 離心2 h，取沉淀用200 μL 0.01 mol/L PBS (pH 7.4)懸浮、振勻，–80 ℃保存。

1.5拉曼光譜儀檢測參數(shù)的設(shè)定

設(shè)置拉曼光譜儀的如下參數(shù)。

關(guān)鍵參數(shù)為：Spectral acquisition setup。

在Range界面設(shè)置如下參數(shù)：

Grating scan type: Extended; Confocality: Standard; Spectrum Range: Low 100.00; Centre Raman shit/cm–1; High 2 000.00; Configuration: Laser name 532 nm edge; Grating name 1 800 l/mm。

在Acquisition界面設(shè)置如下參數(shù)：

Exposure time/s: 20.00; AccumuLations: 1; Objective: 50; Laser power %: 100。

1.6不同毒株SERS穩(wěn)定性檢測

在溫度條件為37 ℃，pH條件為7.2的環(huán)境下分別培養(yǎng)WSN、CA04、PR8三種病毒并純化。將純化后的流感病毒液樣品滴加10 μL到載玻片中，向載玻片的樣品中滴加5 μL 100 nm金納米顆粒，靜置10 s，拉曼光譜儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin8.0收集峰圖并進(jìn)行平滑均一化處理，最后將峰圖進(jìn)行擬合。

1.7細(xì)胞感染及病毒滴定檢測

取生長良好的細(xì)胞，運(yùn)用10% FBS、1‰ PS DMEM制備細(xì)胞懸液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL的懸液，然后加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，使其鋪滿單層。將待測定病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取6–8個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

96孔板中細(xì)胞長滿單層后，將原培養(yǎng)液棄掉；在96孔板的第11、12兩列每孔各加100 μL含TPCK-Trypsin (終濃度為2μg/mL) 1‰ PS 的DMEM作為陰性對(duì)照。病毒稀釋液從低濃度開始每個(gè)稀釋度加8個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL，用10–1至10–10連續(xù)梯度稀釋的病毒稀釋液依次感染96孔板中的細(xì)胞。置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變孔數(shù)并記錄，按Reed-Muench氏法[14]計(jì)算TCID50。

1.8不同溫度條件拉曼技術(shù)檢測

將在溫度條件分別為37 ℃、50 ℃、52.5 ℃、55 ℃、57.5 ℃和60 ℃下培養(yǎng)的病毒進(jìn)行純化后，將純化的流感病毒液樣品滴加10 μL到載玻片中，隨后向載玻片的樣品中滴加5 μL 100 nm金納米顆粒，靜置10 s，拉曼光譜儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin8.0收集峰圖并進(jìn)行平滑均一化處理，最后將峰圖進(jìn)行擬合。

1.9不同pH條件拉曼技術(shù)檢測

將在pH條件分別為4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.2下培養(yǎng)的病毒進(jìn)行純化后，將純化的流感病毒液樣品滴加10 μL至載玻片中，隨后向載玻片的樣品中滴加5 μL 100 nm金納米顆粒，靜置10 s，拉曼光譜儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin8.0收集峰圖并進(jìn)行平滑均一化處理，最后將峰圖進(jìn)行擬合。

2　結(jié)果與分析

2.1流感病毒顆粒形態(tài)

為觀察流感病毒顆粒的形態(tài)，利用電鏡將PR8毒株按不同倍數(shù)放大，分別得到比例尺為50 nm、100 nm及0.5 μm的流感病毒顆粒形態(tài)圖 (圖1)。電鏡結(jié)果顯示流感病毒顆粒呈球狀或絲狀，表面不光滑且有突起，可見核心、包膜與基質(zhì)蛋白區(qū)域。

圖1　電鏡下的流感病毒顆粒形態(tài)Fig. 1　Influenza A virus particles under electron microscope.

