安可膠的主體免疫成分鑒定

司瑋，許辭中，劉晶.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京　0000；.南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所，江蘇南京　0000；.江蘇省藥物研究所，江蘇南京　0000

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安可膠的主體免疫成分鑒定

司瑋1，許辭中2，劉晶3
1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京210000；2.南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所，江蘇南京210000；3.江蘇省藥物研究所，江蘇南京210000

［摘要］目的通過對(duì)安可膠的主體成分鑒定，為該藥物臨床進(jìn)一步優(yōu)化和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法通過建立ELISA檢測條件系統(tǒng)，確定一抗與二抗最佳工作濃度，對(duì)兔血清抗體進(jìn)行檢測及點(diǎn)雜交鑒定。結(jié)果安可膠作用于兔，可使其產(chǎn)生纖維蛋白原抗體，抗體滴度也呈相同的變化趨勢(shì)。結(jié)論經(jīng)鑒定，安可膠的主體成分是纖維蛋白原蛋白，該纖維蛋白原成分對(duì)于嚙齒類兔可誘發(fā)一過性抗體，但未表現(xiàn)出其他明顯的免疫原性反應(yīng)。

［關(guān)鍵詞］安可膠；纖維蛋白原；抗體

安可膠是模仿凝血機(jī)制的最后共同通路設(shè)計(jì)成的止血制劑，由兩種溶液組成，溶液A含高濃度的纖維蛋白原和XIII因子，溶液B主要含凝血酶和鈣離子，當(dāng)上述兩液混合時(shí)，產(chǎn)生類似外凝血過程的最后階段，纖維蛋白原和凝血酶接觸，產(chǎn)生可溶性纖維蛋白多聚體，并形成纖維蛋白網(wǎng)，起到止血封閉作用，使出血停止，適用于創(chuàng)面止血、防淋巴漏，并能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但由于本品來源于哺乳動(dòng)物血清，因此對(duì)其免疫原性研究顯得尤為重要。該研究旨在對(duì)安可膠進(jìn)行主體免疫成分進(jìn)行鑒定，同時(shí)通過免疫原性試驗(yàn)，觀察其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，為臨床用藥安全提供參考依據(jù)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)新西蘭兔24只，雌雄各半，隨機(jī)分4組，每組6只。

1.2主要試劑

纖維蛋白原多克隆抗體：Millipore公司提供，批號(hào)PS1424939蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：Fermentas公司提供，批號(hào)00034120辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG：凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，批號(hào)140403。

表1　一抗與二抗最佳稀釋度

2　試驗(yàn)方法

試驗(yàn)劑量采用安可膠20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg，溶于適量的纖維蛋白原溶解液中；凝血酶凍干粉1瓶，溶于適量的凝血酶溶解液中，得到相應(yīng)濃度的應(yīng)用液。

2.1 SDS-PAGE電泳分離安可膠的主體成分

精密稱取1 mg安可膠，加入1 mL雙蒸水，超聲溶解，配成1 mg/mL的溶液。取20 mL上述溶液加入5 mL非還原型上樣緩沖液充分混勻，即為電泳樣品。

制備電泳凝膠，分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5%。取上述電泳樣品10 mL上樣，恒壓70 V下至溴酚藍(lán)前沿完全跑出底邊。電泳結(jié)束后將膠取出，以考馬斯亮藍(lán)染色30 min后換脫色液，置于脫色搖床上脫色，直至背景澄清，條帶清晰后拍照。

2.2 Western Blot鑒定主體成分

電泳結(jié)束后將膠取出，以恒流300 mA轉(zhuǎn)膜2 h 40 min至硝酸纖維素膜后，將膜取下放入5%BSA/PBST中，37℃輕搖封閉1 h。封閉結(jié)束后將膜取出，用PBST洗滌三次，5 min/次，之后將膜放入封口袋中，加入1：5000稀釋的纖維蛋白原多克隆抗體，4℃封閉過夜。第二天取出后按上述方法洗滌完后加入1：4000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃下孵育1 h后取出洗滌，在膜上用TMB法顯色后拍照。

