基于RNA-seq技術(shù)對(duì)不同品種豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋

李小金，錢(qián)　坤,劉林清，王重龍，周　杰

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036;2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

基于RNA-seq技術(shù)對(duì)不同品種豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋

李小金1,2，錢(qián)坤2,劉林清2，王重龍2，周杰1

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036;2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

[摘要]【目的】 篩選皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌組織差異表達(dá)基因?！痉椒ā?采集皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌(各3頭)，測(cè)定其肉質(zhì)性狀指標(biāo)，并提取其RNA，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)所獲序列進(jìn)行GO和Pathway顯著性富集分析?！窘Y(jié)果】 測(cè)序后皖南花豬3個(gè)樣本得到的總序列數(shù)分別為65 584 126， 64 327 738和59 244 502 ，其中有效序列達(dá)到94.4%，94.3%和94.2%；大約克豬3個(gè)樣本得到的總序列數(shù)分別為 57 969 134，68 254 168和72 298 142，其中有效序列達(dá)到93.8%，93.7%和93.8%。測(cè)序飽和度良好，證明測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，共篩選到347個(gè)差異表達(dá)基因，其中包含94個(gè)上調(diào)基因，253個(gè)下調(diào)基因。GO 功能顯著性富集和Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因富集在與糖酵解代謝和肌肉發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中以及與脂肪酸代謝和生長(zhǎng)性狀、胴體性狀相關(guān)的信號(hào)通路上?！窘Y(jié)論】 獲得了豬背最長(zhǎng)肌組織基因表達(dá)譜，篩選出了一些與肉質(zhì)性狀和生長(zhǎng)性狀有關(guān)的候選基因。

[關(guān)鍵詞]RNA-seq；皖南花豬；大約克豬；差異表達(dá)基因；背最長(zhǎng)肌

豬肉是人類(lèi)動(dòng)物蛋白的主要來(lái)源，我國(guó)是世界上生豬生產(chǎn)和豬肉消費(fèi)第一大國(guó)。隨著社會(huì)生產(chǎn)力的提高以及生活水平的改善，人們對(duì)高品質(zhì)和健康優(yōu)質(zhì)豬肉的需求也不斷增加。因此改善肉品質(zhì)已經(jīng)成為豬肉產(chǎn)業(yè)的重要課題。骨骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最豐富的組織，約占動(dòng)物體質(zhì)量的40%，豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的差異是導(dǎo)致不同品種豬肉質(zhì)差異的重要原因。由于肉質(zhì)性狀形成的復(fù)雜性及不能(或不易)活體測(cè)定，傳統(tǒng)的選育方法很難從遺傳角度對(duì)肉質(zhì)性狀改善取得較大進(jìn)展。因此采用分子生物學(xué)手段，深入分析肉質(zhì)性狀遺傳機(jī)制，從而參考制定合理的遺傳改良方案是后基因組時(shí)代動(dòng)物育種研究的熱點(diǎn)。

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái), 轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼出現(xiàn),其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來(lái)的應(yīng)用最廣泛的技術(shù)[1]。轉(zhuǎn)錄組是在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物的集合[2]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析可以幫助人們?cè)谡w水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。過(guò)去的轉(zhuǎn)錄組研究通常采用Sanger測(cè)序和cDNA芯片方法，而現(xiàn)在的轉(zhuǎn)錄組研究越來(lái)越多采用高通量測(cè)序技術(shù)。新一代高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)與傳統(tǒng)的基因芯片測(cè)序方法相比，具有高通量、低成本、高靈敏度、重復(fù)性好且無(wú)需已知參考序列等優(yōu)點(diǎn)，已逐步取代基因芯片測(cè)序方法，成為轉(zhuǎn)錄組研究的主要手段[3]。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于小鼠[4]、海鱸魚(yú)[5]和水稻[6]等的RNA測(cè)序。2013年楊亞嵐[7]利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出了不同豬種間的差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行了功能注釋和分析。

