胃癌組織中miRNA-21和miRNA-34的表達及其意義

許新才, 林　海, 張　旺 , 張文斌

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化血管外科中心，烏魯木齊　830054)

胃癌組織中miRNA-21和miRNA-34的表達及其意義

許新才1, 林海, 張旺 , 張文斌

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化血管外科中心，烏魯木齊830054)

摘要：目的探討微小 RNA(microRNA，miRNA)miR-21 和miR-34在胃癌組織(T)和癌旁正常胃黏膜組織(N)中的表達及其臨床意義。 方法運用實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定 T和N中的 miR-21、miR-34表達水平。結(jié)果(1)T中miR-21 、miR-34的表達量分別為(8.32±4.48)和(3.40±0.49)，N中兩者表達量分別為(4.13±1.29)和(3.86±0.51)，T中miR-21的水平明顯高于N ，miR-34的水平明顯低于N，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)T中miR-21水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05) ；T中miR-34表達量與腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論胃癌組織中miR-21的升高和miR-34的下降在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，提示腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲性、遠處轉(zhuǎn)移增強。

關(guān)鍵詞：胃癌； miR-21； miR-34

胃癌是人類常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤第二位[1]，我國為胃癌高發(fā)區(qū),胃癌患病率和死亡率是世界平均水平的2倍多，死亡率居惡性腫瘤之首[2]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多基因作用的復(fù)雜過程，近年來研究發(fā)現(xiàn)微小 RNA( microRNA, miRNA) 與腫瘤密切相關(guān)，其以原癌基因、抑癌基因的方式發(fā)揮作用。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，同腫瘤有關(guān)的微小RNA陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn)。有研究顯示miRNA-21、miR-34在多種消化道腫瘤中表達異常，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。本研究旨在探討癌旁正常胃黏膜組織同胃癌組織中的miR-21、miR-34表達及其與臨床病理因素的關(guān)系。

1材料與方法

1.1臨床資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重大疾病資源樣本庫中人胃腺癌組織(T)和距腫瘤>5 cm的癌旁正常胃黏膜組織(N)標(biāo)本各75例，其中男性50例，女性25例，年齡29～81歲，中位年齡64.6歲 ；漢族55例，少數(shù)民族20例(其中維吾爾族15例，回族1例，蒙古族1例，錫伯族1例，哈薩克族2例)；高分化腺癌2例，中分化腺癌44例，低分化腺癌29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，未轉(zhuǎn)移31例；所有病例均有詳細的臨床病理資料，每個標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷確診。根椐2003年美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC) 和國際抗癌聯(lián)盟( UICC) 聯(lián)合制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期：TNMⅠ、Ⅱ期32例，TNM Ⅲ、Ⅳ期43例?；颊呤中g(shù)前均未進行放療、化療、生物治療等其他治療。將所有標(biāo)本剪成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小數(shù)塊，立即置 RNA 保存液中，于-80℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ姳?。

1.2實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測按TRIzol 說明書抽提GC組織中的總 RNA。 分別測定 RNA 在分光光度計波長 280 nm 和 260 nm 的吸收值，計算濃度并評估純度。 按試劑說明書測定 miR-21、miR-34水平, 以 U6snRNA 為內(nèi)參照,實驗重復(fù) 3 次，取平均值。依據(jù)所得 Ct 值，采用相對定量法 2-ΔCt分別計算被檢組織中miR-21、miR-34水平,RE=2-ΔCt，△Ct=[腫瘤(CtmiRNA-21-CtU6)]-[正常對照組織(CtmiRNA-21-CtU6)]，RE代表miRNA-21在腫瘤組織的相對表達,即腫瘤組織中的表達量與配對正常組織中的表達量的比值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；數(shù)據(jù)比較用方差分析和計量資料的配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1T、N中miR-21、miR-34表達水平的比較T中miRNA-21的相對表達量高于N中miRNA-21的相對表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；T中miRNA-34的相對表達量低于N中miRNA-34的相對表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　T和N中miRNA-21、miRNA34表達水平比較

2.2 T中miR-21、miR-34的表達與臨床病理因素的關(guān)系T中miRNA-21的相對表達量與患者性別、年齡、民族、腫瘤大小和組織學(xué)分級，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；T中miRNA-21的相對表達量與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，且隨TNM分期增高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相對表達量上調(diào)。T中miRNA-34的相對表達量與患者性別、年齡、民族差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；T中miRNA-34的相對表達量與腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，且隨腫瘤體積增大、組織學(xué)分級增高、TNM分期增高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相對表達量降低(表2)。

臨床因素nmiRNA212-ΔCtP值miRNA342-ΔCtP值年齡/歲 ≥60547.63±5.050.0623.62±0.580.073 <60217.32±4.960.0543.50±0.690.060性別 男性348.31±3.320.0663.43±0.480.091 女性418.27±2.750.0953.37±0.430.154民族 漢族557.61±4.160.0722.98±0.680.097 少數(shù)民族207.95±3.580.0652.94±0.700.150大小/cm <5118.50±0.340.0633.50±0.560.081 ≥5648.36±0.550.0783.16±0.470.057組織學(xué)分級 高分化287.42±4.120.0753.53±0.340.150 中分化357.95±5.230.0853.23±0.450.067 低分化128.16±3.290.0913.05±0.370.055TNM分期 T1+T2457.03±1.340.0313.36±0.420.048 T3+T4309.53±4.070.0022.26±0.370.041淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有309.65±4.950.0212.39±0.550.019 無458.03±2.520.0333.36±0.570.039