2.2SERS技術(shù)穩(wěn)定性的檢測

為了檢測SERS技術(shù)的穩(wěn)定性，將WSN、PR8、CA04流感病毒毒株置于pH值為7.2、溫度為37 ℃的條件下培養(yǎng)并制備樣品分別進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。橫坐標(biāo)表示拉曼峰位移值，縱坐標(biāo)表示拉曼信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，如圖2峰圖顯示，CA04毒株的主要出峰位置在1 000 cm–1處，PR8毒株主要毒株出峰位置在950 cm–1、1 125 cm–1處，WSN毒株的主要出峰位置在950 cm–1、1 125 cm–1處。結(jié)果顯示峰圖重現(xiàn)性良好，表明該方法在此實(shí)驗(yàn)中具有良好的穩(wěn)定性。另外，圖1顯示在pH值為7.2、溫度為37 ℃的條件下3個(gè)毒株的SERS檢測結(jié)果均出現(xiàn)至少1個(gè)大于 (或等于) 3 000的峰值。

圖2　pH值為7.2、溫度為37 ℃的條件下不同毒株SERS穩(wěn)定性檢測Fig. 2　Stability of influenza A virus strains tested by SERS.

圖3　H1N1不同亞型毒株感染細(xì)胞后病毒滴度檢測Fig. 3　Viruses growth ability tests of three influenza A virus strains.

2.3細(xì)胞感染及病毒滴度的檢測

為了檢測在不同環(huán)境因子條件下A型流感病毒H1N1亞型不同毒株的病毒滴度變化，我們使用細(xì)胞生物學(xué)的方法使病毒感染細(xì)胞并在相應(yīng)條件下培養(yǎng)，檢測TCID50值。圖3中橫坐標(biāo)表示不同環(huán)境因子，縱坐標(biāo)表示不同流感病毒滴度，結(jié)果顯示在不同pH值條件下，CA04、WSN、PR8三株毒株在pH值為5.0及以下時(shí)基本喪失毒價(jià)，而隨著pH值的上升病毒滴度逐漸升高，在pH值為7.2時(shí)復(fù)制能力最強(qiáng)。在環(huán)境溫度改變的情況下，CA04毒株在50 ℃及以上條件下毒價(jià)基本喪失，WSN和PR8毒株在溫度由37 ℃上升至50 ℃時(shí)毒價(jià)顯著下降，在50 ℃–52.5 ℃時(shí)病毒滴度平穩(wěn)，溫度上升至55 ℃及更高后基本喪失毒價(jià)，二者下降趨勢基本一致。

2.4不同溫度條件下SERS檢測

圖4　不同溫度毒株拉曼技術(shù)檢測Fig. 4　Three influenza A virus strains, CA04 (Black), WSN (Red), and PR8 (Blue), were analyzed under different temperatures using SERS.

為了檢測A型流感病毒在不同溫度條件下病毒滴度的變化，我們將流感病毒在不同環(huán)境下培養(yǎng)后使用SERS技術(shù)進(jìn)行快速檢測。圖4中橫坐標(biāo)表示拉曼峰位移值，縱坐標(biāo)表示拉曼信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，峰圖顯示在50 ℃–60 ℃范圍內(nèi)溫度變化的條件下，CA04毒株的峰圖變化不顯著，主要出峰點(diǎn)均集中在1 000–1 100 cm–1等位置，峰圖的趨勢及走向一致。PR8和WSN毒株的峰圖在55 ℃–60 ℃范圍內(nèi)與50 ℃–52.5 ℃范圍內(nèi)發(fā)生了顯著的改變，其中PR8毒株在50 ℃和52.5 ℃時(shí)1 000 cm–1位置的峰強(qiáng)度在55 ℃–60 ℃范圍內(nèi)顯著變?nèi)?，WSN毒株在50 ℃和52.5 ℃時(shí)910 cm–1、1 100 cm–1位置的峰強(qiáng)度在55 ℃–60 ℃范圍內(nèi)顯著變?nèi)?，以上結(jié)果顯示，SERS技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)檢測的結(jié)果基本一致。

2.5不同pH值條件下SERS檢測

圖5　不同pH值毒株拉曼技術(shù)檢測Fig. 5　Three influenza A virus strains, CA04 (Black), WSN (Red), and PR8 (Blue), were analyzed under different pH using SERS.