對(duì)中外豬種的比較發(fā)現(xiàn)，國(guó)外豬種具有生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高和飼料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，但往往存在肌內(nèi)脂肪少、肉色灰白和系水力低等缺點(diǎn)，而我國(guó)地方豬種具有肉色鮮紅、系水力強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高和肌纖維直徑小等優(yōu)點(diǎn)[8]。本試驗(yàn)選用肉質(zhì)優(yōu)良但生長(zhǎng)速度較慢的中國(guó)地方豬品種皖南花豬和生長(zhǎng)速度快但肉質(zhì)較差的具有代表性的國(guó)外品種大約克豬作為研究對(duì)象，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其背最長(zhǎng)肌RNA進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌組織的基因表達(dá)譜，獲得差異表達(dá)基因，利用GO分析和pathway分析對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，確定調(diào)控肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因，以期加深對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪代謝調(diào)控的了解，為國(guó)內(nèi)外豬品種在肉質(zhì)和生長(zhǎng)性狀方面形成差異的分子機(jī)理研究提供分子生物學(xué)證據(jù)。

1材料與方法

1.1皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌樣品的采集

采集成年期皖南花豬和大約克豬的背最長(zhǎng)肌組織，每個(gè)豬種采集3頭，樣品采集后-80 ℃貯存。

1.2肉質(zhì)性狀的測(cè)定

1.2.1肉色評(píng)分根據(jù)《豬肌肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)范》(NY/T 821-2004)，于宰后1～2 h取倒數(shù)第3和第4肋骨處的背最長(zhǎng)肌，將肉塊切為兩半，平置于白色瓷盤(pán)中，對(duì)照肉樣和肉色比色板在自然光線下進(jìn)行目測(cè)評(píng)分，采用6分制比色板。

1.2.2pH值的測(cè)定宰后取倒數(shù)第3和第4肋骨處的背最長(zhǎng)肌，在常溫下放置45 min后使用pHB-29C便攜式酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，記為pH45。

1.2.3大理石紋評(píng)分宰后取倒數(shù)第3和第4肋骨處的背最長(zhǎng)肌，采用美制NPPC比色板(1999版)對(duì)照眼肌樣本給出大理石紋評(píng)分。

1.2.4滴水損失的測(cè)定豬屠宰后2 h剝離背最長(zhǎng)肌，切取試樣，將其修整為5 cm×3 cm×2.5 cm的肉塊，對(duì)肉塊稱質(zhì)量(W1)后置于充氣的塑料袋中。用細(xì)鐵絲鉤住肉樣一端，保持肉樣垂直向下，不接觸塑料袋，扎緊袋口，懸吊于冰箱中，在4 ℃條件下保存24 h，取出肉樣，用潔凈濾紙輕輕拭去肉樣表層汁液后稱質(zhì)量(W2)。滴水損失(%)=[(W1-W2)/W1]×100%。

1.2.5肌內(nèi)脂肪的測(cè)定精確稱量4～5 g肉樣絞碎、烘干，按照GB/T 6433-94飼料粗脂肪測(cè)定方法測(cè)定肌內(nèi)脂肪，每個(gè)樣品至少平行測(cè)定3次。

1.2.6肌纖維直徑的測(cè)定宰后2 h內(nèi)，在左胴體上采集背最長(zhǎng)肌和股二頭肌肉樣，將其修剪成3 mm×3 mm×5 mm的肉塊，隨后放在體積分?jǐn)?shù)20% HNO3中浸泡24 h，取出肉樣放在滴有甘油的載玻片上，用尖鑷子將其挑成游離狀纖維，在15×40倍并帶有目鏡測(cè)微尺的顯微鏡下，從上到下、從左到右隨機(jī)選擇彎曲、變形、扭轉(zhuǎn)和重疊的50根肌纖維，測(cè)量其直徑，取平均值。

