抑制消減雜交技術(shù)在瓜菜作物研究中的應(yīng)用

胡寶剛　劉　莉　焦定量

摘要：抑制消減雜交(SSH)是一種適用于分離2個遺傳背景相關(guān)的樣品之間差異表達基因的技術(shù)，目前該技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用不是很多。文章主要綜述了抑制消減雜交技術(shù)在瓜菜類作物不同發(fā)育階段和抗病、逆境脅迫相關(guān)的差異表達基因以及其他相關(guān)差異基因研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：抑制消減雜交；差異表達基因；瓜菜；抗病；逆境脅迫

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展以及部分生物的基因組全序列測序的陸續(xù)完成．生命科學(xué)的研究熱點已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組研究轉(zhuǎn)向基因功能及表達調(diào)控的功能基因組研究。因此．大量基因克隆的新技術(shù)也不斷涌現(xiàn)．其中以1992年Liang等提出的mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display re—verse transcription PCR．DDRT-PCR)，1994年Hubank等提出的代表性差別分析(representational diffefence analysis．RDA)技術(shù)．1996年Diatehenko等提出的抑制消減雜交(suppression subtractive hybriion，SSH)技術(shù)及1998年Kang等提出的交互差減RNA差別顯示技術(shù)(reciprocalsubtraction differential RNA display，RSDD)為代表。

抑制消減雜交(SSH)技術(shù)是一種能高效快速克隆差異表達基因的新技術(shù)．該技術(shù)是Diatehenko等在抑制PCR(sup-pression polymerase chain reaction)的基礎(chǔ)上建立起來的篩選差異表達基因的方法．通過該技術(shù)人們可以比較同一細胞或組織在不同的生長發(fā)育階段或不同的生理條件下基因表達的差異，并富集、分離、克隆出這些差異表達基因進行功能研究。ssH起初多應(yīng)用在動物(包括人類)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而在植物研究領(lǐng)域尤其是瓜菜作物研究中只得到初步應(yīng)用。在瓜菜作物上應(yīng)用該技術(shù)．通過分離克隆相關(guān)差異表達基因可以為分析其生長發(fā)育和抗病、抗逆性規(guī)律，闡明作用機理提供重要的信息基礎(chǔ)。本文在介紹SSH技術(shù)原理及特點的同時．著重總結(jié)其在瓜類和蔬菜作物研究上的應(yīng)用進展情況。

1抑制消減雜交技術(shù)

1．1基本原理

抑制消減雜交(SSH)主要基于抑制性PCR與eDNA消減雜交(subwaefive hybridization)技術(shù)。所謂抑制性PCR就是通過利用含引物序列的雙鏈接頭(adaptor)，使非目的片段兩端接上同一接頭．該接頭具有反向末端重復(fù)序列，在退火時鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火．使非目的序列片段產(chǎn)生類似“鍋柄”的互補結(jié)構(gòu)．在PCR時無法與引物配對．從而選擇性抑制非目的序列的擴增。SSH的消減富集則運用了雜交二級動力學(xué)原理．即高豐度單鏈在退火時雜交形成雙鏈的速度快于低豐度單鏈．從而使原來在豐度上有差別的單鏈相對含量達到基本一致．即低豐度差異表達的基因不會丟失．而高豐度差異表達的基因又不會被過量分離。

SSH基本過程：(1)提取2種差異細胞或組織的mRNA，其中包含差異表達基因的為檢測組(Tester)，另1組為驅(qū)動組(Driver)，分別反轉(zhuǎn)錄合成eDNA，并用限制性內(nèi)切酶Rsa I酶切為平頭末端dscDNA片段。(2)將酶切后的Tester eDNA分為2份，1份與接頭l(adaptorl)連接．另1份與接頭2R(adaptor2R)連接．接頭3端與eDNA片段5端連接。接頭外側(cè)序列(圖l中接頭黑色部分)與第1次PCR引物(PCR primerl)相同，而接頭內(nèi)側(cè)序列分別與第2次PCR2個引物(nested primerl和nestedprimer2R)相同。(3)分別向連接不同接頭的TestercDNA中加入過量Driver eDNA．進行第l輪雜交．得到4種產(chǎn)物：a為差異表達的單鏈tester eDNA~b為自身退火的TestereDNA；e為異源退火Tester／Driver eDNA(共有序列形成異源雜交產(chǎn)物)：d為自身退火的Driver cDNA。第2輪雜交時．將第1次2份雜交產(chǎn)物在新鮮變性DrivereDNA存在的條件下混合雜交，進一步去除共有序列．雜交完畢產(chǎn)物中形成一種特殊類型的e型分子．它是檢測組中含有的而驅(qū)動組中沒有的eDNA片段．由第1輪雜交中形成的連接有不同接頭a片段退火形成。(4)2次選擇性PCR擴增：第2輪雜交后補平接頭．第1次PCR擴增時引物為PCRprimer 1．a(chǎn)、d型分子無引物結(jié)合位點不能擴增：c型分子為單接頭，只能線性擴增Ib型分子兩端接頭相同。由于接頭上有退火溫度很高的反向重復(fù)序列．形成“鍋柄”結(jié)構(gòu)．受抑制PCR效應(yīng)。故不能被擴增。只有目標片段形成的e型分子兩端連有不同接頭。以指數(shù)級大量擴增。第2次PCR擴增時。換用接頭內(nèi)側(cè)引物(nested primerl和nested primer 2R)進一步選擇性擴增目標片段。經(jīng)過2輪消減雜交和2輪選擇性PCR．目標片段已被大大富集．其產(chǎn)物可以直接用于克隆構(gòu)建消減文庫。

