不同種源鵝掌楸抗寒性綜合評價

陸　暢，李　斌，劉　儒，夏良放，?！×?，林富榮，鄭勇奇（1.中國林業(yè)科學研究院國家林木遺傳育種重點實驗室，北京100091；2.中國林業(yè)科學研究院　林業(yè)研究所，北京100091；.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心，江西 南昌 8000；.北京十三陵林場，北京102200）

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不同種源鵝掌楸抗寒性綜合評價

陸暢1,2，李斌1,2，劉儒3，夏良放3，祝良4，林富榮1,2，鄭勇奇1,2
（1.中國林業(yè)科學研究院國家林木遺傳育種重點實驗室，北京100091；2.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京100091；3.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心，江西 南昌 338000；4.北京十三陵林場，北京102200）

摘要：采集鵝掌楸Liriodendron chinense 4個種源的秋季和冬季的枝條和葉芽，測量抗寒生理指標，使用隸屬函數(shù)分析法綜合評價種源的抗寒性。結(jié)果顯示：鵝掌楸不同種源的各抗寒生理指標均表現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化。具體為，鵝掌楸冬季葉芽中的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)均高于秋季葉芽，相對電導率和含水量均低于秋季葉芽。根據(jù)測量的生理指標數(shù)據(jù)，計算出鵝掌楸4個種源的隸屬函數(shù)值作為抗寒性的綜合評價值，大小分別為云南勐臘0.021，貴州黎平0.286，安徽大別山0.834，浙江富陽0.488。對4個鵝掌楸種源的抗寒性進行了綜合排序：安徽大別山＞浙江富陽＞貴州黎平＞云南勐臘。對各抗寒生理指標與隸屬函數(shù)值進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：相對電導率、含水量均與隸屬函數(shù)值呈顯著性負相關(guān)，脯氨酸質(zhì)量分數(shù)分別與隸屬函數(shù)值呈顯著性正相關(guān)。在今后的鵝掌楸抗寒性評價時，上述指標可以被用作較好的評價指標。表6參24

關(guān)鍵詞：樹木生理學；鵝掌楸；抗寒性；生理指標；隸屬函數(shù)

浙江農(nóng)林大學學報，2016，33（3）：455-461

Journal of ZheJiang A&F University

鵝掌楸Liriodendron chinense是屬于木蘭科Magnoliaceae鵝掌楸屬Liriodendron的中國特有植物，常被用于行道樹和園林綠化樹種，為世界最珍貴的樹種之一［1］。該樹種是優(yōu)良的建造材料，同時具有一定的藥用價值，目前已被列為國家二級珍稀瀕危保護植物［2］。鵝掌楸自然分布在中國的南方，如江西、貴州、福建等省份，生長在海拔1 000 m左右的山地中。在引種過程中，抗寒性的大小是選擇優(yōu)樹最重要的考量標準，該樹種的引種成活率與受到凍害程度的大小有重要關(guān)系［3-4］。探究鵝掌楸的抗寒性不僅在了解其抗寒生理機制上具有重要的科學意義，在實際的引種栽培和規(guī)?；a(chǎn)上也具有較高的價值。目前，鵝掌楸樹種抗寒性研究主要集中在對該樹種的表型性狀的評價上［4］，尚未開展從抗寒生理水平上對鵝掌楸的抗寒性進行分析和評價。低溫對植物的生長及地理分布起到重要的限制作用。環(huán)境溫度過低，導致植物進行較低的光合作用和較高的呼吸作用，從而使其生物合成效率下降，加大了能源物質(zhì)消耗，嚴重影響其生長發(fā)育，甚至會引發(fā)植物死亡［5］。在冷應(yīng)答過程中，植物接收到低溫信號后開啟防御機制，包括膜結(jié)構(gòu)上的適應(yīng)，細胞間調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的增加和抗氧化物質(zhì)的協(xié)調(diào)配合等，通過上述方法，起到平衡生物合成和碳水化合物代謝的作用，提高植物在寒冷環(huán)境下的存活率［6］。通過測定生理指標來鑒定植物抗寒性的方法已被廣泛使用［7-9］。植物的抗寒性是一個復(fù)雜的生理生化過程，使用單一指標評價鵝掌楸的抗寒性具有一定的局限性。隸屬函數(shù)分析方法因其便于開展直觀、綜合的評價，作為一種對植物抗寒性綜合評價的方法，目前已廣泛應(yīng)用于多種植物的抗寒性評價中［10-13］，而在鵝掌楸的抗寒性評價中未見應(yīng)用。本研究以鵝掌楸地理分布上緯度差異較大的4個種源為材料，比較其自然環(huán)境下秋季和冬季的生理指標，探索其變化規(guī)律，并應(yīng)用隸屬函數(shù)法對所測指標進行綜合評價分析，以期獲得評價鵝掌楸抗寒性鑒定的有效方法。