1.3背最長(zhǎng)肌RNA的提取與測(cè)序

總RNA的提取按照TIANGEN Tissue試劑盒中的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取后各樣品的總RNA送交上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用Solexa測(cè)序技術(shù)測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)分析

1.4.1原始數(shù)據(jù)處理測(cè)序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為原始序列數(shù)據(jù)(Raw reads)，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。由于原始序列數(shù)據(jù)可能包含低質(zhì)量序列、接頭序列等雜質(zhì)序列，不能直接用于生物信息分析，所以本研究對(duì)其進(jìn)行處理轉(zhuǎn)換為高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)(Clean reads)，利用Tophat(version:2.0.6)軟件的spliced mapping算法對(duì)Clean reads進(jìn)行豬基因組mapping。

1.4.2差異表達(dá)基因的篩選使用FPKM法[4]計(jì)算基因表達(dá)量，然后根據(jù)基因的表達(dá)量(FPKM值)計(jì)算基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。按照數(shù)字化基因表達(dá)譜差異基因檢測(cè)方法[9]，對(duì)差異檢驗(yàn)的P-value作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)來(lái)決定P-value的閾值。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，表達(dá)差異越顯著。定義FDR≤0.01和差異倍數(shù)絕對(duì)值≥2的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

1.4.3GO功能顯著性富集分析將所有差異表達(dá)基因向Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)的各條目映射，計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)從差異表達(dá)的基因中找出與整個(gè)基因組背景相比顯著富集的GO條目，超幾何檢驗(yàn)P的計(jì)算公式為：

(1)

式中：N為基因組中具有GO注釋的基因數(shù)目，n為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目，M為基因組中注釋為某特定GO條目的基因數(shù)目，m為注釋為某特定GO條目的差異表達(dá)基因數(shù)目。計(jì)算得到的P值通過(guò)Bonferroni校正，以校正后的P值為閾值，滿足P<0.01的GO條目定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。通過(guò)GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。

1.4.4Pathway顯著性富集分析Pathway 顯著性富集分析以KEGG Pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)從差異表達(dá)基因中找出與整個(gè)基因組背景相比顯著性富集的Pathway。該分析的計(jì)算公式同式(1)，在這里N為芯片中具有Pathway 注釋的基因數(shù)目，n為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目，M為芯片中注釋為某特定Pathway 的基因數(shù)目，m為注釋為某特定Pathway的差異表達(dá)基因數(shù)目。P<0.01的Pathway為在差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway。通過(guò)Pathway 顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2結(jié)果與分析

2.1皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌的肉質(zhì)性狀

從表1可以看出，皖南花豬背最長(zhǎng)肌的肉色、pH值、大理石紋和肌內(nèi)脂肪顯著(P<0.05)高于大約克豬，而滴水損失和肌纖維直徑顯著(P<0.05) 低于大約克豬。

表 1　皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌的肉質(zhì)性狀(n=3)

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different small letters mean significant difference (P<0.05).

2.2皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌基因測(cè)序質(zhì)量

經(jīng)高通量測(cè)序，皖南花豬(WH) 3個(gè)樣本得到的原始序列數(shù)分別為65 584 126，64 327 738和59 244 502，有效率分別達(dá)到94.4%，94.3%和94.2%；大約克豬(YY) 3個(gè)樣本得到的原始序列數(shù)分別為57 969 134，68 254 168和72 298 142，其中有效率分別達(dá)到93.8%，93.7%和93.8%?？梢?jiàn)所測(cè)樣品中有效序列的比例都占到原始序列的90%以上，表明測(cè)序質(zhì)量較高，所得有效序列數(shù)目能夠滿足試驗(yàn)需要。

表 2　皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌樣品的測(cè)序結(jié)果

注：WH03表示皖南花豬03號(hào)樣本，YY01表示大約克豬01號(hào)樣本，其他樣本依此類(lèi)推。

Note：WH03 means the 03 sample of Wannanhua pig,YY01 means the 01 sample of Yorkshire pig,and so as other samples.