1．2特點

SSH技術(shù)操作流程比較簡單、周期短．且有市售的試劑盒可供利用．技術(shù)難度不大；該技術(shù)方法可以使低豐度的mRNA得到高于1000倍的富集．靈敏度高．較適于在轉(zhuǎn)錄水平上研究生物基因的差異表達：1次SSH反應(yīng)可同時分離上百至上千個差異表達的基因片段．適用于大規(guī)模的基因表達分析。效率高且假陽性率低。但SSH技術(shù)仍有它的不足之處，如所需的起始mRNA量較大(一般為幾ug)，如果mRNA量不夠．2次差減后有些關(guān)鍵的、低豐度表達的差異eDNA片段可能檢測不到．而且SSH獲得的eDNA片段一般較短。要想獲得全長序列就要用這些基因片段作為探針從eDNA文庫中篩出全長基因。

2抑制消減雜交技術(shù)在瓜菜作物研究中的應(yīng)用

目前SSH技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域已有成功的報道．國內(nèi)外學(xué)者已成功將SSH技術(shù)運用于研究機體各種疾病相關(guān)基因表達、免疫細胞和組織的基因調(diào)控、腫瘤相關(guān)基因以及某些耐藥性基因的克隆等方面。實踐證明，SSH技術(shù)也特別適合于研究植物發(fā)育階段轉(zhuǎn)型前后、個體內(nèi)不同器官之間以及受環(huán)境因子影響較大的差異表達基因的克隆。

2．1在瓜菜作物發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用

植物體內(nèi)大部分基因都是時空表達和誘導(dǎo)表達的．在植體內(nèi)的不同發(fā)育時期、不同組織器官基因的表達不同。研究不同發(fā)育階段、不同組織器官基因的差異表達．對于研究瓜菜類作物的生長、發(fā)育和衰老等規(guī)律并應(yīng)用到實踐育種中具有重要的意義。

肖鋼等以授粉后27 d的種子mRNA為檢測組．授粉后7 d的種子mRNA為驅(qū)動組利用SSH技術(shù)構(gòu)建了甘藍型油菜種子發(fā)育期基因差異表達文庫，得到560個克?。畬?56個PCR陽性克隆進行斑點雜交．得到201個上調(diào)的陽性斑點雜交克隆，測序得到有效ESTs序列198個。BLASTN結(jié)果顯

示，134個ESTs可能是新基因．另外64個ESTs序列在油菜或擬南芥核酸數(shù)據(jù)庫中存在同源序列．這64個ESTs序列和編碼已知功能蛋白(主要是能量代謝、物質(zhì)代謝、基因調(diào)控、衰老及抗性等)的基因有高度相似性．馬春泉等㈣利用SSH技術(shù)構(gòu)建了甜菜M14品系在花期的ZAP表達載體的eDNA文庫．獲得的M14品系特異表達的2個EST片段即eDNAMe286和Me284；采用RACE技術(shù)獲得了基因M14286 cDNA片段的全長序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)M14品系特異表達基因M14286的eDNA片段與eDNA片段Me284分別與大花馬齒莧(Portulaca grandilrIora)及瓶子草(Sarracenlapurpurea)的26S核糖體RNA具有很高的同源性。