1　材料和方法

1.1試驗材料

供試材料采自江西省分宜縣大崗山年珠林場，27.80°N，114.40°E，海拔為129 m，年平均氣溫為19.30℃，年降水量為1 619.7 mm，土質(zhì)為紅棕壤，平均坡度為15°。本課題組于1990年秋季采集全國鵝掌楸種源種子，于1991年春季種植于年珠林場。本研究選取了其中由南向北緯度差異較大的4個鵝掌楸種源的植株作為研究對象［14］（表1）。各種源分別選擇30株樹齡一致、生長情況良好的植株，隨機采集每株樹的1年生枝條頂端葉芽，純凈水清洗后擦干，用錫紙包裹后投入液氮中帶回實驗室，置于-80℃低溫冰箱中保存，用于抗寒生理指標的測定。隨機采集各種源30株樹的1年生枝條，剪取枝條中部約20 cm長材料，將其截斷處用濕紗布包裹，置于封口袋中，用攜帶式低溫冷藏箱中保存，迅速帶回實驗室開展相對電導率測量實驗。按照近幾年的氣溫變化規(guī)律，1月中旬，江西林場的氣溫進入到1 a中最低的時期，故冬季的采樣時間為2014年1月中旬，秋季的采樣時間為2013年9月中旬。

表1 鵝掌楸種源的采種點環(huán)境因子Table 1 Environmental factors of Liriodendron chinese provenances

1.2測定方法

1.2.1抗寒生理生化指標測定丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度測定采用硫代巴比妥酸法［15］；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法［17］；可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定采用考馬斯亮藍法［16］；可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用蒽酮法［18］；脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的測定采用酸性茚三酮顯色法［17］。

1.2.2相對電導率取鵝掌楸枝條，平均分成3份，紗布包好，放入具塞試管后加入10 mL蒸餾水。搖勻振蕩1 min后，第1次測電導率（E0）；然后室溫下放置24 h，充分搖勻后第2次測電導率（E1）；然后，把試管置沸水浴中15 min，冷卻，測定第3次電導率（E2）。根據(jù)下面公式計算相對電導率（CRE）：CRE= （E1-E0）/（E2-E1）×100%。每個樣品測定3次，并計算平均值［15］。

1.2.3含水量測定取30株·種源-1鵝掌楸的葉芽，用稱量天平稱取樣品的質(zhì)量（W0）；然后把樣品放入升溫至60℃的烘箱中，24 h后取出稱量（W1）。根據(jù)下面公式計算樣品的含水量：含水量=［（W0-W1）/ W0］×100%［15］。

1.3數(shù)據(jù)分析

各種源分別測定30株樹，測量3次·株-1，3次測量值的平均值作為每株樹的生理指標數(shù)值，將30株樹的生理指標數(shù)值取平均值作為種源的生理指標數(shù)值。用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖；用SPSS 17.0軟件進行方差分析和相關(guān)性分析。采用相對增幅來比較各種源指標的季節(jié)變化程度，相對增幅（%）=（冬季鵝掌楸指標-秋季鵝掌楸指標）÷秋季鵝掌楸指標×100。

1.4抗寒性綜合評價方法

使用隸屬函數(shù)法綜合評價鵝掌楸抗寒性［15］。與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)計算：UiJ=（XiJ-XJmin）/（XJmax-XJmin）；與抗寒性呈負相關(guān)的參數(shù)計算：UiJ=1-（XiJ-XJmin）/（XJmax-XJmin）。其中：UiJ為i種類鵝掌楸種源第J項指標的抗寒隸屬函數(shù)值；i表示某個種源；J表示某項指標；XiJ表示第i個鵝掌楸種第J項生理指標測定值；XJmax和XJmin為鵝掌楸4個種源中，第J項生理指標的最大值和最小值。按照上述公式，根據(jù)各種源生理指標的相對增幅計算各項指標的隸屬函數(shù)值，取各指標的隸屬函數(shù)值的算術(shù)平均數(shù)作為平均隸屬函數(shù)值。