2.3皖南花豬和大約克豬差異表達(dá)基因及其功能注釋

2.3.1差異基因篩選以皖南花豬為對(duì)照，大約克豬與之相比，差異表達(dá)基因共有347個(gè)，其中上調(diào)基因有94個(gè)，下調(diào)基因有253個(gè)。

2.3.2差異表達(dá)基因的GO功能富集分析GO是一個(gè)采用動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來(lái)描述基因及其產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)，目前被廣泛應(yīng)用于生物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析研究中[10]。圖1為2個(gè)品種豬背最長(zhǎng)肌差異基因GO的功能富集分布圖。

圖 1皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌差異基因GO的功能富集分布圖

Fig.1Enriched GO distribution of differentially expressed genes of longissimus muscle of Wannanhua and Yorkshire pigs

GO總共分為3大功能類(lèi)，分別描述基因的分子功能(Molecular function,MF)、所處的細(xì)胞位置(Cellular component,CC)和參與的生物學(xué)過(guò)程(Biological process,BP)。背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因中已注釋的基因有6 937個(gè)，其中參與生物工程的基因有353個(gè)，參與細(xì)胞組分的基因有175個(gè)，參與分子功能的基因有185個(gè)。GO功能顯著富集得到分類(lèi)條目有487個(gè)，其中與細(xì)胞組分相關(guān)的顯著性富集條目有62個(gè),所占比例為12.7%；與分子功能相關(guān)的顯著性富集條目有116個(gè)，所占比例為23.9%；與生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的顯著性富集條目有309個(gè)，所占比例為63.4%。由此可以推測(cè)，生物學(xué)過(guò)程在皖南花豬和大約克豬肉質(zhì)性狀差異中起著重要作用。差異表達(dá)基因參與的顯著性(P<0.01)生物過(guò)程主要包括糖酵解、肌肉纖維的發(fā)育、心肌收縮、橫紋肌收縮和骨骼肌收縮等；細(xì)胞所處位置主要表現(xiàn)在肌原纖維相鄰兩肌節(jié)交接處的盤(pán)狀(Z盤(pán))結(jié)構(gòu)、肌鈣蛋白復(fù)合、肌漿網(wǎng)和線粒體基質(zhì)等；分子功能主要表現(xiàn)在肌肉的結(jié)構(gòu)組成、鈣離子通道活性調(diào)節(jié)、腺苷酸激酶活性和AMP活性等(圖1)。

2.3.3差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)記錄細(xì)胞中基因產(chǎn)物的功能以及基因產(chǎn)物的相互作用網(wǎng)絡(luò)，基于KEGG 通路的分析有助于進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能[11]。對(duì)皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌間差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG pathway信號(hào)通路分析，結(jié)果表明KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的差異表達(dá)基因有6 620個(gè)，Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因參與了146條生物學(xué)代謝通路，其中有22條通路(表3)存在極顯著性(P<0.01)富集。差異表達(dá)基因中，參與脂肪代謝途徑的基因數(shù)目最多，有37個(gè)，主要包括脂肪酸代謝、PPAR信號(hào)通路、丙酸代謝、脂肪酸生物合成、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、脂肪酸伸長(zhǎng)率和不飽和脂肪酸生物合成，其次是代謝途徑、碳代謝、糖酵解和丙酮酸代謝等。說(shuō)明脂肪代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是皖南花豬和大約克豬肉質(zhì)差異的重要原因。

表 3　皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的Pathway顯著富集結(jié)果

3討論

本研究選用在生長(zhǎng)速度和肉質(zhì)性狀等方面存在較大差異的皖南花豬和大約克豬的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選與肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因。結(jié)合GO功能富集分析和Pathway通路富集分析對(duì)高通量測(cè)序獲得的皖南花豬與大約克豬背最長(zhǎng)肌間差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些顯著通路和生物過(guò)程如能量代謝中的糖酵解代謝、脂肪沉積代謝及肌肉發(fā)育等中的差異基因在皖南花豬與大約克豬中表達(dá)差異較大，其可能與皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌肉質(zhì)性狀的差異有關(guān)。