周增光等以矮化突變的甘藍型油菜莖尖為檢測組．野生型莖尖為驅(qū)動組．通過SSH構(gòu)建了與植株高矮性狀關(guān)系最密切的莖尖差異表達eDNA差減文庫．利用反向消減cDNA文庫斑點印跡篩選得到30個陽性克?。蛄袦y定和同源性比對分析表明，所得克隆的功能涉及第2信使、轉(zhuǎn)錄因子、激素代謝、蛋白質(zhì)降解及轉(zhuǎn)運等多個方面．為進一步認識油菜植株矮化機理奠定了基礎(chǔ)。Park等通過SSH技術(shù)構(gòu)建了綠色和紅色萵苣(生菜)葉片的差減文庫，利用no．hem雜交技術(shù)檢測到566個克隆中有53個在紅葉片中過量表達．其中6個上調(diào)基因中CHS、F3H和DFR基因的表達與紫外線照射下萵苣葉片中花青素的積累正相關(guān)．這對進一步研究蔬菜作物的次級代謝提供了有價值的資源。Zhou等通過SSH和RT-PCR技術(shù)研究了甘藍型油菜無瓣花突變體Apet 33-10的花器官形態(tài)發(fā)生和差異表達基因．發(fā)現(xiàn)在花器官形成過程中不能觀測到花瓣原基而其他器官形成正常．在Apet 33-10早期花芽分化中有18個基因表達下調(diào)．這些基因與包括花瓣特異表達．鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，mRNA加工。蛋白合成與降解，細胞骨架構(gòu)建．核酸結(jié)合和生物堿的合成等相關(guān)。Terefe等以黃瓜兩性花花芽eDNA為檢測組．以雌株花芽eDNA為驅(qū)動組．通過抑制消減雜交得到了178個eDNA克隆。其中選出21個做點雜交發(fā)現(xiàn)有11個克隆是僅在黃瓜兩性花花芽中表達的、10個是雌株花芽中差異表達的。為進一步分離決定花性型的基因提供了基礎(chǔ)。植物花性型的分化是一個高度復(fù)雜的、在一定遺傳背景控制下的生理生化及形態(tài)發(fā)生過程．瓜類不同花性型的研究一直以來都是育種研究的重點．用SSH技術(shù)分離相關(guān)的誘導(dǎo)表達型基因和不同花性型差異表達基因．揭示瓜類作物花性型分化的分子機制．對于其育種工作具有重要的理論和實踐價值。

2．2在瓜菜抗病蟲研究中的應(yīng)用

病蟲害的發(fā)生是影響瓜菜作物高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要因素．探索瓜菜作物抗病、抗蟲基因作用的分子機制是開展和實施瓜菜基因工程的重要基礎(chǔ)．SSH技術(shù)的應(yīng)用無疑為這類研究提供了一種很有效的工具。

Kirankamar等㈣從SSH文庫中分離到600個Pro基因在番茄里過量表達而可能產(chǎn)生的特異基因．然后結(jié)合微陣列技術(shù)分析了Pro過量表達的抗性株與感病株在接種番茄葉霉菌后的不同時間里這些基因的表達譜．最終鑒定出223個Pro過量表達的特異應(yīng)答基因。茆振川等以含Ⅳ基因的辣椒為試驗材料，接種南方根結(jié)線蟲12、24、36 h的根尖材料作為檢測組，相應(yīng)的未接種的根尖材料作為驅(qū)動組．構(gòu)建1個南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)Ⅳ基因表達早期的正向抑制消減雜交eDNA文庫，并結(jié)合文庫高密度點陣膜雜交差異篩選．獲得237個ESTs，在GenBank上進行比對分析得到148個功能已知的EST序列，獲得68個已知的表達上調(diào)的抗性相關(guān)ESTs．分離出了具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗線蟲蛋白和類LRR抗性蛋白的基因，防御作用相關(guān)的類萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相關(guān)的WRKY、ERFBP等轉(zhuǎn)錄因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多種信號蛋白基因．為了解抗線蟲機制提供了依據(jù)。

Xu等利用SSH技術(shù)構(gòu)建了尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)西瓜根的消減文庫．共得到562個高質(zhì)量的ESTs．經(jīng)過功能注釋后發(fā)現(xiàn)，最普遍的一類EST序列是與病害和防御相關(guān)的，約占33．5％．其次是與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用相關(guān)的EST序列約占13．1％．序列分析認為系統(tǒng)自身獲得性抗病是西瓜對尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抗性的主要原因。趙熙等_1句成功利用SSH技術(shù)構(gòu)建了富集大白菜干燒心病的相關(guān)基因的消減cDNA文庫．采用PCR方法對該文庫進行了重組子鑒定．共得到831個重組子．該文-庫的構(gòu)建成功地為深入研究大白菜干燒心發(fā)病后基因的表達奠定了基礎(chǔ)．為進一步探討研究大白菜干燒心病的致病機理提供了參考。

