苗藥頭花蓼含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的影響*

徐　丹， 趙菲菲， 楊　馨， 劉　俊， 李　靖， 徐國(guó)波， 廖尚高*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

·基礎(chǔ)研究·

苗藥頭花蓼含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的影響*

徐丹1**， 趙菲菲1，2， 楊馨1，2， 劉俊1， 李靖1， 徐國(guó)波1， 廖尚高1***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探討苗藥頭花蓼對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)釋放炎癥因子的影響。方法： 制備苗藥頭花蓼水提醇沉提取物的含藥血清( PCWEPS )， 采用10 μg/L脂多糖(LPS)建立RAW264.7細(xì)胞炎癥損傷模型，Griess試劑法檢測(cè)細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)的含量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real Time-PCR)檢測(cè)TNF-α及IL-6 mRNA的表達(dá)水平，Western blot 法檢測(cè)NF-κB通路中I-κBα蛋白和p-I-κBα蛋白表達(dá)水平。結(jié)果： 與模型組比較，3種給藥劑量的PCWEPS均顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞釋放NO，TNF-α和IL-6 (P<0.001)；PCWEPS能夠顯著降低TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平(P<0.001)，下調(diào)p-I-κBα蛋白的表達(dá)(P<0.001)，降低NF-κB通路中I-κBα蛋白的磷酸化。結(jié)論： 頭花蓼抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子釋放，可能與抑制NF-κB通路中I-κBα的磷酸化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]植物藥； 頭花蓼； 單核巨噬細(xì)胞； 炎癥因子； NF-κB通路

頭花蓼(polygonumcapitatumBuch-Ham. ex D. Don)為蓼科蓼屬植物頭花蓼的干燥全草具有利尿通淋之功效，臨床上主要用于泌尿系統(tǒng)感染疾病的治療[1]。研究表明，頭花蓼水提物及70%乙醇提取物具有顯著的抗炎活性[4]，其中的三萜、甾體和黃酮類化合物與抗炎活性密切相關(guān)[5]，但頭花蓼的抗炎機(jī)制尚不明確?；罨膯魏?巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的重要來(lái)源，當(dāng)受到刺激時(shí)，單核細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)移至血管外組織成為巨噬細(xì)胞，激活后的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)等細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，并對(duì)宿主的免疫反應(yīng)、組織重建修復(fù)等發(fā)揮重要作用[6-7]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的有效物質(zhì)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子模型被廣泛用于抗炎藥物的篩選評(píng)價(jià)[8-9]。本研究通過(guò)考察頭花蓼水提醇沉提取物含藥血清(PCWEPS)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放炎癥因子的影響，探討頭花蓼的抗炎作用及其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1試藥與試劑

頭花蓼藥材(貴州省施秉縣頭花蓼GAP種植基地),陽(yáng)性對(duì)照藥醋酸地塞米松磷酸鈉注射液(貴州光正制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H52020793，批號(hào)130315)。DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào) 8114410)，胎牛血清(Hyclone公司，批號(hào) NZE1145)，LPS(Sigma公司，批號(hào)102M4017V)，MTT(Sigma公司，批號(hào) M1959)；磺胺(批號(hào) 30172216)，N-(1-萘基)-乙二胺(批號(hào) 80088013)，DMSO(批號(hào) 302A0323)，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。小鼠TNF-α 、IL-6ELISA試劑盒(RayBio公司，批號(hào) 0313150430、0313150413)，AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司，批號(hào) 12213KD1)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，批號(hào) AK2802)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，批號(hào) AK6101)，引物(上海生物工程公司)，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(碧云天，批號(hào) P0012AC)，哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒(康為世紀(jì)，批號(hào) CW0889)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Solarbio，批號(hào) PC0020)，TRIS(Solarbio，批號(hào) 1128Q0713)，Glycine(Sigma，批號(hào) WXBB6513V)，SDS(Sigma，批號(hào) L-5750)，I-κBα單克隆抗體(美國(guó)abcam公司，批號(hào) GR181745-8)，p-I-κBα單克隆抗體(美國(guó)abcam公司，批號(hào) GR98748-15)，羊抗兔IgG抗體(美國(guó)abcam公司，批號(hào) GR209629-7)。

1.2動(dòng)物與分組

Wistar大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黔)2012-0001。根據(jù)灌胃劑量將小鼠隨機(jī)分為18、54、162 g/(kg·d)頭花蓼水提醇沉提取物組(PCWEP，分別對(duì)應(yīng)頭花蓼單方制劑熱淋清顆粒臨床劑量的3、9和27倍)，每組10只。灌胃前12 h禁食不禁水，尾靜脈采集空白血，然后按不同劑量灌胃PCWEP，2次/d，連續(xù)4 d，末次給藥后90 min尾靜脈取血[10]。以2 000 r/min，4 ℃離心10 min分離上層血清，合并同組血清，過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3方法及考察指標(biāo)