糖酵解代謝是影響肉質(zhì)性狀形成的重要生理過(guò)程[12-13]。糖酵解潛能(Glycolytic potential,GP)是指動(dòng)物在屠宰前肌肉含有的發(fā)生糖酵解產(chǎn)生乳酸的底物(如肌糖原、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖)以及乳酸的總量。乳酸是影響肉質(zhì)性狀的重要生化指標(biāo)，對(duì)pH和肉色都有較大影響[14]。pH是重要的肉質(zhì)性狀，肉色、保水力、熟肉率等諸多性狀都直接或間接地決定于pH的高低。終端pH越低、糖酵解潛力越高，則肉色越蒼白，保水力越差[15-16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GO功能分析的最顯著生物過(guò)程均與糖酵解代謝有關(guān)，差異基因包括GPI、GAPDH、LDHA、PGK1、ENO3、PFKM、TPI1、PGAM2，且這8個(gè)基因在大約克豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著高于皖南花豬，說(shuō)明皖南花豬的pH值顯著高于大約克豬，這與表1中皖南花豬的pH值顯著高于大約克豬相一致。此外，段艷宇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，豬背最長(zhǎng)肌GP與24 h pH值呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.39，P<0.001)、與b值和L值呈顯著正相關(guān)(b值：r=0.36,P<0.001；L值：r=0.13,P<0.001)，背最長(zhǎng)肌GP越高，則肉的終pH值越低，肉色也更加蒼白。磷酸甘油酸激酶(PGK)是真核細(xì)胞糖酵解過(guò)程中的一種主要組成酶，其在將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬倪^(guò)程中將1，3-二磷酸甘油酸分子C1上的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP)。徐德全[18]研究表明，PGK1在肌內(nèi)脂肪(IMF)含量低的大白豬中高表達(dá)，在梅山豬、通城豬中低表達(dá)，可能是影響IMF沉積的下調(diào)基因，這與本試驗(yàn)中PGK1在大約克豬中高表達(dá)、在皖南花豬中低表達(dá)的結(jié)果相一致。TPI1基因主要參與糖異生、糖酵解和脂肪酸生物合成[19]。Laville等[20]通過(guò)對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌漿蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，嫩度較高肉樣中的TPI1含量顯著高于嫩度較低的肉樣(P<0.05)。

肌纖維類(lèi)型及組成對(duì)調(diào)控肉質(zhì)起著關(guān)鍵作用[21-22]，肌纖維類(lèi)型也顯著影響肌肉的生長(zhǎng)[23]。豬出生后骨骼肌中主要含4 種肌纖維，根據(jù)肌球蛋白重鏈(MyHC)的不同亞型將其分為Ⅰ型、ⅡA 型、ⅡB 型和ⅡX 型[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GO功能分析的顯著性生物過(guò)程均與肌肉纖維發(fā)育有關(guān)，參與此過(guò)程的差異基因包括MLC2V、CHRNB1，且這些基因在皖南花豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著高于大約克豬。這說(shuō)明皖南花豬與大約克豬背最長(zhǎng)肌的肌纖維組成存在顯著差異，可能與2品種豬肉質(zhì)差異和生長(zhǎng)速度差異有關(guān)，這與表1中大約克豬的肌纖維直徑顯著大于皖南花豬的結(jié)果相一致，同時(shí)也與以前的報(bào)道[25-28]基本一致。在顯著性生物過(guò)程中還有一些與肌肉組織發(fā)育有關(guān)的基因，包括CHRNB1、ACTN2、TCAP、CSRP3、TNNT1、PGAM2、ARG2。PGAM2基因編碼的蛋白參與糖酵解過(guò)程，與橫紋肌收縮有關(guān)[29]，Tang等[30]研究表明PGAM2與骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育確實(shí)相關(guān)。TCAP通過(guò)與筒箭毒堿的相互作用，影響生肌細(xì)胞前體分泌筒箭毒堿，控制骨骼肌的生長(zhǎng)[31]。CSRP3又叫肌肉特異性LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)，是骨骼肌發(fā)育的一種正性調(diào)節(jié)因子[32],邱海芳等[33]研究表明，CSRP3與肌肉發(fā)育有關(guān)。