3討論

近年來，隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤發(fā)生機制研究取得很大進步。研究發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于多種生物中，約占整個基因組基因總數(shù)的2%[3]。miRNA 能通過與靶 mRNA 特異性堿基互補配對引起靶 mRNA 降解或抑制其翻譯，達到調(diào)控基因表達的目的[4]。miRNA已被證實參與和調(diào)控了包括時序發(fā)育、細胞凋亡、脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細胞分化、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過程，腫瘤與miRNA的關(guān)系引起了人們的高度重視。 miR-21 是人類較早發(fā)現(xiàn)、廣泛存在的 microRNA，在多種腫瘤組織和細胞中過表達，包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、肺癌、肝癌、大腸癌、膠質(zhì)瘤和膽管癌等，因此miRNA-21是一個公認(rèn)的致癌性miRNA[5-6]。miR-21 通過對靶基因PTEN、PDCD4、maspin、TPM1、caspase-3/7/9、p53、bcl-2 等的調(diào)控參與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥。本研究顯示T中miR-21相對表達量(8.32±4.48)高于N中相對表達量(4.13±1.29)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示T中miR-21升高在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起一定的作用。Chan 等[7]用PCR檢測37例胃癌組織和正常組織miR-21水平，結(jié)果92%胃癌組織中miR-21過表達，認(rèn)為miR-21可以作為胃癌診斷的有效標(biāo)志物，與本研究結(jié)果一致。本研究顯示T中miR-21相對表達量與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，可能是miR-21作用于靶基因，使靶基因在腫瘤組織中的表達缺失或低表達，失去抑癌基因的作用，從而抑制細胞凋亡，促進細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。Zhang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌株過表達miR-21其增殖性和侵襲性強，抑制 miR-21 的表達后細胞株的增殖性和侵襲性降低。Meng等[10]也觀察到在肝癌細胞中有此現(xiàn)象。

miR-34最先發(fā)現(xiàn)于線蟲，其編碼一段保守的miRNA，分為3個同源基因即miR-34a、miR-34b、miR-34[11],miR-34被認(rèn)為是“抑癌基因”，可被p53激活，抑制細胞生長，調(diào)節(jié)細胞周期，誘導(dǎo)細胞調(diào)亡。miR-34家族啟動子均位于CpG島，miR-34家族的表達均受DNA甲基化調(diào)控。在前列腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤等腫瘤中，均可見miR-34a啟動子區(qū)高甲基化可以下調(diào)成熟的miR-34a的表達水平[12-13]。本研究顯示T中miR-34相對表達量(3.40±0.49)低于N中相對表達量(3.86±0.51)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示T中miR-34下降在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用。Tazawa等[14]研究證實在人類結(jié)腸癌的發(fā)展過程中存在miR-34a的下調(diào)；本研究T中miR-34相對表達量與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，可能提示miR-34的下調(diào)，失去抑癌作用。Bommer等[15]對肺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-34家族的表達可降低非小細胞型肺癌的發(fā)生和抑制其腫瘤細胞的生長。目前研究顯示，miR-34家族參與的細胞調(diào)亡及細胞周期調(diào)控主要通過以下幾個途徑產(chǎn)生：(1)miR-34與 BCL-2途徑；(2)miR-34與E2F家族途徑；(3)miR-34-Cyclin/CDK-pRb 途徑。Ji[16]等通過對p53缺失的Kato III胃癌細胞研究，推測miR-34可能具有逆轉(zhuǎn)野生型p53基因的功能；p53缺陷的胃癌細胞,重建功能性miR-34能抑制細胞增長,誘導(dǎo)凋亡。表明miR-34可能具有恢復(fù)p53基因的功能?；謴?fù)miR-34可能為p53基因缺陷型胃癌提供新的分子靶向治療方案。

綜上所述，胃癌常有多種miRNA的表達異常。本研究已明確胃癌組織中miR-21和miR-34表達水平異常。miR-21表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；miR-34表達與腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。重建功能性miR-34可能恢復(fù)p53基因功能，能誘導(dǎo)化學(xué)敏感及凋亡，抑制細胞增長,這些為胃癌的治療提供了線索。在后續(xù)研究中將進一步探討miR-21和miR-34作用機制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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(本文編輯周芳)

Expression of miRNA-21 and miRNA-34 in gastric carcinoma and clinical significance

XU Xincai, LIN Hai, ZHANG Wang, ZHANG Wenbin

(Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054, China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of micro RNA (microRNA, miRNA) miR-34 and -21 in gastric tumor (T) and adjacent normal gastric mucosa (N) and clinical significance. MethodsMiR-21 and miR-34 levels in T and N were measured by real-time fluorescence quantitative PCR. Results(1)The levels of miR-21 in T and N were (8.32±4.48) and (4.13±1.29) (P<0.05) and the levels of miR-34 in T and N were (3.40±0.49) and (3.86±0.51) (P<0.05); (2) The level of miR-21 in T was related to TNM stage and lymphatic metastasis (P<0.05), while the level of miR-34 in T was related to tumor size, histological grade, TNM stage, lymphatic metastasis (P<0.05). ConclusionThe increase of miR-21 and the decrease of miR-34 in gastric tumor played an important role in the occurrence and development of gastric tumor, which were suggested that the lymphatic metastasis, invasion and distant metastasis of the tumor were enhanced.

Keywords:gastric tumor; miR-21; miR-34

基金項目：新疆醫(yī)科大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目 (XJGR12013080)

作者簡介：許新才(1979-)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：胃腸腫瘤方向。 通信作者：張文斌，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：胃腸腫瘤方向,E-mail: ZWB3216@sina.com。

中圖分類號：R735.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)07-0854-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.07.010

[收稿日期：2016-02-28]