2　結(jié)果與分析

2.1抗寒性生理指標的季節(jié)變化

本研究結(jié)果顯示：鵝掌楸不同種源的幾種抗寒生理指標在秋季和冬季的變化趨勢總體上保持一致。具體為，冬季的鵝掌楸葉芽中的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)、SOD活性、可溶性糖質(zhì)量分數(shù)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)、相對電導率均高于秋季，含水量低于秋季（表2和表3）。

表2 秋季不同種源鵝掌楸抗寒生理指標Table 2 Cold resistant physiological indicators of different provenances in autumn

表3 冬季不同種源鵝掌楸抗寒生理指標Table 3 Cold resistant physiological indicators of different provenances in winter

2.2種源間抗寒生理指標的差異

表2顯示，秋季時，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度最低的是貴州黎平種源，最高的是云南勐臘種源，云南勐臘種源顯著高于安徽大別山種源；浙江富陽和安徽大別山的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為33.17 μg·g-1和31.17 μg·g-1，顯著高于貴州黎平和云南勐臘；貴州黎平和安徽大別山的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于云南勐臘；SOD活性依次為安徽大別山＞貴州黎平＞云南勐臘＞浙江富陽，貴州黎平和安徽大別山的SOD活性顯著高于云南勐臘和浙江富陽；脯氨酸質(zhì)量分數(shù)依次為浙江富陽＞貴州黎平＞安徽大別山＞云南勐臘，浙江富陽種源顯著高于其他3個種源；相對電導率依次為浙江富陽＞貴州黎平＞云南勐臘＞安徽大別山，對各個種源的相對電導率均值差異性分析比較發(fā)現(xiàn)，安徽大別山種源相對電導率為13.35%，顯著低于其他3個種源；云南勐臘和貴州黎平的含水量顯著高于安徽大別山和浙江富陽。表3顯示，冬季時，云南勐臘和貴州黎平的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度分別為6.90 μmol·g-1和5.77 μmol·g-1，顯著高于安徽大別山和浙江富陽；可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)依次為浙江富陽＞安徽大別山＞貴州黎平＞云南勐臘，浙江富陽的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著高于其他3個種源；安徽大別山和貴州黎平的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于云南勐臘和浙江富陽；SOD活性依次為安徽大別山＞云南勐臘＞浙江富陽＞貴州黎平，云南勐臘和安徽大別山的SOD活性顯著高于貴州黎平；脯氨酸質(zhì)量分數(shù)依次為安徽大別山＞浙江富陽＞貴州黎平＞云南勐臘；云南的相對電導率為36.06%，顯著高于其他3個種源；含水量依次為云南勐臘＞貴州黎平＞浙江富陽＞安徽大別山。

2.3不同種源抗寒性綜合評價

對鵝掌楸4個種源的抗寒生理指標測定結(jié)果顯示，各生理指標的季節(jié)變化趨勢不同，僅使用單一指標衡量該樹種的抗寒性缺乏科學性。本研究采用隸屬函數(shù)分析法綜合評鵝掌楸的抗寒性。隸屬函數(shù)均值的大小反映了抗寒性的強弱。根據(jù)各種源的生理指標變化相對增幅，計算出鵝掌楸4個種源的隸屬函數(shù)值，作為抗寒性的綜合評價值，大小分別為：云南勐臘0.021，貴州黎平0.286，安徽大別山0.834，浙江富陽0.488。根據(jù)綜合評價結(jié)果對4個鵝掌楸種源的抗寒性進行了綜合排序：安徽大別山＞浙江富陽＞貴州黎平＞云南勐臘（表4和表5）?？购宰顝姷陌不沾髣e山種源可溶性糖質(zhì)量分數(shù)、脯氨酸質(zhì)量分數(shù)、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)、含水量的相對增幅較高，而相對電導率值和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的相對增幅較低。