脂肪性狀影響哺乳動(dòng)物的肉質(zhì)，由于脂肪水平受品種和年齡的影響，因此哺乳動(dòng)物體脂的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。豬脂肪組織的沉積還具有品種差異，不同品種的豬脂肪沉積能力相差較大，表現(xiàn)為脂肪型豬種的脂肪沉積能力強(qiáng)于瘦肉型豬種[34]。在Pathway差異顯著的通路中，發(fā)現(xiàn)了一些與脂肪代謝顯著相關(guān)的信號(hào)通路，分別是脂肪酸代謝、丙酸代謝、PPAR信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、脂肪酸伸長(zhǎng)率、脂肪酸生物合成和不飽和脂肪酸生物合成，參與這些通路的差異基因包括UBC、RXRG、LDHA、HADHA、ACADM、ACADL、CPT1B、CPT2、ACSL1、ACSL3、ACAA2、ECI1、FABP3、CD36、ACSS1、ACACB、ACSS3、PRKAG1、TECR，說(shuō)明皖南花豬和大約克豬的背最長(zhǎng)肌在脂類(lèi)代謝方面存在顯著差異。此外，李明洲等[35]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪型豬種太湖豬在不同月齡時(shí)脂肪細(xì)胞體積、IMF含量等指標(biāo)均高于瘦肉型豬種長(zhǎng)白豬，且在3月齡后差距逐漸明顯。楊帆[36]通過(guò)對(duì)豬生長(zhǎng)、胴體及肉質(zhì)與候選基因集的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，丙酸代謝通路與脂肪酸代謝通路內(nèi)基因間的互作效應(yīng)顯著影響豬生長(zhǎng)、胴體及肉質(zhì)性狀。在篩選到的差異表達(dá)基因中，F(xiàn)ABP3、ACSL1和ACACB是參與脂類(lèi)代謝的基因且在皖南花豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量都顯著高于大約克豬。FABP3又稱H-FABP，主要功能是參與細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸運(yùn)輸，可將脂肪酸從細(xì)胞膜上運(yùn)到脂肪酸氧化和甘油三酯及磷酸的合成位置。有研究表明，F(xiàn)ABP3與畜禽肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，可影響肉質(zhì)的嫩度、風(fēng)味和多汁性，故將FABP3基因作為改善肉質(zhì)的候選基因之一[37-38]，這與表1中皖南花豬背最長(zhǎng)肌的肌內(nèi)脂肪顯著高于大約克豬相一致。ACSL1和ACACB基因參與胰島素抵抗和肥胖等代謝過(guò)程[39-40]，在牛的肌肉組織中，ACSL1基因影響多不飽和脂肪酸的沉積[41]；抑制ACACB的表達(dá)可以促進(jìn)肌肉組織的脂肪酸氧化，改善全身葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡[42]。在這些差異基因中，目前已有研究證明對(duì)豬的肉質(zhì)性狀有重要影響的基因主要有FABP3、CPT1B、CD36、CSRP3、ACSS1、PGAM2、PGK1和PFKM等。還有一些基因尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，如TECR、GPI和MLC2V，但是其已知功能均與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控和脂肪酸生物合成及氧化相關(guān)，可作為肉質(zhì)性狀候選基因進(jìn)行深入研究和驗(yàn)證。