為了檢測A型流感病毒在不同pH條件下病毒滴度的變化，我們將流感病毒在不同環(huán)境下培養(yǎng)后使用SERS技術(shù)進(jìn)行快速檢測。圖5中橫坐標(biāo)表示拉曼峰位移值，縱坐標(biāo)表示拉曼信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，結(jié)果顯示CA04、WSN、PR8三株毒株在pH為4.6和5.0時(shí)峰圖基本一致，CA04 和PR8毒株各自的峰圖在pH為5.4、5.8、6.2時(shí)基本一致，與前兩個(gè)pH的峰圖相比1 000 cm–1左右的峰強(qiáng)度減弱，而WSN毒株的結(jié)果顯示pH從5.4變化至5.8后峰圖發(fā)生了顯著改變，1 000 cm–1左右出現(xiàn)了多峰現(xiàn)象。在pH為6.2時(shí)峰圖與5.8時(shí)基本一致，在pH上升至6.6后，3株毒株的峰圖均發(fā)生了顯著改變。3株毒株在pH條件改變過程中峰圖的變化趨勢與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)學(xué)檢測結(jié)果一致。

3　討論

近年來，隨著應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于病原菌的檢測手段也從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測發(fā)展到了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction，PCR)、ELISA、Realtime-PCR等方法，表面增強(qiáng)拉曼光譜 (SERS) 的應(yīng)用很大程度提高了檢測的靈敏度并大幅縮短了所需時(shí)間，研究人員可以在樣品不使用標(biāo)簽標(biāo)記的情況下在幾分鐘之內(nèi)得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)是一種高靈敏度和快速的檢測方法，目前在微生物領(lǐng)域，我國應(yīng)用較廣的是對(duì)食源性大腸桿菌[15]、金黃色葡萄球菌[16]、軍團(tuán)菌[17]、芽孢桿菌[18]等常見致病菌的快速分離鑒定[19]。目前SERS技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用遠(yuǎn)沒有在細(xì)菌檢測方面成熟和廣泛。但有研究結(jié)果顯示，SERS技術(shù)可以用來快速區(qū)別和鑒定流感病毒的種類，如Zhao等[20]利用銀納米顆粒作為基底，對(duì)流感病毒的3種不同毒株A/HKx31、A/WSN/33和A/PR/8/34進(jìn)行了SERS的鑒定。在病毒樣品體積小于5 μL的情況下拉曼光譜儀1 min內(nèi)完成了收集，并且根據(jù)峰圖之間的區(qū)別可以清楚地鑒別出不同種毒株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SERS可以用來鑒別同一病原菌的不同種毒株。

根據(jù)目前已知的研究結(jié)果，流感病毒M2蛋白是一種離子通道蛋白[21]，病毒所處環(huán)境的pH值會(huì)影響到離子通道蛋白的功能。有研究發(fā)現(xiàn)在pH值升高至8.5的情況下M2蛋白中的4個(gè)組氨酸會(huì)形成一個(gè)邊緣-面的π堆疊狀的結(jié)構(gòu)，阻止了水分子通過氫鍵形成長鏈來傳導(dǎo)質(zhì)子。在低pH值的導(dǎo)通狀態(tài)下，組氨酸和水形成氫鍵，并發(fā)生環(huán)-再定向反應(yīng)[22]。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出，在不同酸堿度的條件下，病毒表面膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)發(fā)生改變，從而影響病毒的復(fù)制能力。熱休克蛋白 (HSP)是一種應(yīng)激蛋白，廣泛存在于真核和原核細(xì)胞內(nèi)[23]，一些HSP家族的蛋白，如HSP40、HSP70在抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[24]，能夠抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖。多項(xiàng)研究證明，流感病毒的M2、PB1-F2等蛋白會(huì)與宿主的熱休克蛋白Hsp40、Hsp70發(fā)生相互作用[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在溫度由37 ℃開始上升后病毒滴度逐漸或迅速下降，并且SERS結(jié)果也顯示病毒滴度改變的情況下峰圖發(fā)生了顯著變化，這一現(xiàn)象可能是由于在高溫侵襲的狀態(tài)下，宿主體內(nèi)HSP迅速增加，對(duì)病毒復(fù)制的抑制增強(qiáng)，導(dǎo)致病毒滴度下降。