2.3 ELISA檢測條件的建立

2.3.1間接ELISA操作步驟用包被緩沖液稀釋后加至96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4℃包被過夜。第二天倒去包被液，用洗滌緩沖液加至孔內(nèi)，洗滌5次，3 min/次，然后加入封閉液200 μL/孔，置37℃封閉1 h；封閉結(jié)束后倒掉液體，同樣洗滌液洗滌5次，加入抗體稀釋液稀釋的纖維蛋白原多克隆抗體（一抗）100 μL/孔，置37℃孵育2 h；洗滌5次，加入抗體稀釋液稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（二抗）100 μL/孔，置37℃孵育1h；洗滌5次，加入TMB顯色液100 μL/孔，避光反應(yīng)10 min；加入2 M硫酸溶液50 μL/孔終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450 nm處測定A450值。

2.3.2纖維蛋白原最佳包被濃度的選擇纖維蛋白原凍干粉用包被緩沖液稀釋后包被酶標(biāo)板，纖維蛋白原多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG均使用1：5000的稀釋度，根據(jù)A450值的變化趨勢(shì)選擇合適的包被濃度。

2.3.3一抗與二抗最佳工作濃度的確定一抗與二抗最佳工作濃度的確定采用棋盤滴定法。以確定的纖維蛋白原最適包被濃度包被酶標(biāo)板，10%小牛血清封板，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照與陰性對(duì)照（均為3個(gè)平行復(fù)孔），一抗選用1：2500、1：5000、1：10000三個(gè)稀釋度，二抗選用1：2000、1：4000、1：8000稀釋度，各稀釋度交叉配組（即9個(gè)組），參照上述步驟進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)A450值選擇P/N比值最大的配對(duì)組條件為一抗和二抗最適工作濃度。

2.4兔切口實(shí)驗(yàn)及兔血清抗體的檢測

24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，用安可膠封閉后1、2、4、6周采血分離血清，按上述建立的ELISA條件檢測血清中抗體。各組血清分別作1∶100稀釋，以陰性照組血清為陰性對(duì)照，P/N＞2.1為陽性，血清作梯度稀釋，以最高稀釋度為血清抗體滴度。

2.5點(diǎn)雜交法鑒定血清中抗體成分

取四張硝酸纖維素膜，分別在膜上同一位置各滴加上述溶液2 mL，37℃孵育20 min，待膜干后加入含10%小牛血清的PBST溶液37℃下封閉1 h。封閉結(jié)束后用PBST洗膜3次，5 min/次。將高、中、低三個(gè)劑量組以及陰性對(duì)照組的兔血清作1：100稀釋，洗滌完畢后的膜分別用這四種血清37℃孵育1 h。洗膜3次，再加入1：4000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃下孵育1 h，洗膜3次，在膜上滴加TMB顯色液顯色。

2.6統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0軟件中one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　給藥后1、2、4、6周血清中抗體水平（n=6，x±s）

3　結(jié)果

3.1 SDS-PAGE及Western Blot結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，纖維蛋白原凍干粉條帶對(duì)應(yīng)的分子量約為340KD，與纖維蛋白原理論分子量較為吻合。Western Blot結(jié)果說明，只有唯一的一處條帶能被纖維蛋白原多克隆抗體所識(shí)別。綜合以上兩點(diǎn)，可以證明安可膠的主體成分為纖維蛋白原蛋白。

3.2纖維蛋白原最佳包被濃度

纖維蛋白原包被濃度在0.5～10 μg/mL時(shí)，A450值呈遞增趨勢(shì)，且當(dāng)包被濃度為10 μg/mL時(shí)，A450值接近于1。當(dāng)包被濃度＞10 μg/mL時(shí)趨于飽和，故本試驗(yàn)將10 μg/ml纖維蛋白原作為最佳包被濃度。