1.3.1RAW264.7細(xì)胞活性RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于溫度為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以2×105個(gè)/mL 的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組：無(wú)大鼠血清的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組：不同體積分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%及2.0%，V/V)的空白血清或PCWEPS，培養(yǎng)24 h后，每孔加入2.5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清液，加入DMSO 100 μL，振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，每組設(shè)6個(gè)平行孔。按照公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A平均值×100%。

1.3.2RAW264.7細(xì)胞釋放NO的檢測(cè)前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)空白血清體積(V/V)為1.5% 時(shí)，既不影響RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)，也不影響LPS刺激所產(chǎn)生的NO釋放的檢測(cè)，因此確定實(shí)驗(yàn)中含藥血清的添加體積(V/V)為1.5%。參照1.3.1項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(無(wú)大鼠血清的培養(yǎng)基)、模型組(終濃度為10 μg/L的LPS溶液)、DEXA組(終濃度為50 mg/L的地塞米松和10 μg/L的LPS混合液)及不同劑量PCWEPS組(終濃度為10 μg/L的LPS和體積分?jǐn)?shù)(V/V)為1.5%的不同劑量含藥血清，與細(xì)胞共培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)平行孔)。計(jì)算NO釋放量。

1.3.3RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α及IL-6的檢測(cè)參照1.3.2項(xiàng)，收集RAW264.7細(xì)胞上清液，每組設(shè)6個(gè)平行孔，TNF-α和IL-6的釋放量采用ELISA試劑盒提供的方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α和IL-6 的釋放量。

1.3.4RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔體積2 mL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液。參照1.3.2項(xiàng)，培養(yǎng)24 h后，采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取總RNA，TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Green試劑盒說(shuō)明擴(kuò)增TNF-α及IL-6目的條帶，每組設(shè)3個(gè)平行孔。引物由上海生物工程公司合成，TNF-α上游引物5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3′，下游引物5′-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3′；IL-6上游引物5′-CTGCAAGAGACTTCCAYCCAG-3′，下游引物5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′。內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，上游引物5′-AGTATGACTCCACTCACGGCAAAT-3′，下游引物5′-GTCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3′。根據(jù)2-△△Ct，以GAPDH為參照，進(jìn)行TNF-αmRNA及IL-6 mRNA相對(duì)定量分析。

1.3.5RAW264.7細(xì)胞I-κBα和p-I-κBα蛋白表達(dá)參照1.3.4項(xiàng)，RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒提取蛋白樣本，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后定量，每孔為40 μg上樣。采用兩步法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，通過(guò)蛋白快速轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上，TBST洗滌3次，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，TBST洗滌3次，用封閉液分別按1∶1 000和1∶10 000稀釋I-κBα和p-IκBα抗體，室溫震蕩孵育2 h， 4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，用TBST按1∶5 000稀釋羊抗兔IgG抗體，室溫震蕩孵育2 h，TBST洗滌3次，用ECL超敏發(fā)光液顯影，于凝膠成像儀中曝光并記錄結(jié)果，使用Quantity One v4.62軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，并以β-actin為內(nèi)參標(biāo)化蛋白電泳條帶的灰度值。

1.4數(shù)據(jù)分析

2結(jié)果

2.1RAW264.7細(xì)胞活性

當(dāng)空白血清及不同劑量PCWEPS體積分?jǐn)?shù)(V/V)為0.5%～1.5%作用于RAW264.7細(xì)胞24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，RAW264.7細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異，提示在此體積范圍內(nèi)空白血清及含藥血清對(duì)于RAW264.7細(xì)胞本身的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響；超過(guò)此添加量，隨著血清體積的增加，RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著影響。為有效反映藥物的藥效，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，血清體積分?jǐn)?shù)(V/V)設(shè)定為1.5%。見(jiàn)表1。

2.2對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

與對(duì)照組比較，模型組顯著刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO(P<0.001)；與模型組比較，不同劑量的PCWEPS均能抑制RAW264.7細(xì)胞釋放NO，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.3RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α及IL-6

與對(duì)照組比較，模型組顯著刺激RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6(P<0.001)；與模型組比較，不同給藥劑量的PCWEPS均能抑制RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見(jiàn)表3。

2.4RAW264.7細(xì)胞TNF-α，IL-6 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組顯著提高了RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平(P<0.001)；與模型組比較，不同給藥劑量的PCWEPS均能降低RAW264.7細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見(jiàn)表4。

表1　空白血清及PCWEPS對(duì)細(xì)胞活性的影響

(1)與對(duì)照組比較，P<0.001

表2　PCWEPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

表3　PCWEPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6的影響

(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

表4　PCWEPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

2.5RAW264.7細(xì)胞I-κBα蛋白及p-I-κBα蛋白表達(dá)

以β-actin作為內(nèi)參照，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS干預(yù)6 h后，與對(duì)照組比較，模型組p-I-κBα蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，各給藥組含藥血清均能抑制RAW264.7細(xì)胞p-I-κBα蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見(jiàn)圖1，表5。

圖1　PCWEPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞I-κBα蛋白表達(dá)的影響Fig.1　Effect of PCWEPS on I-κBα protein expressions in RAW264.7 cells 表5　PCWEPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞I-κBα蛋白表達(dá)的影響