SERS峰圖中每一位移處的拉曼峰都代表著某一種或一類原子團(tuán)、化學(xué)鍵等物質(zhì)。如720 cm–1–800 cm–1可能為C-F鍵，800 cm–1–950 cm–1可能為C-O-C鍵，910 cm–1–960 cm–1為羧酸二聚物，990 cm–1–1 100 cm–1可能為芳環(huán)，1 010 cm–1–1 095 cm–1可能為Si-O-C或Si-O-Si鍵，120 cm–1–1 225 cm–1可能為C=S鍵等[26]。本實(shí)驗(yàn)SERS結(jié)果中隨著溫度的升高或pH值的降低毒株的峰圖發(fā)生顯著變化，細(xì)胞生物學(xué)結(jié)果顯示毒價(jià)顯著下降，結(jié)合二者的結(jié)果推測可能是流感病毒中關(guān)鍵蛋白的構(gòu)象改變導(dǎo)致病毒復(fù)制受到抑制或功能喪失，而具體的機(jī)制還需要更進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此，峰圖變化顯示的外界培養(yǎng)條件的改變對(duì)病毒毒價(jià)影響的更深入的分子機(jī)制探究也將是我們下一步工作的重點(diǎn)。

綜上所述，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中的TCID50結(jié)果和SERS結(jié)果的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞生物學(xué)結(jié)果顯示毒價(jià)變化時(shí)，SERS圖譜也相應(yīng)顯示了峰圖的變化，表明SERS技術(shù)的檢測結(jié)果是對(duì)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的良好佐證。在pH值為7.2、溫度為37 ℃的條件下不同毒株的細(xì)胞生物學(xué)及SERS檢測結(jié)果說明，該狀態(tài)下病毒毒價(jià)最強(qiáng)，最適合病毒生長，為最適的培養(yǎng)條件。日后，我們將收集不同毒株峰圖進(jìn)行匯總和歸納，建立起具有快速查閱比對(duì)功能的拉曼數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用于臨床樣本的檢測。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

工業(yè)生物技術(shù)

Effects of temperature and pH on the growth of H1N1 subtype of influenza A virus by surface-enhanced Raman spectroscopy

Xiaoxiao Jia1,2, Yun Li1, Wenhui Fan1, Qinglan Sun3, Tiezhong Zhou4, Wenjun Liu1,2, and Jing Li1
1 Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 Network Information Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 4 Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning, China

Abstract:Surface enhanced Raman spectroscopy technology (SERS), using gold nanoparticles as a base, was developed for rapid and sensitive detection of virus strains. SERS can be used as a rapid and reliable method to distinguish the titers of viral replication. In the present study, we characterized H1N1 subtypes of influenza A virus strains in different conditions of pH or temperatures, while we analyzed data from SERS technology using gold nanoparticles as a base and cell cultures were employed to further confirm the data from virus strains. Origin8.0 was used to collect Raman spectra, smooth and homogenize data, and to contrast spectra. Our results indicated that the peaks of different virus strains in optimal environmental conditionsreached ≥3000. This criterion was verified by subsequent virological method . The present data indicate that the established SERS protocol can be used as a rapid and reliable method to distinguish the replication rate of virus, which can be further used in clinical samples.

Keywords:SERS, influenza A virus, temperature, pH

DOI:10.13345/j.cjb.150362

Corresponding author:Jing Li. Tel/Fax: +86-10-64807503; E-mail: lj418@163.com