2．3在逆境脅迫下差異表達基因研究中的應(yīng)用

植物在不同的逆境條件下會表現(xiàn)出具有一定的抗性．分析不同逆境脅迫下的差異表達基因及分離克隆差異表達基因并進行功能分析．有助于闡明逆境調(diào)控通路．對進一步揭示逆境脅迫的分子調(diào)控途徑具有重要的作用．

Maya等利用SSH和cDNA-AFLP技術(shù)研究鑒定了氟樂靈除草劑誘導(dǎo)甜瓜抗鐮刀菌枯萎?。麥p文庫得到共123個克隆。經(jīng)過測序分析，其中60個為未知基因，35％的克隆為已經(jīng)報道的與脅迫、防御相關(guān)的基因．隨機挑選32個克隆進行進一步分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)用氟樂靈處理時1／3的基因上調(diào)．而甜瓜植株用高鹽處理時有4個脅迫相關(guān)基因的表達增強．說明氟樂靈能夠誘導(dǎo)植株的脅迫應(yīng)答反應(yīng)．從而保護植株防衛(wèi)鐮刀菌枯萎病。解莉楠等以鹽堿脅迫下的羊草地上部分cDNA為檢測組．非鹽堿條件下生長的羊草地上部分cDNA為驅(qū)動組，利用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了鹽堿脅迫下羊草消減文庫，篩選出1920個陽性克隆．將得到的552個非重復(fù)序列與GenBank中的序列進行比對．其中有548個與數(shù)據(jù)庫中的序列有同源性，其中功能已知的339個．功能未知序列209個，獲得了與鹽堿脅迫相關(guān)的基因．為抗逆基因的克隆及系統(tǒng)研究鹽堿脅迫下羊草相關(guān)基因的表達奠定了基礎(chǔ)。Mi等通過抑制消減雜交技術(shù)分離鑒定了黃瓜的低光照誘導(dǎo)的基因，以100 txmol／m2·s處理的幼苗eDNA為檢測組．800Ixm01／m2-s處理的幼苗cDNA為驅(qū)動組構(gòu)建了消減eDNA文庫，得到768個重組子克隆，其中246個為低光照誘導(dǎo)克?。?jīng)過測序比對64個ESTs中有50個在GenneBank中能夠找到同源序列，14個ESTs為分離得到的新基因。Thay等利用SSH技術(shù)從6度處理48 h的玉米幼苗中分離鑒定一些新的基因．這些冷凍誘導(dǎo)基因與起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用調(diào)節(jié)的已知蛋白功能近似。通過RT-PCR選出1組基因分別命名為：ZmC016．ZmACAI，ZmDREB2A和ZmERF3，證實這些基因都是低溫逆境脅迫下表達的。SSH技術(shù)在植物逆境脅迫基因的克隆中成功應(yīng)用．為更深入利用該技術(shù)分離瓜菜作物抗性基因提供了重要的方法指導(dǎo)。

3結(jié)語

當(dāng)前將瓜菜作物研究的重點一直放在育種工作中。而抗病蟲性和抗逆性一直是重要的育種目標．但由于對相當(dāng)部分病蟲脅迫機制并不清楚．發(fā)揮抗性的主效或?qū)Ｒ换蛐枰M一步明確．啟動抗性反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等問題需要進行深入的研究。SSH技術(shù)的出現(xiàn)和成熟無疑將成為瓜菜作物差異基因表達研究的強有力工具。利用該技術(shù)可以廣泛地開啟各種病蟲脅迫、逆境脅迫條件下的基因差異表達的研究．深入了解抗病蟲的機理機制．將為優(yōu)良品種的選育提供理論依據(jù)和資源。

雖然SSH技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于部分瓜菜作物生長發(fā)育過程中的差異表達基因、抗病蟲特異表達基因、逆境脅迫條件下差異表達基因以及其他相關(guān)基因的研究中。但應(yīng)用范圍還很有限。近幾年在國內(nèi)外研究中出現(xiàn)了多種新技術(shù)與SSH技術(shù)結(jié)合．使SSH技術(shù)日臻完善．在瓜菜作物研究上的應(yīng)用也越來越多。顯示出了廣闊的研究前景。