組別p-I-κBα/I-κBα對(duì)照組0.33±0.01模型組1.94±0.02(1)PCWEPS[g/(kg·d)] 181.52±0.02(2) 541.05±0.03(2) 1620.64±0.01(2)

(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

3討論

頭花蓼是貴州苗族民間常用藥材，是治療泌尿系統(tǒng)感染的良藥，具有突出的抗菌和抗炎作用。由于其化學(xué)成分復(fù)雜，因此在本研究中，采用頭花蓼含藥血清，研究其對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子的影響，代替中藥粗提物作為藥物載體既避免了藥物的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，又能夠更好的模擬藥物在體內(nèi)發(fā)揮作用的過(guò)程[11]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要參與者，在被感染過(guò)程中，被激活的巨噬細(xì)胞能釋放致炎因子NO，IL-6和TNF-α等炎癥因子，促進(jìn)組織的重建修復(fù)；但過(guò)量炎癥因子的釋放會(huì)加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷、并產(chǎn)生病理變化[12-13]。脂多糖是革蘭氏陰性菌菌壁的主要活性成分，是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)最強(qiáng)烈、最有效的激活物，在革蘭氏陰性菌感染中發(fā)揮重要作用[14]。因此，抑制巨噬細(xì)胞中NO，IL-6和TNF-α等致炎因子的過(guò)度釋放對(duì)抗炎治療意義重大。本研究結(jié)果證實(shí)，LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放增加，PCWEPS能顯著降低TNF-α和IL-6 mRNA的水平，并抑制巨噬細(xì)胞中NO，TNF-α和IL-6的釋放。

NF-κB是早期核轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，NF-κB和I-κB形成復(fù)合體存在于胞漿中。I-κB有多種亞型，包括I-κBα、I-κBβ、I-κBγ、I-κBδ、I-κBε、p100、p105和Bcl-3，其中I-κBα尤為關(guān)鍵，它在核內(nèi)對(duì)NF-κB的抑制作用最強(qiáng)[15]，因此在本研究中選取I-κBα為考察指標(biāo)，在細(xì)菌感染下，LPS等外源性誘導(dǎo)劑使I-κB激酶(IKK)活化，活化后的IKK將I-κB磷酸化(生成p-I-κBα)，使NF-κB和I-κB解離，游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核，啟動(dòng)基因如TNF-α，iNOS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠通過(guò)顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中I-κBα的磷酸化從而激活NF-κB信號(hào)通路，但PCWEPS能夠有效地抑制這一過(guò)程，提示頭花蓼含藥血清能夠通過(guò)抑制I-κBα的磷酸化調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎癥因子NO，TNF-α及IL-6的釋放。

綜上，頭花蓼的抗炎作用可能與其調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，降低TNF-α和IL-6 mRNA的水平，抑制炎癥因子NO，TNF-α和IL-6的釋放有關(guān)。研究結(jié)果為深入探討頭花蓼在泌尿系統(tǒng)感染中的作用奠定了基礎(chǔ)，也為頭花蓼的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

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(2016-03-11收稿，2016-05-28修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

Effect of the Drug-containing Serum of Miao MedicinePolygonumcapitatumon Inflammatory Cytokines in Macrophages

XU Dan1,2, ZHAO Feifei1,3, YANG Xin1,3, LIU Jun1,2, LI Jing1,2, XU Guobo1,2, LIAO Shanggao1,2

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicinesandTCM,MinistryofEducation,Guiyang550004,Guizhou,China;3.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Miao medicine Polygonum capitatum on inflammatory cytokines released from Lipopolysaccharide (LPS)-induced monocyte macrophage (RAW264.7) in mice. Methods: The drug-containing serum (PCWEPS) of Polygonum capitatum was prepared by classical water extraction and alcohol precipitation method. The inflammatory damage model of RAW264.7 cells was established by 10 g/L lipopolysaccharide (LPS). NO content was detected by the Griess assay, the protein expression of TNF-α and IL-6 expression were detected by ELISA in the cell culture supernatant, the mRNA expression of TNF-α and IL-6 were determined by Real Time-PCR, and the protein expressions of I-κBα and p-I-κBα in NF-κB pathway were measured by Western blot. Results: Compared with the model group, the PCWEPS of 3 kinds of different doses could significantly inhibit the release of NO, TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells (P<0.001). In addition, PCWEPS could significantly decrease the mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 (P<0.001), down-regulated the protein expression of p-I-κBα protein (P<0.001) and decrease phosphorylation of I-κBα protein in NF-κB pathway (P<0.001). Conclusion: P. capitatum can inhibit the inflammatory cytokines release from the macrophage cells, and the mechanism may be related to its inhibition of phosphorylation of I-κBα protein in NF-κB pathway.

[Key words]plant medicine; Polygonum capitatum; mononuclear macrophage; inflammatory factors; NF-κB pathway

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81160516；81560570；81260688)

[中圖分類號(hào)]R965.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0635-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.004

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:lshangg@163.com

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