表4 不同種源鵝掌楸不同季節(jié)生理指標值的相對增幅Table 4 Relative growth ratio of cold resistant physiological indicators of provenances in different seasons

表5 鵝掌楸種質(zhì)資源抗寒性綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation on cold resistant ability

2.4抗寒性生理指標與抗寒性相關(guān)性分析

對各抗寒生理指標與隸屬函數(shù)值進行相關(guān)性分析：結(jié)果顯示，相對電導率、含水量均與隸屬函數(shù)值呈顯著性負相關(guān)（P＜0.01）；脯氨酸質(zhì)量分數(shù)分別與隸屬函數(shù)值呈顯著性正相關(guān)（P＜0.01）（表6）。因此，在今后的鵝掌楸抗寒性評價時，上述指標可以被用作較好的評價指標。

3　討論

鵝掌楸生理指標季節(jié)變化的規(guī)律與前人在植物抗寒性研究［17-19］上取得的結(jié)果一致，說明實驗結(jié)果是可靠的。本研究采用隸屬函數(shù)分析法綜合評定鵝掌楸種源的抗寒性，其強弱依次為安徽大別山＞浙江富陽＞貴州黎平＞云南勐臘，這與本課題組對各種源試驗林的長期觀測的結(jié)果相符。安徽大別山種源的鵝掌楸在幼苗時期即表現(xiàn)出較強的抗寒性，受到冷害后存活率較高，且幼苗成年后生長速度快，云南勐臘種源的抗寒性則較弱。在同樣的生長環(huán)境下，安徽大別山和云南勐臘2個種源表現(xiàn)出了對低溫環(huán)境的適應(yīng)性上的顯著差異?？购圆顒e較大的種源間的抗寒性差異可能與不同種源對生長環(huán)境的長期適應(yīng)有關(guān)?？购宰顝姷陌不沾髣e山種源和抗寒性最弱的云南勐臘種源，在4個種源中分屬地理分布的最北端和最南端，高緯度地區(qū)的冬季溫度較低，季節(jié)間溫差較大，長期對低溫環(huán)境的冷適應(yīng)，可能是增強安徽大別山種源抗寒性的原因之一。本研究結(jié)果顯示：抗寒性最強的安徽大別山種源和抗寒性最弱的云南勐臘種源在生理指標的含量和季節(jié)間的相對增幅上存在差異，可能是造成2個種源的鵝掌楸抗寒性差別較大的原因。

表6 鵝掌楸隸屬函數(shù)均值與抗寒生理指標的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between subordinate function value and cold resistant physiological indicators

膜系統(tǒng)是植物遇冷害后首先受到傷害的部位，由于凍害引發(fā)的細胞脫水會對膜系統(tǒng)造成多方面的傷害［20］。低溫脅迫下，膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞，電導率會隨著細胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)包括電解質(zhì)在內(nèi)的外滲程度的增加而增大，是判斷植物受低溫傷害的程度和抗寒能力的重要指標［13］。膜質(zhì)過氧化產(chǎn)生的丙二醛常用于評價細胞膜系統(tǒng)受傷害的程度［21］。本研究結(jié)果顯示：鵝掌楸4個種源的相對電導率和丙二醛的季節(jié)變化一致，冬季的含量高于秋季，表明隨著溫度降低，植物受到低溫脅迫后受到傷害的程度加劇。安徽大別山種源的丙二醛季節(jié)變化的相對增幅較小，體現(xiàn)出植物細胞受損程度較低，具有較強的抗寒性。云南勐臘種源的相對電導率的增幅最大，表明細胞受到低溫脅迫后損傷程度較高，抗寒性較低。脯氨酸參與到許多環(huán)境脅迫的響應(yīng)當中，是最有效的有機滲透物質(zhì)之一，在抵抗低溫脅迫時可以起到平衡細胞代謝的作用，其含量的增加有利于提高植物抗寒性［22］。本研究中，冬季的安徽大別山種源的脯氨酸質(zhì)量分數(shù)在4個種源中最高，并且脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的相對增幅最大，可能在該種源的植株抵抗低溫時較好地發(fā)揮平衡細胞代謝作用，從而提高該種源的抗寒性。冬季時，雖然云南勐臘種源脯氨酸的相對增幅較高，但其脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)在4個種源間最低，可能在平衡細胞代謝方面的作用效果較差，導致該種源表現(xiàn)出較低的抗寒性。低溫脅迫下，植物中可溶性蛋白和可溶性糖的增加均有利于提高其抗寒性，可溶性蛋白可以提高細胞液濃度，通過降低滲透勢來保持水壓，可溶性糖能夠提高原生質(zhì)活性，增強細胞液流動性［13，23］。本研究中的可溶性蛋白和可溶性糖質(zhì)量分數(shù)在冬季高于秋季，顯示出植物在低溫脅迫下，都具備提高自身滲透調(diào)節(jié)的能力。但每個種源的可溶性蛋白和可溶性糖相對增幅不同，說明不同種源鵝掌楸對低溫的調(diào)節(jié)和敏感程度有所差異。冬季葉芽中，安徽大別山種源的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)和相對增幅在4個種源中均排名第2，可溶性糖質(zhì)量分數(shù)在4個種源中最高，并且相對增幅最大，可能是該種源抗寒性強的原因之一。冬季，云南勐臘種源的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)最低，季節(jié)間的相對增幅也最小，可能導致該種源的抗寒性較低。

SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的最為重要關(guān)鍵抗氧化酶［24］。本研究中，冬季氣溫較低，4個種源中，安徽大別山種源的SOD活性最高，同時相對增幅也最高，可能會在最大程度上減緩該種源受到低溫傷害的程度，增強該種源植株的抗寒性；云南勐臘種源的SOD活性在4個種源中排列第3位，但是SOD活性的相對增幅最小，可能導致該種源的植株對低溫傷寒的防御能力較差，從而降低該種源的抗寒性。鵝掌楸在基因水平上的抗寒機制如何？不同種源的鵝掌楸是否存在差異表達的抗寒相關(guān)基因？相關(guān)的問題在另一篇文章中通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ζ溥M行研究。今后，在具體評定鵝掌楸種源抗寒性時，還應(yīng)進一步開展人工低溫脅迫實驗，為全面評價其抗寒能力提供可靠的依據(jù)。

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Comprehensive evaluation on cold resistance of Liriodendron chinense from four provenances

LU Chang1,2, LI Bin1,2, LIU Ru3, XIA Liangfang3, ZHU Liang4, LIN Furong1,2, ZHENG Yongqi1,2
（1. Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China；2. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China；3. Subtropical Forestry Experiment Center, Chinese Academy of Forestry, Nangchang 338000, Jiangxi, China；4. Beijing Ming Tombs Forest Farm, Beijing 102200, China）

Abstract:Branches and leaf buds of four Liriodendron chinense provenances were collected both in autumn and winter to measure cold-resistant physiological indicators. Subordinate function analysis was used to evaluate the cold resistance of Liriodendron chinense provenances comprehensively. Cold-resistant physiological indicators of different provenances showed obvious seasonal variation, and had the same trend in the four provenances. Specifically, MDA content, soluble protein content, SOD activity, soluble sugar content, proline content of leaf bud in winter were higher than those in autumn；relative electric conductivity and water content in winter were lower than those in autumn. According to the measurement data of physiological indicators, subordinate function values of four provenances were calculated as the comprehensive evaluation values of cold resistance. The cold-resistant ability of four provenances was sorted as：Dabie shan（0.834）＞Fuyang（0.488）＞Liping（0.286）＞Mengla（0.021）. Correlation analysis showed that relative electric conductivity and water content had significantly negative correlation with the subordinate function value, while proline content had significantpositive correlation with the subordinate function value. Therefore, these indicators can be used as suitable evaluation indicators.［Ch, 6 tab. 24 ref.］

Key Words:plant physiology；Liriodendron chinense；cold resistance；physiology indicator；subordinate function

中圖分類號：S718.43

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）03-0455-07

doi：10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.012

收稿日期：2015-05-28；修回日期：2015-06-08

基金項目：“十二五”國家科學技術(shù)支撐計劃項目（2013BAD01B06）

作者簡介：陸暢，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：luchang0510168@126.com。通信作者：鄭勇奇，研究員，博士，從事林木遺傳育種及遺傳資源保存研究。E-mail：zyq8565@126.com