3.3一抗與二抗最佳工作濃度

一抗和二抗的最適稀釋度分別為1∶2500和1∶4000。此時(shí)A450值較大（1.0左右），陰性本底較低（＜0.2），P/N最大，詳見表1。

3.4兔血清點(diǎn)雜交

給于安可膠的兔血清能特異性地與纖維蛋白原結(jié)合，斑點(diǎn)亮度明顯高于陰性對(duì)照組，表明血清中主要的抗體成分為纖維蛋白原抗體，而且存在一定的劑量依賴性。從時(shí)間上來看，第一、二、四周血清中抗體含量呈上升趨勢(shì)，第六周開始下降。

3.5兔血清抗體檢測

給予安可膠一周后，血清中即可檢測出抗體存在，并且高、中劑量組與陰性相比有顯著性差異。第二周、第四周低劑量組抗體含量呈顯著性上升趨勢(shì)，而高、中劑量組變化較小。第六周各組抗體含量呈現(xiàn)下降，詳見表2。

3.6兔血清抗體滴度檢測

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，各組血清中抗體滴度均呈先上升后下降趨勢(shì)。第一周，高、中、低劑量組抗體最低滴度分別為1：400、1：200、1：200；第二周，高、中、低劑量組抗體最低滴度分別為1：1600、1：1600、1：800；第四周，高、中、低劑量組抗體最低滴度分別為1：3200、1：3200、1：3200；第六周，高、中、低劑量組抗體最低滴度分別為1：1600、1：1600、1：1600。

4　結(jié)論

安可膠的主體免疫成分（纖維蛋白原凍干粉）是纖維蛋白原蛋白；安可膠作用于兔，第一周各劑量組就能產(chǎn)生抗體，經(jīng)鑒定為纖維蛋白原抗體，并且低劑量組在第二、四周抗體含量呈顯著性上升，而高、中劑量組抗體含量變化不明顯，可能是由于較高劑量使機(jī)體產(chǎn)生了耐受，第六周時(shí)，各組抗體含量開始下降。各組抗體滴度呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)。該研究結(jié)果表明，纖維蛋白粘合劑中的纖維蛋白原成分對(duì)于嚙齒類兔可誘發(fā)一過性抗體。

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Main Immune Ingredients Identifications of Ankejiao

SI Wei1，XU Ci-zhong2，LIU Jing3
1.NanJing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Province，Nanjing，Jiangsu Province，210000 China；2.Nanjing catering and food safety administration，Nanjing，Jiangsu Province，210000 China；3.Jiangsu Provincial Institute of Material Medical，Nanjing，Jiangsu Province，210000 China

［Abstract］Objective To investigate the main ingredients identifications of Ankejiao and provide experimental evidence for evaluation and further optimization of the drug. Methods An improved ELISA system of biotin and conjugated streptomyces avidin was used for detecting antibodies. The serum antibody titer and its dynamics were studied by means of the injury experiment in New Zealand rabbits. Results The antibodies could be detected in New Zealand white rabbit serum 1 week after immunization，and antibody levels decreased to a more stable level after it peaked at the second week，at the same time，the antibody titer also showed the same trend. Conclusion The humoral immune response was induced in New Zealand rabbits after stimulated with porcine fibrinogen，but no specific immune response was found in rabbits.

［Key words］Ankejiao；Fibrinogen；Antibody

［中圖分類號(hào)］R93

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1672-5654（2016）02（a）-0143-03

DOI：10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.04.143

［作者簡介］司瑋（1981.12-），女，江蘇南京人，碩士，工程師，研究方向：食品藥品安全。

［通訊作者］劉晶（1973.9-），男，江蘇南京人，碩士，副研究員，研究方向：藥理安全性，E-mail：jansens@foxmail.com。

收稿日期：（2015-11-02）