豬是人類(lèi)較為理想的醫(yī)學(xué)模型，通過(guò)建立與人類(lèi)疾病相似的豬醫(yī)學(xué)模型，研究疾病發(fā)生的基因調(diào)控或作用機(jī)制，可為人類(lèi)疾病防治提供科學(xué)依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)了7個(gè)在肥厚型心肌病和6個(gè)在擴(kuò)張型心肌病通路中差異表達(dá)的基因，其中包括MYH7、MYBPC3、TNNT2和TNNI3等已知的與肥厚型心肌病相關(guān)的基因[43]，以及LMNA、SCN5A、CTLA-4等已知的與擴(kuò)張型心肌病有關(guān)的基因[44]，這也預(yù)示著可以考慮通過(guò)構(gòu)建肥厚型心肌病病豬和擴(kuò)張型心肌病病豬模型，來(lái)研究這2種病的致病機(jī)理以及開(kāi)發(fā)臨床用藥等。

4結(jié)論

本研究利用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)皖南花豬和大約克豬背最長(zhǎng)肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)比對(duì)分析，篩選出了347個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的基因有94個(gè)，下調(diào)的基因有253 個(gè)。 通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析、KEGG通路分析共篩選出了GPI、FABP3、CSRP3、CPT1B、ACTN2等5個(gè)與肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因，發(fā)現(xiàn)了與肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)的糖酵解代謝、脂類(lèi)代謝和肌肉發(fā)育等生物過(guò)程和代謝通路，初步揭示了造成皖南花豬和大約克豬之間肉質(zhì)性狀差異的原因，為挖掘新基因和深入研究豬肉質(zhì)性狀遺傳因素等奠定了基礎(chǔ)。

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Screening and annotation of differentially expressed genes in longissimus muscle of different pig breeds based on RNA-seq technology

LI Xiao-jin1,2,QIAN Kun2,LIU Lin-qing2,WANG Chong-long2,ZHOU Jie1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China;2InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei,Anhui230031,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to find differentially expressed genes in longissimus muscle of Wannanhua pig and Yorkshire pig.【Method】 This experiment selected 3 Wannanhua pigs and 3 Yorkshire pigs to obtaine longissimus muscles.Meat quality traits were measured,RNA was extracted,high-throughput transcriptome sequencing (RNA-seq) technology was used to sequence,and GO function annotation and pathway on different genes were analyzed.【Result】 Total numbers of sequencing reads of the three Wannanhua pig samples were 65 584 126,64 327 738 and 59 244 502,respectively.The percentages of clean reads reached 94.4%,94.3% and 94.2%.Total numbers of sequencing reads of the three Yorkshire pig samples were 57 969 134,68 254 168 and 72 298 142,respectively.The percentages of clean reads reached 93.8%,93.7% and 93.8%.The high saturation degree of sequencing demonstrated that the data were realistic and reliable. Differential expression analyses showed that there were 347 differentially expressed genes,in which 94 were up-regulated and 253 genes were down-regulated.Gene Ontology functional enrichment and pathway enrichment analyses revealed that the differentially expressed genes were primarily associated with glycolytic metabolism,biological processes of muscle development and signal pathways related to fatty acid metabolism,growth and carcass traits.【Conclusion】 This study obtained the gene expression profile of porcine longissimus dorsi muscle tissue and identified novel candidate genes for porcine meat quality and growth traits.

Key words:RNA-seq;Wannanhua pig;Yorkshire pig;differentially expressed genes;longissimus muscle

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.001

[收稿日期]2014-09-29

[基金項(xiàng)目]安徽省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(AHCYTX-06-10)；安徽省生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(13000101)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(13C0405)

[作者簡(jiǎn)介]李小金(1988-)，男，安徽懷寧人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物生理生化研究。E-mail:lxiaojin0823@163.com [通信作者]周杰(1966-)，男，福建漳州人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生理生化研究。E-mail:zhoujie@ahau.edu.cn

[中圖分類(lèi)號(hào)]S828.9+12；Q78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)06-0001-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.002.html